Содержание к диссертации
Введение
І 2.1. Бактериальные токсины и их классификация 10
2.1.1. Энтеротоксины семейства Enterobacteriaceae в свете современной классификации 13
2.1.2 Распространение в природе 16
2.1.3. LT-энтеротоксины 18
2.1.4. ST-энтеротоксины 20
2.1.5. Шига-токсины 24
2.2. Строение генов токсинообразования 25
2.2.1. Строение генов LT 25
2.2.2. Строение генов ST 28
2.2.3. Регуляция синтеза токсинов на генном уровне 29
2.3. Факторы адгезии 36
2.4. Локализация генов токсинообразования в геноме бактерий... 41
2.4.1. Хромосомная локализация генов токсинообразования 41
2.4.2. Внехромосомная локализация генов токсинообразования 43
2.4.2.1. Плазмиды 43
2.4.2.2. Транспозоны 47
2.4.2.3. Бактериофаги 48
2.5. Генетический обмен 51
2.5.1. Роль внехромосомных элементов в формировании токсического фенотипа и распространении токсикоинфекций 51
2.5.2. Трансформация. 52
2.5.3 Конъюгация 54
2.5.4. Трансдукция 56
3. Материалы и методы 60
3.1. Штаммы бактерий и бактериофагов 60
Используемые реактивы и среды 60
Буферные растворы и среды 61
Выделение плазмид с помощью щелочного лизиса 62
Выделение высокомолекулярной плазмидной ДНК 62
Выделение ДНК модифицированным методом Экхарда 63
Проведение расщепления ДНК рестриктазами 63
Электрофорез ДНК 64
Трансфекция 64
Транспозиция 66
Получение препаратов фагаМ 13 66
Определение титра бактериофагов 67
Конъюгация 68
Спот-тест 69
Экспериментальная часть 70
Определение оптимальных условий выделения плазмидной ДНК 70
Анализ плазмидных профилей изучаемых штаммов... 71
Анализ обнаруженных плазмид на наличие генов токсинообразования 75
Рестрикционный анализ плазмид, кодирующих токсинообразование 78
Определение молекулярной массы плазмид 81
Определение копийности изучаемых плазмид 83
Изучение влияния дозы гена на уровень продукции токсинов .. 90
Изучение возможности переноса генов токсинообразования между различными штаммами Е. сои" 93
Обсуждение результатов 97
Выводы 104
Практические предложения 105
Список использованной литературы 106
Введение к работе
Актуальность темы:
Во многих районах земного шара острые диарейные заболевания до сих пор остаются нерешенной проблемой ветеринарии и медицины. Они являются причиной высокой смертности у людей, сельскохозяйственных животных, в том числе и пушных зверей. При этом большинство вспышек токсикоинфекций обусловлено энтеротоксигенными штаммами Е. coli (ЕТЕС), которые продуцируют токсины, вызывающие диарейный синдром.
В большинстве случаев жертвами токсикоинфекций становятся дети младшего возраста и молодняк сельскохозяйственных животных. По данным ВОЗ, из 1млрд. ежегодно заболевающих детей умирает более 3-х млн.
Серьезную проблему представляют диареи, вызываемые ЕТЕС и в сельском хозяйстве; так даже в хорошо налаженных свиноводческих хозяйствах США от 2,5 до 5% новорожденных поросят погибают от диарейного токсикоза.
В отечественном пушном звероводстве токсикоинфекций являются основной причиной дорегистрационного отхода новорожденных щенков и гибель молодняка в период отсадки.
Многочисленными исследованиями было установлено, что ведущую роль в патогенезе диарейных заболеваний играют так называемые цитотонические токсины: термолабильный (LT) и термостабильные (STI, STII).
Этот факт, по-видимому, явился причиной своеобразного перекоса в их изучении, так как длительное время основное внимание уделялось изучению химической структуры самых токсинов и различных аспектов их взаимодействия с макроорганизмом. Значительно меньше освещены вопросы, связанные с изучением структуры и локализации кодирующих их генов. Первые же работы в этом направлении показали большое сходство как в строении самих токсинов, продуцируемых таксономически отдаленными группами микроорганизмов, так и в первичной структуре их генов (Смирнов, 1984). Было установлено, что в большинстве случаев гены, кодирующие токсинообразование, локализованы на плазмидах -внехромосомных генетических элементах, способных к автономной репликации с варьирующими размерами и числом копий. Однако имеющиеся данные о таких плазмидах носят далеко не полный характер и относятся в основном к плазмидам, изолированным из штаммов, выделенных от людей. Значительно меньше изучены плазмиды, кодирующие токсинообразование в штаммах, ведущих происхождение от сельскохозяйственных животных, и полностью отсутствуют данные о генетических детерминантах токсигенности штаммов, поражающих пушных зверей.
Наблюдаемое в последние 10-15 лет бурное развитие биотехнологии и генной инженерии дает возможность не только изучения, но и использования генетических детерминант токсигенности при создании диагностических и лечебно-профилактических препаратов.
Исходя из вышесказанного, изучение генетических детерминант токсинообразования в штаммах, изолированных из патологического материала, полученного от пушных зверей, представляется весьма актуальными своевременным.
Цель исследования:
Целью нашей работы стало изучение генетических детерминант токсинообразования, их физико-химических и молекулярно-генетических свойств у штаммов эшерихий, изолированных от пушных зверей.
Для этого было необходимо решить следующие задачи:
1. Определить наличие внехромосомных элементов в клетках токсигенных штаммов, изолированных от пушных зверей.
2. Изучить плазмидные профили токсигенных штаммов и локализовать гены, кодирующие токсинообразование.
3. Провести анализ молекулярно-генетических характеристик плазмид, кодирующих токсинообразование, и определить:
а) физическое строение;
б) молекулярную массу;
в) копийность.
4. Установить наличие корреляции между копийностью плазмид и уровнем токсинообразования.
5. Изучить возможность горизонтального переноса генов токсинообразования в популяции энтеробактерий посредством конъюгации.
Объектом исследования являлась коллекция штаммов энтеробактерий, выделенная из патологического материала, полученного от пушных зверей. Была выделена плазмидная ДНК, проведен анализ плазмидных профилей, установлены штаммы, содержащие tox-плазмиды, получены рестрикционные карты, определена устойчивость к антибиотикам, определена молекулярная масса и копийность, определено наличие в геноме F-фактора.
Научная новизна исследования:
В представленной работе впервые изучены молекулярно-генетические особенности детерминант токсинообразования у энтеробактерий, изолированных от пушных зверей в зверохозяйствах РФ.
Данная работа является одной из первых, посвященной изучению внехромосомных факторов инфекционной наследственности токсигенных штаммов Е. coli, выделенных от пушных зверей в зверохозяйствах РФ.
В ходе работы был проведен анализ плазмидных профилей и установлена локализация генов, кодирующих токсинообразование, изучены молекулярно-генетические характеристики плазмид, кодирующих продукцию цитотонических токсинов (физическое строение, молекулярная масса, копийность) и установлена корреляция между коїшйностью и уровнем токсинообразования. Также изучена возможность горизонтального переноса генов токсинообразования в популяции энтеробактерий посредством конъюгации.
Практическая ценность работы:
Результаты диссертационных исследований могут служить методологической основой для создания комплекса диагностических и лечебно-профилактических средств для борьбы с токсикоинфекциями, обусловленными энтеротоксигенными эшерихиями.
Материалы настоящего исследования могут быть использованы при написании методических рекомендаций, а также в лекционном курсе по микробиологии.
Основные положения, которые выносятся на защиту:
Изучение молекулярно-генетических характеристик внехромосомных факторов наследственности, кодирующих токсинообразование у ЕТЕС.
Определение корреляции между коїшйностью токсигенных плазмид и уровнем продукции энтеротоксинов.
Исследование возможности горизонтального переноса генов токсинообразования посредством конъюгации в популяции энтеробактерий.
Строение генов ST
Синтез ST-энтеротоксинов кодируется плазмидами. Благодаря применению технологии клонирования, были получены данные о нуклеотидной последовательности гена, кодирующего STIa штамма В41, выделенного от коров, и аналогичные данные относительно гена est, кодирующего STIb штамма, выделенного от больного ребенка. При сравнении нуклеотидных последовательностей генов est этих штаммов наблюдается их частичная гомология. Секвенирование генов est, кодирующих STII, показало полное отсутствие гомологии с генами est, кодирующими STI, а также позволило определить структуру их регуляторных областей. Последовательность Shine-Dalgarno (SD), обеспечивающая связь тРНК с рибосомами и начало трансляции, имеет вид GAGG и располагается на расстоянии 7 нуклеотидов проксимальнее стартового триплета ATG. Роль -10-последовательности выполняет либо TATAAAG, либо находящаяся на расстоянии 16 нуклеотидов от нее TATAAGT -35-последовательность промотора представлена типичной для прокариотических организмов последовательностью GACTTGACTCAT. На комплементарной нити ДНК гена est (STII) также была обнаружена открытая кодирующая последовательность, содержащая SD (CAGG) и-10-область (ТАТАААА) и кодирующая полипептид из 49 аминокислот. Этот белок, возможно, может играть регуляторную роль в выражении STII (Смирнов, 1983; Lee et al., 1983).
В молекулярно-генетических исследованиях выяснено, что STI- и STII-гены являются транспозонами. В лаборатории S. Falkow впервые было установлено, что ген est, кодирующий STIa в ЕТЕС штамме В41, окружен инвертированными повторами IS1. Новый транспозон, который по существу был первым Tn-элементом, имеющим отношение к патогенности бактерий, был обозначен Тп1681. Фланкирующие последовательности для STII не уточнены (So et al., 1979).
Синтез бактериальных токсинов происходит с использованием тех же механизмов, которые используются для синтеза любого другого, секретируемого или структурного, белка прокариот. В связи с этим следует отметить, что особенностью репликации ДНК у бактерий является наличие особой точки молекулы, которая называется точкой начала (или инсайтом
зоинициации) репликации (огі от англ. «origin»). Трансляция в прокариотических клетках инициируется формилметиониновой тРНК (инициаторной тРНК). При участии белковых факторов элонгации антикодон З -UAC—5 инициаторной тРНКШее специфически связывается с ко доном 5 -AUG-3 mPHK, образующей комплекс с малой рибосомной субъединицей. Связывание мРНК с малой рибосомной субъединицей осуществляется посредством образования нуклеотидных пар между последовательностью примерно из восьми нуклеотидов (последовательность Шайна - Дальгарно), которая расположена вблизи 5 -конца мРНК, и комплементарной 3 -концевой последовательностью рРНК, связанной с малой рибосомной субъединицей. К комплексу fMet-тРНК мРНК-малая рибосомная субъединица присоединяется большая субъединица и образуется инициаторный комплекс. Этап элонгации и терминации у прокариот аналогичен в целом таковому у эукариот. После трансляции многие полипептиды подвергаются модификациям. У большинства из них отщепляется N-концевой метионин, так что концевым остатком становится вторая аминокислота (Глик и др., 2002).
Все процессы, протекающие в бактериальной клетке: образование аминокислот, нуклеотидов и других метаболитов, репликация, транскрипция, трансляция, катаболизм, высвобождение энергии, реакции на внешние воздействия, в том числе продукция токсинов различных групп - требуют участия белков. Однако энергетических ресурсов клетки не хватает для одновременного осуществления транскрипции и трансляции (экспрессии) всех структурных генов. Поэтому постоянно экспрессируются только те гены, которые кодируют белки, поддерживающие основные клеточные функции, а транскрипция остальных генов регулируется. Когда у бактерии возникает потребность в каком-то белке, инициируется экспрессия соответствующего структурного гена (Глик, 2002).
Часто у бактерий белки одного метаболического пути кодируются смежными структурными генами. Оперон, кодирующий более одного белка, обычно находится под контролем единственного промотора, и при его транскрипции образуется длинная молекула тРНК, кодирующая несколько белков. При трансляции такой тРНК, в которой стоп-кодон одной последовательности соседствует со старт-кодоном гена следующего белка, синтезируется набор дискретных белков. В большинстве структурных генов E.coli имеются два сайта связывания РНК-полимеразы: ТАТА-бокс и TTGAC, которые расположены за 10 и 35 нуклеотидов до сайта инициации транскрипции (нуклеотид +1), Обычно от участка между ТАТА-боксом и нуклеотидом +1 во многом зависит, будет ли происходить транскрипция данного оперона. В зависимости от способа регуляции транскрипции оперона этот участок называется оператором или активатором (Глик, 2002).
Транспозиция
Препараты фага tgl 30 для опытов получали путем трехкратных пассажей на соответствующих штаммах-донорах. Для первого и второго пассажей культуры штаммов-доноров выращивали в МПБ, как это описано в предыдущем разделе, после чего инфицировали фагом с множественностью, не превышающей 0,01 - 0,05 фаговых частиц на бактериальную клетку, подращивали еще 3 часа и оставляли в термостате при 37С на ночь. На следующий день к лизатам добавляли 1/50 объема хлороформа и помещали в холодильник. Фаголизаты второго пассажа использовали для получения препаратов для трансфекции.
Для получения препаратов трансфицирующих фагов в высоком титре третий пассаж проводили на плотной среде, используя для этого посев на двухслойный агар. Подрощенную в течение 4-х часов бульонную культуру штамма - донора переносили в пробирки с 4 мл расплавленного и охлажденного до 45-47С 0,5% минимального агара так, чтобы их концентрация находилась в пределах от 2-х до 5x107 клеток на 1мл. Затем в эти же пробирки добавляли фаг второго пассажа из расчета 5000-7000 инфекционных частиц на пробу. Содержимое пробирок тщательно перемешивали и выливали вторым слоем на чашки с МПА. После застывания верхнего слоя чашки помещали в термостат. Через 16-18 часов роста, слившиеся негативные фаговые колонии образовывали так называемый «кружевной» газон. Слой содержащего фаг 0,5% агара собирали в центрифужный стакан, тщательно измельчали и помещали в холодильник на 3-4 часа, после чего центрифугировали при 5000 об/мин в течение 30 мин на холоде. Надосадочную жидкость переносили в пробирку, добавляли 1/50 часть хлороформа и после часовой инкубации вновь центрифугировали в тех же условиях. Полученные таким образом препараты фагов содержали 2х1010 - 1х10п фаговых частиц. В качестве реципиентного штамма использовали TG1-клетки, которые растили в 15 мл LB-среды 5-7 часов на шейкере при 37С, 157 об/мин. Затем в стерильных условиях смешивали 7 мл выросшей культуры col 00 мкл фага Ml 3 (tg!30) (т.е. заражали культуру фагом), а после 12 часов шейкирования добавляли 100 мкл хлороформа.
Ночные бульонные культуры отдельных колоний донора и реципиента разводили 1:20 питательным бульоном и растирали при интенсивном встряхивании 3 часа до достижения ОП=1,0 опт.ед. плотн. при длине волны X = 620 нм (2x10 КОЕ/мл, поздняя экспоненциальная фаза).
Разведения культуры донора растирали на чашках с питательной средой без антибиотика (для подсчета живых клеток) и на чашках с антибиотиками (для подсчета клеток содержащих плазмиду).
В пробирку вносили по 0,15 мл свежей 3-х часовой культуры донора и 0,15 мл реципиента, и доводили объем питательным бульоном до 1 мл для скрещивания в жидкой среде. После инкубации смеси клеток при 37С в течение 1 часа объем смеси доводили питательным бульоном до Змл и серийные разведения смеси растирали на чашках для селекции трансконъюгантов и инкубировали ночь.
Б) Скрещивание Е. coli на плотной среде:
Чашки для постановки скрещивания разливали за 1-2 дня до проведения скрещивания, переворачивали и сушили при 37С в течение 20 мин без крышки.
Готовили свежие 3-х часовые культуры донора и реципиента. 0,3 мл смеси культур донора и реципиента растирали в подготовленной чашке без антибиотиков проволочным шпателем. Чашку сушили без крышки, не переворачивая в течение 5-10 мин. Исследования с помощью светового микроскопа показали, что 0,3 мл смеси для скрещивания (ОП=1 ед. опт. плотн. при Х,=620 нм) является необходимым минимальным объемом, когда каждая клетка контактирует с другой. Чашку инкубировали в течение 1 часа после того, как чашка наполовину высохнет. Чашку накрывали крышкой после полного высыхания.
После инкубации 1 мл питательного бульона наносили на чашку и ресуспендировали клетки, соскребая их проволочным шпателем. Повторяли эту процедуру еще 2 раза и получали около 3 мл взвеси. Смесь энергично встряхивали на Vortex mixer.
Серийные разведения наносили по 0,1 мл на чашки для селекции трансконъюгантов, растирали и инкубировали в течение ночи.
Изучение влияния дозы гена на уровень продукции токсинов
Исходя из имеющихся в нашем распоряжении возможностей для изучения уровня продукции токсинов, мы вынуждены ограничиться двумя методами. Реакцией двойной радиальной диффузной преципитации в агарозном геле по методу Ухтерлони для определения уровня продукции термолабильного токсина, и биопробой на мышах - сосунках для определения термостабильного токсина I типа (STa). Применяемая для определения термостабильного токсина II типа модель с использованием внутригастральной пробы на новорожденных поросятах была нам по понятным причинам недоступна. Поскольку подавляющая часть синтезируемого бактериальной клеткой термолабильного токсина локализована в периплазматическом пространстве, для его определения мы использовали грубые экстракты клеток токсигенных эшерихий, полученные посредством их обработки ультразвуком. В качестве положительного контроля мы использовали рекомбинантный штамм С600, несущий плазмиды pLT701 с клонированным elt опероном, продуцирующий термолабильный токсин человеческого типа. Копийность плазмиды pLT701 определена ранее ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия Ю.Е. Козловским (2002г.) и была равна 56 копиям на клетку. В качестве антигена использовали препараты IgG, полученные путем иммунизации кроликов очищенными препаратами LT.
Всего в этом опыте было изучено 9 клинических изолятов Е. coli, продуцирующих термолабильный токсин, причем копийность плазмид, кодирующих токсинообразование, колебалась в широких пределах от 1 до 20 копий на клетку.
При рассмотрении данных, приведенных в таблице 7, становится очевидной положительная корреляция между количеством плазмид, содержащихся в клетке, и токсичностью. Так у штаммов №№ 39, 111,114, 121, 123, 125, содержащих токсигенные плазмиды в количестве 1-4 копий, токсин обнаруживался лишь в минимальном разведении 1:2. У остальных 3 штаммов, №№ 34, 108 и 134 содержащих токсигенные плазмиды в количестве 7, 11 и 20 копий, токсин обнаруживался в разведении 1:8, 1:16 и 1:32 соответственно. Отсутствие разницы в продукции LT штаммами, содержащими 1, 2 и 4 копии на клетку, взаимосвязано как с недостаточной чувствительностью метода, так и с особенностью роста этих штаммов на жидких питательных средах. Сходная, хотя и не столь выраженная, картина наблюдалась и в случае с STa. Поскольку термостабильные токсины эшерихий относятся к группе так называемых секретируемых белков и практически не обнаруживаются в клеточных лизатах, для определения уровня продукции термостабильного токсина I мы использовали освобожденную от клеток культуральную среду. Из таблицы 7 видно, что увеличение копийности плазмид от 1 до 17 копий на клетку, также приводит к увеличению выделения жидкости в просвет кишечника мышей-сосунков. Однако неоднозначность биологического метода тестирования делает невозможной более точной оценку эффекта дозы гена.
