Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Биологически активные вещества, как факторы повышения естественной резистентности 10
1.2. Источники биологически активных веществ и способы их получения 24
1.3. Естественная резистентность организма животных, пути ее повышения и современные представления о стратегии иммунокоррекции 37
2. Собственные исследования 47
2.1. Материалы и методы исследований 47
2.2. Получение препарата бактоцеллолактин 64
2.3. Получение препарата гистоген 70
2.4. Получение препарата грамин 73
2.5. Получение препарата биоинфузин 84
2.6. Токсикологическая оценка бактоцеллолактина, гистогена, граминаи биоинфузина 91
2.7 Фармакологические свойства бактоцеллолактина, гистогена, граминаи биоинфузина 112
2.7.1. Влияние препаратов на клеточные и гуморальные показатели неспецифической резистентности белых мышей и телят в возрасте до 1 месяца 112
2.7.2 Влияние препаратов на иммунобиологическую реактивность лабораторных животных и телят 3-х месячного возраста 131
2.7.3. Стабильность и биологическая активность препаратов 137
2.8. Терапевтическая эффективность препаратов 146
2.8.1. Эффективность при желудочно-кишечных заболеваниях 146
2.8.2. Эффективность при респираторных болезнях 162
2.9. Влияние бактоцеллолактина, биоинфузина, гистогена и грамина на качество мяса 175
3. Производственные испытания бактоцеллолактина, грамина, гистогена и биоинфузина 180
4. Обсуждение результатов 186
5. Выводы 204
6. Практические предложения 209
7. Список литературы 211
8. Приложения 247
- Источники биологически активных веществ и способы их получения
- Получение препарата бактоцеллолактин
- Влияние препаратов на клеточные и гуморальные показатели неспецифической резистентности белых мышей и телят в возрасте до 1 месяца
- Влияние бактоцеллолактина, биоинфузина, гистогена и грамина на качество мяса
Источники биологически активных веществ и способы их получения
Биологически активные вещества (БАВ) - многочисленная и разнообразная по своему происхождению, физико-химическим, физиологическим свойствам и влиянию на организм животных группа препаратов и кормовых добавок. К ним относятся: препараты синтетических аминокислот (лизин, метионин, триптофан); жирорастворимые витамины (каротин, А, Д, Е, К); водорастворимые витамины (Bi-Bi2, С, Н, F, U); соли дефицитных микроэлементов (Fe, Си, Со, Zn, Mn, Se, Mo), ферментные препараты (амилосубтилин, протосубтилин, целловиридин, пектофоэтидин, лизоцим); антиоксиданты (каротиноиды, эток-сихин, дилудин, сантохин, лецитин, ксонтофил); кормовые антибиотики (биомицин, бацитрацин, тилозин, фрадизин, кормогризин); гормональные препараты (эстрогены, андрогены, кортикостероиды); тканевые препараты (тимоген, спле-невит, авиамин); вакцины и сыворотки, фитопрепараты и пробиотики (17, 18, 19, 20,76, 77, 78, 79, 80, 82).
Для большинства из названных соединений характерно активное влияние на естественную резистентность, обмен веществ и как следствие, повышение сохранности молодняка, продуктивности животных и оптимизация воспроизводительных функций.
Создание пробиотиков - новое и перспективное направление исследований. Препараты пробиотиков производятся на основе, как моновалентных (состоящих из одного вида мироорганизмов), так и поливалентных компонентов, состоящих из нескольких видов бактерий. Среди них можно назвать румено-лакт, лакгобиф, бифидобактерин, целлобактерин, лактоамиловорин, максилин, стрептофагин, энтероцид, стрептобифид, лактомикс (14,15,16, 89,190, 191).
Принцип получения пробиотиков основан на выделении из естественных источников штаммов микроорганизмов с хозяйственно-полезными свойствами, либо создание их методом генной инженерии (52, 340).
В дальнейшем один или несколько штаммов микроорганизмов культивируются на соответствующих питательных средах, где идет накопление их биомассы. После этого готовят препараты, которые помимо живых микроорганизмов могут содержать различные биологически активные вещества, синтезируемые микробами в процессе жизнедеятельности (3, 4,14,15,33,135,202, 203).
Эффективность пробиотиков зависит от целого ряда условий - они должны быть стабильны при хранении, не разрушаться в желудочном соке, не содержать патогенных микроорганизмов, обладать устойчивостью к прессованию, измельчению и сырости, сочетать кислотоустойчивость с продуцированнием достаточного количества кислот, обладающих бактерицидным действием (310, 311).
При изготовлении пробиотиков используют также и генноинженерные методы. Особое внимание, в этом плане, заслуживает препарат субалин, разработанный в ТНЦ ВБ "Вектор". Субалин - лечебно-профилактический препарат на основе живых рекомбинантных бактерий В. subtilis, продуцирующих а2 -интерферон, что позволяет использовать его как противовирусный препарат. Субалин фактически является уникальным препаратом, имеющим немногочисленные аналоги (224, 225, 226 250).
Технология получения субалина проста в исполнении, не требует дорогостоящих материалов и сред, позволяет выпускать препарат в порошковой, таб-летированной или ампулированной формах (250). Существующие аналоги субалина, как отечественные (споробактерин, биоспорин), так и зарубежные (цере-обиоген - Китай, флонивин - Франция, бактисубтил - Югославия), являются высокоэффективными антибактериальными и корректирующими микрофлору кишечника препаратами,но не обладают противовирусным действием.
В настоящее время открыт новый класс биологически активных веществ, получивший название биомосы. Биомосы представляют собой металлокомплек-сы-поликонденсаты, которые при введении в организм оказывают биостимули-рующее влияние. Биомосы широко распространены в природе - в верхних слоях почвы, морской воды и в живых микроорганизмах. Однако, их можно получить и синтетическим путем. Синтетические биомосы это многомерные кластеры переменного состава, в которых ионы металлов и органические компоненты включены в поликислотную матрицу. Кроме ионов металлов в структуру био-мосов могут включаться К, СА, Вог, Р, но если нет хотя бы одного переходного металла, данные вещества не обладают биологической активностью { 37, ПО ).
В один ряд с биомосами можно поставить и препараты, получаемые из торфа - гумат натрия и биостим, успешно зарекомендовавшими себя при терапии и профилактике желудочно-кишечных и респираторных заболеваний животных и птицы, а также при интенсификации их откорма.(110, 255)
Еще одним источником для получения иммуностимулирующих препаратов стали продукты метаболизма некоторых микроорганизмов. Так, например, в научно-внедренческом центре Игнатова созданы препараты достим и мастим, основой для получения которых послужили некоторые виды дрожжей (217, 250).
Из культуры гриба Str. griseus получен биологически активный препарат, ПЭФАГ, представляющий собой комплекс липидов этого же продукта, обладающий высокой биологической активностью (213,214).
Некоторыми исследователями установлено влияние полисахаридного комплекса, выделенного из актиномицетов на образование антител в организме животных и повышение их естественной резистентности к инфекционным заболеваниям (251,262).
Одним из самых эффективных инструментов помогающих организму мобилизовать свои защитные резервы против вирусной инфекции является интерферон. Интерферон бывает эндогенный (образуемый в собственном организме) и экзогенный (введенный в организм). Процесс получения интерферона в лабораторных условиях сопряжен с определенными трудностями, связанными с наработкой интерферона. Интерфероны обладают видовой специфичностью - полученные в клетках одного вида животных, они мало эффективны для другого вида. Первым препаратом интерферона, примененным в терапевтических целях стал лейкоцитарный интерферон человека, для получения которого использовали клеточную культуру лимфобластов человека (12).
Первые образцы препаратов интерферона содержали значительное количество примесей, но в последние годы технология получения интерферонов стала значительно совершенней. Ученым удалось получить препараты реком-бинантного а-интерферона (реаферон, интрон), отличающиеся от природного интерферона содержанием, вместо 12 и более структурно близких подтипов а-интерферона, только одного основного подтипа интерферона ос-2 (308, 326).
Высокоэффективными иммуностимуляторами признаны во всем мире биологически активные вещества, чаще полипептидной природы, получаемые из тканей органов животных. Основоположниками этого направления в науке явились русские ученые Тушнов М.П., Филатов В.П., Калашник И.А. Технологические принципы приготовления тканевых препаратов, разработанные вышеназванными авторами, легли в основу современной биотехнологии получения этих препаратов. В настоящее время, фармакологические препараты получены практически из всех органов и тканей, однако препараты, обладающие наиболее четко выраженным иммунотропным действием, выделены из тимуса (150,164).
Предполагают, что тимус продуцирует несколько гуморальных факторов, влияющих на иммунокомпетентную систему (352). Наиболее изученным является, выделенный из тимуса, высокоочищенный фактор-тимозин, представляющий собой полипептид с молекулярным весом около 12000 дальтон ( 320 ).
Кроме того, отечественными учеными Морозовым В.Г., Хавинсоном В.Х., Писаревым О.А. выделен из свежих тимусов телят комплекс полипептидов, состоящий из 3-х фракций, обладающий иммуностимулирующим действием. Полученный из них препарат получил название тимарин (185).
Получение препарата бактоцеллолактин
При разработке препарата бактоцеллолактин (БЦЛ) главной задачей явилось получение пробиотического препарата широкого спектра действия, состоящего из нескольких штаммов микроорганизмов - синергистов со стабильными антагонистическими свойствами и максимальным, для жидкой формы, сроком хранения.
При создании препарата необходимо было выделить такие виды микроорганизмов, которые обладая высокой степенью антагонистической активности к патогенной микрофлоре оставались, при этом, безвредными для животных.
Для решения поставленной задачи исследовались культуры следующих видов микроорганизмов: Lactobacillus (L) plantarum, Ruminococcus (R) albus, Bacillus (B) subtilis. Штамм L.plantarum был выделен в областной клинической больнице г. Кирова из влагалища здоровой женщины с I степенью чистоты влагалищного секрета Варгановым А.И. и Опекуновым К.А. в 1978 г. Данный микроорганизм входит в состав препарата пробиотика биосан и поддерживается в качестве музейного штамма в лаборатории ветбиотехнологии НИИСХ Северо-востока и ВГНКИ ветпрепаратов. R.albus-85 и B.subtilis-91 выделены из содержимого рубца 5-месячных бычков, взятого при помощи носопищеводного зонда. Перечисленные штаммы депонированы в НИИ микробиологии МО РФ и переданы для депонирования в ВГНКИ ветпрепаратов.
Идентификацию штамма L. plantarum (Киров-1) проводил профессор Тартуского университета Ленцнер А.А., а штаммов R.albus-85 и B.subtilis-91 сотрудники НИИ микробиологии Министерства Обороны России Еременко Ю. и Ежов А.
В результате установлено, что L. plantarum полиморфная, грамположи-тельная палочка - встречаются как длинные, так и короткие (наподобие кокков) формы. Располагается отдельными микробами, скоплениями, парами или в цепочку. Спор и капсул не образует, неподвижна, величина - 9,5 х 1,2 микрон.
На плотных питательных средах МПБ, МРС-1 образует колонии 1-2 мм диаметром, куполообразные, гладкие, непрозрачные, бежевые. Расщепляет глюкозу, без образования газа, сорбит, целлобиозу, галактозу, мальтозу, сахарозу, маннозу, лактозу, салицин, маннит и гликоген, но не ферментирует рамнозу. При ферментации образует кислоту и зерна воліютина.
Проявляет хорошо выраженную антагонистическую активность к кишечной палочке, возбудителю дизентерии, стафило - и стрептококкам (Таблица 2.1).
Микроорганизм B.subtilis-91, представляет собой грамположительные прямые палочки с закругленными концами, расположенные беспорядочными скоплениями. На плотных питательных средах МПА, перевар Хоттингера образует колонии 1-2 мм диаметром, шероховатой матовой поверхностью, приподнятые над поверхностью агара, с волнистыми краями, вязкой консистенции, гомогенные в проходящем свете.
Ферментирует с образованием кислоты глюкозу, глицерин, мальтозу, ксилозу, маннит. Расщепляет крахмал, восстанавливает нитраты. Не ферментирует сахарозу, лактозу, сорбит, рамнозу, дульцит, эскулин, галактозу. Проявляет хорошо выраженную антагонистическую активность по отношению к стафилококку, шигеллам, кишечной палочке М-17, не оказывает антимикробного действия на возбудителя протея и кишечную палочку из штамма-157 (Таблица 2.1.).
Выделенный из рубца R.aIbus-85, относится к микроорганизмам-целлюлозолитикам, частым обитателем рубца жвачных животных (Лаптев Г.Ю., 1995). Представляет собой грамположительные, овоидные. слегка удлиненные клетки со сферическими концами, расположенные одиночно или короткими цепочками. Формирует на плотной питательной среде Хоттингера колонии размером до 0,5 мм в диаметре, выпуклые, с ровными краями, гомогенные, прозрачнее, слизистые. К 72 часам выращивания морфология колоний менялась, увеличиваясь в размере до 3-4 мм, края становились волнистыми, поверхность шероховатой с вогнутой серединой, консистенция вязкой. Прозрачность и гомогенные свойства не изменялись.
Штамм ферментирует с образованием кислоты глюкозу, глицерин, мальтозу, ксилозу, маннит. Расщепляет крахмал, не восстанавливает нитраты. Не расщепляет сахарозу, лактозу, сорбит, рамнозу, дульцит, эскулин, галактозу. Проявляет хорошо выраженные антагонистические свойства к пшгеллам, протею, стафилококкам, кишечной палочке (Таблица 2.1).
Результаты, представленные в таблице 2.1. показывают, что в целом микроорганизмы препарата БЦЛ обладают высокой антагонистической активностью в отношении испытуемых патогенных тест-штаммов бактерий.
В основу технологического процесса получения препарата БЦЛ легли технические решения получения препаратов лактобактерин (Руководство по вакцинному и сывороточному делу, 1978) и биосан (ТУ 10.07.067-88).
Для получения пробиотика БЦЛ приготавливали чистые культуры микроорганизмов B.subtilis-91, R. albus-85, L.plantarum. Для этого каждую культуру выращивали в термостате при Т=-37С на скошенном мясо-пептонном агаре с добавлением 1 % глюкозы.
Для культивирования микроорганизмов готовили соево-печеночную среду, которая состоит из трех частей соевого гидролизата и одной части печеночного бульона. Соевый гидролизат приготавливали следующим образом: 80 г соевых шротов заливали двумя литрами водопроводной воды, добавляли 3 % соляной кислоты с удельным весом 1,19, автоклавировали при 127С и 1,5 атм в течение трех часов. После охлаждения массу фильтровали через вату, а затем через бумажный фильтр с нанесенным на него активированным углем. Добавляли едкий натр до достижения рН=6,0 и буфер Кг НРО4 - 0,18 % и КН2РО4 -0,8%.
Печеночный бульон готовили общепринятым способом: 0,5 кг печени крупного рогатого скота нарезали кусками не более 5x5x5 см, помещали в эмалированную кастрюлю, заливали одним литром воды и кипятили 1 час, бульон охлаждали, фильтровали через вату, добавляли едкий натр до достижения рН=6,0. Объединяли 1,5 литра соевого гидролизата и 0,5 литра печеночного бульона, вносили 0,5 % - NaCl и 2 % глюкозы, что составляет 10 г и 40 г соответственно, разливали во флаконы емкостью 200 мл и автоклавировали 30 мин. при 0,5 атм.
Соево-печеночную среду охлаждали до 35-38С и вносили чистые культуры микроорганизмов каждую в отдельный флакон бактериологической петлей (один соскоб с МПА на один флакон). Культивировали в термостате при Т=37С±1 в течение 72 часов. Концентрация микроорганизмов после выращивания в каждом случае составляла не менее 2,5 млрд. в 1 мл. Культуральные жидкости, содержащие биомассу В.subtilis-91, R. albus-85, L.plantarum смешивали в соотношении 1:1:1, 2:1:3, 1:1:2 ,а также проводили совместное культивирование штаммов. Оптимальным было определено соотношение микроорганизмов 1:1:1, при котором в течение 3 мес. концентрации составляющих препарат микробов отличались не значительно.
При хранении полученного препарата БЦЛ происходило изменение концентрации микроорганизмов в нем, поскольку они обладали разными свойствами, в частности - скоростью роста. Изменение концентрации микроорганизмов в зависимости от срока хранения (при Т = 0+5С) представлено на рисунке 2.
Влияние препаратов на клеточные и гуморальные показатели неспецифической резистентности белых мышей и телят в возрасте до 1 месяца
Как известно, новорожденные животные обладают слабой устойчивостью, либо не обладают ей совсем к большинству инфекционных болезней.
Это связано с тем, что при рождении у них отсутствуют в крови иммуноглобулины - основной фактор защиты в этот период. Состояние иммунологической незащищенности изменяется только после потребления молозива, содержащего высокий уровень иммуноглобулинов и иммунокомпетентных клеток.
Как указывают Федоров Ю.Н., 1996, Плященко СИ., Сидоров В.Г., 1979 уровень иммуноглобулинов в молозиве зависит от состояния иммунного статуса коров. В ранний постнатальный период падеж телят составляет до 55 % на первую неделю жизни и еще 21 % на вторую, при этом основными причинами смерти становятся желудочно-кишечные и респираторные болезни (201, 259). Причем, при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят наряду с системной защитой организма важное значение имеет местный иммунитет, предотвращающий адгезию энтеропатогенов к ворсинкам слизистой оболочки кишечника.
Перед постановкой экспериментов подбирали телят-аналогов в возрасте до 1 месяца. У животных определяли клицико-физиологический статус. В результате установлено, что температура тела телят, как в опытных, так и в контрольных группах оставалась в пределах физиологической нормы (38,95 и 38,7 С соответственно). Число ударов пульса в 1 минуту составляло 63,0±2,0 в опыте и 65,0±5,0 в контроле. Частота дыхания в 1 минуту в опытных и в контрольной группе находилась на уровне 18,0±2,2.
При разработке препарата БЦЛ преследовалась цель - создать препарат широкого спектра действия с высокой терапевтической эффективностью, в том числе для повышения неспецифической резистентности организма у новорожденных телят. Первоначально влияние БЦЛ на показатели неспецифической резистентности исследовали на белых мышах, распределенных по 10 голов в каждой группе. Мышам 3 дня подряд перорально, в дозах 0,01; 0,025 и 0,05 мл/г массы тела, с помощью зонда, вводили БЦЛ, а контрольным животным в объеме 1,0 мл физраствор. Кровь исследовали перед началом и по окончании опыта на общий белок и его фракции, бактерицидную, лизоцимную и фагоцитарную активность.
Новорожденным телятам, распределенным на три группы (по 30 голов в каждой группе), препарат БЦЛ применяли методом выпаивания по 5, 10 и 15 мл, один раз в сутки перед кормлением в течение 3-х дней, начиная введение препарата через 6 часов после рождения. В качестве контроля использовали аналогичных животных, которым не вводили препарат. В течение первых 6-ти часов после рождения всем телятам выпаивалось молозиво до 2-2,5 л на голову. Взятие крови для исследования на эритроциты, лейкоциты, лейкоформулу, содержание гемоглобина, СОЭ, бактерицидную, лизоцимную, фагоцитарную активность, НСТ-тест, фракционный состав белка сыворотки крови осуществляли в первые сутки после рождения теленка и на следующий день после прекращения дачи БЦЛ.
Анализируя влияние БЦЛ на исследуемые показатели крови белых мышей следует отметить, что достоверное увеличение содержания гаммагло-булинов в 1,56 раза, а также бактерицидной активности в 1,3, фагоцитарной активности в 1,5 и лизоцимной активности в 1,7 раза (Р 0,05) наблюдались от дозы 0,01 мл/г.
Для телят оптимальной оказалась доза 10 мл (0,3 мл/кг массы тела), которая вызывала достоверные изменения (Р 0,05) по таким показателям как концентрация гемоглобина, содержание базофилов, общего белка, альбуминов, бета- и гаммаглобулиновых фракций белка, бактерицидной и фагоцитарной активности.
Причем, через 72 часа после рождения эти показатели увеличивались, в 1,16 и 1,5 раза в опытной группе. У телят отмечалась оптимизация общего состояния, температуры, пульса и дыхания. Сохранность телят в этой группе оказалась на 20% выше, чем в контроле.
Результаты представлены в таблицах 2.16. и 2.17.
Проведено сравнительное исследование препаратов грамин и известно-о препарата тимоген на организм белых мышей и телят.
Белым мышам грамин вводили внутримышечно, ежедневного, на про-яжении 5 дней в дозах- 0,5; 1,0 и 5,0 мг/кг, а тимогена в дозе- 0,005 мг/кг іассьі тела. В качестве контроля использовали интактных животных. В каж-юй группе находилось по 10 мышей. Исследования крови проводили на обпий белок и его фракции, фагоцитарную, бактерицидную и лизоцимную ак-ивность крови на 1-й, 5-й, 10-й день эксперимента.
Оптимальные результаты исследуемых показателей отмечали от дозы рамина 5,0 мг/кг на 5 и 10 сутки после окончания инъекций. У белых мышей габлюдали повышение фагоцитарной в 1,2, лизоцимной в 1,5 и бактерицид-юй активности в 1,3 раза в сравнении с контролем. После введения тимогена гсследуемые показатели увеличивались В 1,12 - 1,3 раза в сравнении с кон-гролем.
Установлено, что общий белок возрастает после применения грамина в і ,42, а тимогена в 1,52 раза, альфа-глобулины снижаются после влияния Гранина в 1,46 и повышаются от действия тимогена в 1,39 раза, бета-глобулины їнижаются в 1,53 после применения грамина ив 1,39 раза отиньекцийтимогена, гамма-глобулины увеличивались в 1,53 и 1,39 раза после влияния грачина и гистогена соответственно. В контрольной группе интактных животных достоверных изменений по исследуемым показателям не отмечалось.
Препарат грамин вводился новорожденным телятам внутримышечно в юзах 0,4; 1,0 и 5,0 мг/кг массы пятикратно с интервалом 24 ч. В качестве контроля использовали интактных животных и животных, которым в эти же ши вводили тимоген. В каждой группе было по 30 телят у которых на 1-е, 5-з и 10-е сутки брали кровь для исследований. Наблюдения за клиническим зостоянием вели на протяжении 14 дней после окончания применения грамина.
Анализ полученных результатов показал, что грамин, применяемый телятам в первые 10 дней жизни в дозе 1 мг/кг массы тела достоверно (Р 0,05) изменял бактерицидную, лизоцимную, фагоцитарную активность крови и функциональную активность нейтрофиллов в сторону увеличения в 1,2-1,6 раза только к 10 дню наблюдений по сравнению с контролем (интактные), а также увеличивал содержание юных и палочкоядерных нейтрофиллов, лимфоцитов и моноцитов (Р 0,05). Результаты представлены в таблицах 2.18 и 2.19. При этом сохранность молодняка возрастала незначительно - в сравнении с тимогеном на 7 %, с группой интактных животных на 13,3 %. У телят отмечалась оптимизация общего состояния, температуры, пульса и дыхания
Влияние гистогена на показатели неспецифической резистентности изучали на белых мышах и телятах. В опытах на белых мышах продолжительностью 30 дней гистоген вводили подкожно в дозах 0,5; 1,0 и 5,0 мг/кг однократно, 5-кратно и 1 раз в 7 дней. Параллельно ставили контроль на ти-моген и интактных. В каждой группе было по 10 мышей. По окончании опыта получены следующие результаты. Однократная инъекция гистогена в дозе 1,0 мг/кг не достоверно (Р 0,05) изменяла исследуемые показатели, тогда как доза 1,0 мг/кг, введенная 1 раз в 7 дней и введенная ежедневно, пятикратно вызывали достоверные изменения в сравнении с контролем (Р 0,05), характеризующиеся повышением общего белка и гамма-глобулиновой фракции белка в сыворотке крови соответственно на 16 и 28 %, а также лизоцимной, бактерицидной и фагоцитарной активности в 1,2-1,5 раза. Аналогичные показатели после влияния тимогена оказались на 5-10 % ниже.
Препарат гистоген был испытан на новорожденных телятах по схеме аналогичной испытанию грамина. Гистоген вводили подкожно в дозах 0,5; 1,0 и 5,0 мг/кг, один раз в день, с интервалом 24 часа пятикратно. Наблюдения за клиническим состоянием вели в течение 14 дней, кровь брали на 1-е, 5-е и 10-е сутки. В качестве контроля использовали аналогичных телят обработанных тимогеном и интактных животных. Опыт проведен при количестве животных в группах равном 30. Оптимальной по действию на исследуемые показатели определена доза 1 мг/кг. Результаты анализов крови на гуморальные и клеточные показатели приведены в таблицах 2.20. и 2.21.
Влияние бактоцеллолактина, биоинфузина, гистогена и грамина на качество мяса
Опыт был поставлен на бычках, 4-6 мес. возраста, находящихся на откорме. За 10 дней до ожидаемого убоя животных распределяли на 4 опытные и одну контрольную группы по 5 голов в каждой.
В 1-ой группе животным выпаивали бактоцеллолакцин в дозе 20 мл.
Во 2-ой - биоинфузин вводили внутримышечно в дозе 1,5 мг/кг.
В 3-ей - гистоген вводили внутримышечно в дозе 1 мг/кг.
В 4-ой - грамин внутримышечно в дозе 1 мг/кг массы тела.
Пятая группа - контрольная (препаратов не вводили).
Препараты использовались ежедневно, один раз в сутки, в течение 10 дней. За сутки до убоя прекращали применение препаратов. Сразу же после убоя приступали к осмотру туш и внутренних органов.
Для бактериологического анализа брали образцы мышечной ткани, с покрывающей их фасцией, размером не менее 8x6x6 см. Физико-химические и органолептические исследования проводили после созревания мяса(через 24 ч.). С этой целью от каждой туши брали овразцы мышечной ткани массой не менее 200 г из следующих мест:
- против 4 и 5-го шейных позвонков;
- область лопатки;
- область бедра.
В результате установлено, что степень обескровливания туш хорошая (кровь отсутствует в мышцах и крупных кровеносных сосудах). Лимфоузлы на разрезе светло-серого цвета, глазное яблоко заполняет всю орбиту, подкожный и внутренний жир бледно-желтого цвета, кожа сухая. Мышечная ткань плотная упругая, светло-красного цвета, на разрезе слегка влажная, не оставляет пятна на фильтровальной бумаге. Корочка подсыхания бледно-розового цвета.
Мясо имеет специфический запах свойственный свежей говядине.
Язык светло-серый, шероховатый; сердце темно-красного цвета, содержит незначительное количество сгустков крови; печень красно-бурого цвета; желчный пузырь содержит незначительное количествово желчи; почки дольчатые, темно-коричневые и селезенка красно-бурая, плотная. Все органы соответствуют физиологической норме. Рубец светло-серого цвета, содержимое в виде белесой слизи со специфическим запахом. Сычуг, книжка и сетка содержат незначительное количество слизи, без каких-либо патоморфологиче-ских изменений. В тонком и толстом отделе кишечника слизистая местами складчатая, покрыта слизью, без патологических изменений.
Для выяснения обсеменения мяса микрофлорой и выявления патогенных микроорганизмов проводили бактериоскопию мазков-отпечатков из глубоких слоев мышц, внутренних органов и лимфатических узлов. При этом поверхность органа или ткани предварительно прижигали шпателем и проф-ламбированным скальпелем вырезали кусочек и делали отпечаток на предметном стекле. Сушили на воздухе, фламбировали над пламенем горелки, окрашивали по Граму и микроскопировали под иммерсией. Параллельно производили посевы из исследуемых образцов на МПА и среду ЭНДО. Результаты бактериологических исследований представлены в таблице 2.49.
В дальнейшем определяли величину рН с помощью иономера универсального ЭВ-74. Для приготовления вытяжки брали 10 г мышечной ткани, мелко измельчали ножницами, а затем растирали пестиком в ступке, добавляли 10 мл дистиллированной воды из отмеренных 100 мл и переносили мясную кашицу в колбу с оставшимся 90 мл дистиллированной НгО. Колбу закрывали пробкой, содержимое взбалтывали в течение 2-3 мин., затем отстаивали 1-2 мин. и вновь взбалтывали. Вытяжку фильтровали через бумажный фильтр и определяли рН, которая находилась на уровне 5,9-6,1 во всех исследуемых опытных и контрольной пробах.
Исследование активности пероксидазы проводили в реакции мясной вытяжки (1:4) с 0,2% спиртовым раствором бензидина. В пробирку с 2 мл вытяжки приливали 5 капель раствора бензидина, взбалтывали и добавляли 2 капли 1% перекиси водорода. Во всех исследуемых образцах вытяжка приобретала сине-зеленый цвет через несколько минут переходящий в буро-коричневый (положительная реакция).
Формольную реакцию проводили по Т.В.Колоболотскому и С.В.Киселеву. Сущность реакции заключается в осаждении продуктов белкового обмена - полипептидов, пептидов, аминокислот и других формальдегидом. Для приготовления вытяжки 10 г мяса измельчали и растирали в ступке, а затем приливали 10 мл 0,9% NaCl и 10 капель 0,1% NaOH. Полученную смесь переносили в колбу, нагревали до кипения до осаждения белков. Колбу охлаждали и в нее добавляли 5 капель 5%-ного раствора щавелевой кислоты, фильтровали через бумажный фильтр до получения прозрачной жидкости. К 2 мл полученной вытяжки добавляют 1 мл нейтрального формалина. Во всех исследуемых образцах вытяжка оставалась жидкой и прозрачной, что соответствовало отрицательной формольной реакции. Результаты биохимических анализов представлены в таблице 2.48.
Куски мяса (по 200 г от туши), а также полученный из них фарш, подвергнуты дегустации в вареном виде. Мясо варили в соотношении с водой 1:2, в течение 40 мин. после закипания. Полученный из сырого мяса фарш (по 20 г от образца ) помещали в коническую колбу вместимостью 100 см3, заливали 60 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивали и ставили в кипящую водяную баню, где в процессе нагревания до 80-85С, в момент появления паров определяли запах бульона. Для определения прозрачности 20 см бульона наливали в мерный цилиндр вместимостью 25 см , имеющий диаметр 20 мм и оценивали его прозрачность визуально.
В результате установлено, что бульон, во всех случаях, прозрачный, ароматный, на поверхности его небольшое количество жира, мясо нежное, вкус специфический свойственный говяжьему во всех группах.
Заключение. Таким образом, результаты исследований показали, что мясо полученное от животных опытных и контрольной групп практически не отличается и характеризуется при наличии хороших органолептических показателей, отсутствием патогенных микробов, рН - 5,9-6,1; положительной реакцией на пероксидазу и отрицательной формольной реакцией, что позволяет использовать его в пищу без ограничений.
