Содержание к диссертации
Условные обозначения 5
Введение 6
Часть I. Литературный обзор 12
Глава 1. Ферменты, их значение в организме и роль в токсикодинамике ксенобиотиков 12
Глава 2. Методы определения активности ферментов 17
Глава 3. Влияние токсических веществ на ферменты 20
3.1. Фосфорорганические соединения 21
3.2. Синтетические пиретроиды 22
3.3. Соединения тяжелых металлов 23
Глава 4. Современные методы изучения механизмов токсического действия ксенобиотиков 25
Глава 5. Инфузории Tetrahymena pyriformis как перспективный тест-организм для оценки состояния объектов ветеринарно санитарного и экологического контроля 30
Часть П. Собственные исследования 34
Глава 1. Материалы и методы исследований 34
Глава 2. Совершенствование и разработка методик определения удельной каталитической активности ферментов в различных биологических материалах 39
2.1. Разработка методики определения удельной каталитической активности фосфатаз в органах и тканях животных 39
2.2. Разработка методики определения удельной каталитической активности оксидазы в органах и тканях животных 41
2.3. Адаптация методик определения удельной каталитической активности ферментов для работы с культурой инфузорий Tetrahymena pyriformis з
2.3.1. Получение ферментативных препаратов из культуры инфузорий Tetrahymena pyriformis 43
2.3.2. Определение удельной каталитической активности 1-нафтилацетатэстеразы в культуре инфузорий Tetrahymena 44 pyriformis
2.3.3. Определение удельной каталитической активности фосфатаз в культуре инфузорий Tetrahymena pyriformis 45
2.3.4. Определение удельной каталитической активности оксидазы в культуре инфузорий Tetrahymena pyriformis 46
Глава 3. Фоновые уровни удельной каталитической активности ферментов в органах высших животных и культуре инфузорий Tetrahymena pyriformis 48
Глава 4. Влияние токсикантов на ферментативную активность органов и тканей высших животных 52
4.1. Влияние ДДВФ на ферменты высших животных 52
4.1.1. Влияние ДДВФ на ферменты in vitro 52
4.1.2. Влияние ДДВФ на ферментативную активность органов белых мышей 62
4.2. Влияние перметрина на ферменты высших животных 82
4.2.1. Влияние перметрина на ферменты в экспериментах in vitro 82
4.2.2. Влияние перметрина на ферментативную активность органов белых мышей 89
4.3. Влияние свинца ацетата на ферменты высших животных 109
4.3.1. Влияние свинца ацетата на ферменты высших животных in vitro.
4.3.2. Анализ токсического действия свинца ацетата в модельных острых опытах на белых мышах 115
4.3.3. Анализ токсического действия свинца ацетата в хронических экспериментах на белых крысах 132 4.4. Влияние кадмия нитрата на ферменты высших животных 167
4.4.1. Влияние кадмия нитрата на ферменты высших животных in vitro
4.4.2. Анализ токсического действия кадмия нитрата в модельных острых опытах на белых мышах 170
4.4.3. Анализ токсического действия кадмия нитрата в хронических экспериментах на белых крысах 188
Глава 5. Изучение влияния токсикантов на ферментные системы инфу
зорий Tetrahymena pyriformis 222
5.1. Влияние ДДВФ на ферменты инфузорий Tetrahymena pyriformis в экспериментах in vitro и in vivo 222
5.2. Влияние перметрина на ферменты Tetrahymena pyriformis в экспериментах in vitro и in vivo 235
5.3. Влияние свинца ацетата на ферменты Tetrahymena pyriformis в экспериментах in vitro и in vivo 246
5.4. Влияние кадмия нитрата на ферменты Tetrahymena pyriformis в экспериментах in vitro и in vivo 256
Обсуждение результатов 264
Выводы 310
Практические предложения 313
Список использованной литературы 315
Приложение 3
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время происходит достаточно сильное техногенное загрязнение окружающей среды. Различные загрязнители прямо или косвенно оказывают воздействие на организм животных и человека, часто вызывая развитие токсикозов, механизм возникновения которых нередко остается неясным. Кроме того, в процессе научно-технического прогресса разрабатывается большое количество веществ, предназначенных для решения важных практических задач, например, дезинфекции, дезинсекции и т.п. Попадая в организм животных и человека, эти вещества также могут вызывать развитие определенных патологий, поэтому изучение механизма их действия на стадии разработки позволит оценить и прогнозировать возможные последствия их использования, а также выделить наиболее приемлемые диагностические критерии.
Механизм токсического действия большинства ксенобиотиков основан на влиянии на различные ферменты и ферментные группы (Каган Ю.С. и сотр., 1981; Панынина Т., Сасинович Л.М., 1983; Goermg P.L., Klaassen CD., 1983; Shen Y., Sangiah S., 1995). Поэтому изучение действия токсикантов на эти органические соединения может дать достаточно обширный и ценный материал.
При работе с различными токсикантами исследователи часто сталкиваются с такими явлениями, как ингибирование и активация ферментативной активности, которые часто остаются только констатированными без анализа причин их возникновения и характера проявления. При изучении изменений активности ферментов под влиянием различных токсикантов большую помощь может оказать использование методов ферментативной кинетики. Однако использование традиционных подходов в этой области знаний часто приводит к путанице понятий и определений, поскольку до недавнего времени не было достаточно четкой дифференциации в разновидностях этих явлений (Келети Т., 1990; Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф., 1982; Мусил Я., Новакова О., Кунц К. 1984). В настоящее время достаточно интересным подходом является разработанный Крупянко В.И. (1986) метод параметрической классификации типов ферментативных реакций, который может представлять определенную ценность при анализе ток-сикодинамики различных ксенобиотиков. Однако использование названной методики не отработано для применения в токсикологической практике, особенно для прогнозирования и предварительной оценки влияния ксенобиотиков на организм животных.
Следует также учесть тот факт, что методы определения ферментативной активности предназначены преимущественно для биологических жидкостей (Меньшиков В.В., 1987; Налетов Е.А., Егорова Т.А. 1980; Rewyler A. et al., 1989; Whittacker М., 1986). Исследование активности ферментов в отдельных органах и количественное представление данных имеет определенные трудности, связанные с методологией их анализа, т.к. конечный экстракт, в большинстве случаев, должен быть бесцветным и прозрачным для устранения артефактов, поэтому отсутствуют достаточно простые, экспрессные и селективные методики, позволяющие вести определение в любых биоматериалах. В качестве метода, позволяющего преодолеть эти недостатки, может быть использована хроматография. Однако она не нашла широкого применения в лабораторной клинической практике при определении ферментативной активности.
Следует также отметить, что к недостаткам традиционно используемых методов ферментативного анализа можно отнести отсутствие использования системы единиц измерения ферментативной активности. В большинстве случаев используемые единицы измерения зависят от метода анализа, что затрудняет сравнение и сопоставление результатов разных авторов.
В настоящее время все большее распространение получают методы биотестирования. Биотестирование объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля дает возможность оценивать степень их безопасности. Тест-организмы отличаются достаточно высокой чувствительностью к широкому спектру ксенобиотиков естественного и антропогенного происхождения. Оценка сопоставимости результатов, полученных с использованием биотестов на основе простейших, с результатами, полученными на высших животных, позволит существенно расширить сферу практического применения биотестовых методов, повысить их информативность и производительность, тем самым резко сократив использование в экспериментах высших животных, что важно как с экономической, так и с этической точек зрения (Долгов В.А., 1992).
Названные методологические вопросы требуют своего разрешения и проведения дальнейших исследований.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилась разработка биотестов на основе ферментных систем для оценки токсического действия ксенобиотиков на объекты ветеринарно-санитарного и экологического контроля.
В задачи исследований входило:
1. Совершенствование и разработка методов определения ферментативной активности в различных биологических объектах (органы и ткани лабораторных животных, сыворотка крови лошади, культура инфузорий).
2. Установление фонового уровня ферментативной активности аце-тилхолинэетеразы (АХЭ), бутирилхолинэстеразы (БуХЭ), 1-нафтилацетатэстеразы (1-НАЭ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и оксидазы в различных биологических объектах.
3. Проведение сравнительного анализа влияния модельных токсикантов - ДДВФ, перметрина, свинца ацетата, кадмия нитрата - на ферментные системы различных тест-объектов.
4. Проведение сравнительного анализа кинетики ферментативных реакций в органах теплокровных животных для подбора оптимальных ферментных тестов диагностики токсикозов животных
5. Определение диагностической ценности исследованных ферментов в качестве критериев токсического действия экотоксикантов.
6. Изучение влияния модельных токсикантов на ферментные системы инфузорий Tetrahymenapyrifomiis.
7. Разработка методических подходов к использованию биотестов на основе ферментных систем инфузорий для оценки токсичности объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля. Научная новизна результатов исследований состоит в следующем:
Разработаны методики прямого определения удельной каталитической активности (УКА) ферментов в биологических субстратах, которые обеспечивают индикацию удельной каталитической ферментов в органах и тканях животных при минимальной детектируемой чувствительности для фосфатаз 2 мккат/кг и для оксидаз 0,95 мккат/кг, что значительно превышает чувствительность существующих в настоящее время методов и снимает ограничения в выборе объектов исследования.
Установлен фоновый уровень удельной каталитической активности (УКА) ферментов - ацетилхолинэстеразы (АХЭ), бутирилхолинэстеразы (БуХЭ), 1-нафтилацетатэстеразы (1-НАЭ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и оксидазы - в органах и тканях лабораторных животных. Проведено сравнение уровня активности различных ферментов в органах животных. Установлено, что в органах и тканях животных наибольшей УКА обладает 1-НАЭ, максимальный уровень ее активности регистрировался в печени и почках. Фоновый уровень УКА остальных ферментов был значительно ниже, при этом максимальная УКА АХЭ регистрировалась в ткани головного мозга, БуХЭ - в печени, ЩФ - в ткани головного мозга и почках, оксидазы - в почках. Наименьшей ферментативной активностью обладала мышечная ткань, В культуре клеток инфузорий Т. pyriformis наибольшей УКА обладали ЩФ и 1-НАЭ.
Изучено влияние различных токсикантов (ДДВФ, перметрин, свинца ацетат, кадмия нитрат) на изменение ферментативной активности в органах лабораторных животных. Установлено, что эти изменения зависят от типа токсического соединения, его дозы, топографии и типа фермента.
Изучено изменение кинетики ферментативных реакций под влиянием названных токсикантов. Установлено, что разные токсиканты не одинаково влияют на изменение кинетических показателей ферментативных реакций. Эти изменения зависят от типа токсикантов и фермента, топографии фермента.
Определена диагностическая ценность исследованных ферментов для диагностики токсикозов, вызываемых исследованными ксенобиотиками. Установлено, что при диагностике токсикозов, вызываемых фосфорорганическими соединениями, наиболее показательно изменение УКА 1-НАЭ, перметрин вызывал наибольшее снижение УКА ЩФ и оксидазы, соли тяжелых металлов вызывали снижение УКА ЩФ во всех органах, кроме селезенки, где УКА этих ферментов дозозависимо возрастала.
Разработаны методические подходы к изучению активности ферментов в культуре клеток Т. pyriformis. Отработаны условия подготовки культуры для исследования, получения ферментного препарата из культуры, подобраны условия определения УКА таких ферментов, как АХЭ, БуХЭ, 1-НАЭ, ЩФ, оксидаза.
Изучено влияние токсикантов на изменение ферментативной активности в культуре клеток Т. pyriformis. Показано сходство в изменении УКА и кинетики ферментативных реакций у инфузорий и высших животных. Установлено, что под влиянием изученных токсикантов происходило изменение ферментативной активности в культуре клеток. При этом под влиянием ДДВФ наиболее выраженным было снижение УКА 1-НАЭ, перметрин вызывал наибольшее снижение УКА оксидазы, соли тяжелых металлов вызывали снижение УКА ЩФ.
Разработаны методические подходы к использованию биотестов на основе ферментных систем инфузорий для оценки токсичности объектов ветеринар-но-санитарного и экологического контроля.
Практическая ценность и реализация результатов. На основании результатов исследований разработаны:
"Методика определения удельной каталитической активности фосфатаз в биологических субстратах" (утверждена Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г.);
"Методика определения удельной каталитической активности оксидазы в биологических субстратах" (утверждена Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г).
Материалы диссертационной работы вошли в следующие методические рекомендации и указания: "Методические рекомендации по диагностике токсикозов кур, вызываемых фосфорорганическими соединениям" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1994 г.);
"Методические рекомендации по использованию биологических тестов для индикации токсичных элементов в объектах ветеринарного надзора" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997 г);
"Методические рекомендации по определению ферментативной активности в культуре клеток Tetrahymena pyriformis при биотестировании" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 10.03.2002).
"Методические рекомендации по определению удельной каталитической активности холинэстераз в биоматериале при проведении токсикологических исследований" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 10.03.2002);
"Методические указания по использованию инфузорий Tetrahymena pyriformis в качестве тест-культуры в приборе "Ъиотестер-2" (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 16.10.2000, № 13-7-2/2157);
"Методические указания по ускоренному определению токсичности продуктов животноводства и кормов" (утверждены Департаментом ветеринарии МСХ РФ, 16.10.2000, № 13-7-2/2156);
"Методические указания по определению остатков перметрина в биоматериале с использованием твердофазной экстракции" (представлены на утверждение в Департамент ветеринарии МСХ РФ).
Материалы диссертационной работы использованы при составлении "Наставления по применению эктоцида в борьбе с эктопаразитами птиц в помещениях", утвержденного 23.04.94 Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода Российской федерации, № 19-4-2/51, per. № 10.07.122-94 ОВФП.
Основные положения, выносимые на защиту.
• методы определения удельной каталитической активности ферментов в различных биологических субстратах; • результаты изучения фонового уровня активности ферментов - аце-тилхолинэстеразы, бутирилхолинэстеразы, 1-нафтилацетатэстеразы, щелочной фосфатазы и оксидазы - в органах лабораторных животных и культуре Tetrahymena pyriformis;
• результаты изучения влияния различных токсикантов (ДДВФ, пер-метрина, нитрата кадмия и ацетата свинца) на изменение ферментативной активности биотестов различного трофического уровня;
• результаты анализа изменения кинетических показателей в изучаемых биотестах под влиянием названных токсикантов;
• результаты анализа механизмов токсического действия ксенобиотиков с учетом изменения кинетики ферментативных реакций для оценки возможных диагностических тестов при токсикозах, вызываемых исследуемыми ксенобиотиками;
• результаты сравнительной оценки диагностической ценности исследуемых ферментов при изучении токсикозов, вызываемых токсикантами различных групп, на биотесты разных трофических уровней;
• методические подходы к использованию биотестов на основе ферментных систем инфузорий для оценки токсичности объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля.
Похожие диссертации на Биотесты на основе ферментных систем для оценки токсического действия ксенобиотиков на объекты ветеринарно-санитарного и экологического контроля
