Введение к работе
Актуальность темы
Одним из перспективных направлений молекулярной электроники является разработка биосенсоров, принцип действия которых основан на квантовых эффектах. Большая часть биосенсоров основана на использовании ферментов (энзимов) – биологических катализаторов, ускоряющих реакции в живом организме и отличающихся эффективностью действия, специфичностью и регулируемостью. Биосенсоры способны высокоселективно распознавать определенные молекулы и преобразовывать эту информацию в первичный сигнал. Регистрацию такого первичного сигнала производят с использованием электрических, оптических или других преобразователей, что позволяет получить легко обрабатываемый электрический сигнал. Наиболее широкое применение такие молекулярные сенсоры находят в медицине для определения глюкозы, молочной кислоты, холестерина, фруктозы, этанола и др., а также в экологическом мониторинге при обнаружении загрязнителей окружающей среды.
Развитие новых поколений функциональных элементов оптоэлектроники связано в основном с использованием различных наноразмерных и наноструктурированных материалов с заданными свойствами. При формировании таких материалов используются полупроводниковые нанокристаллы – квантовые точки (КТ). КТ обладают более значительным квантовым выходом люминесценции и фотохимической стойкостью по сравнению с молекулярными красителями. Большие перспективы связаны с применением биосенсоров для определения тяжелых металлов в белках.
Комплексообразование альбумина с тяжелыми металлами препятствует выполнению им его основных функций, в связи с этим целесообразно своевременное определение ионов тяжелых металлов в белках плазмы крови. Для определения механизмов взаимодействия «белок – тяжелый металл» используют различные методы: атомно-абсорбционное определение металлов в крови (Ф.А. Чмиленко), рентгеновского рассеяния (C.A. , I. , K.E. , A.J. , D. , D.J. , S. , P.J. , Е. А. Порай-Кошиц), спин резонансной спектроскопии (A. Banerjee, S. Lahiri) и метод динамического светорассеяния (Г.П. Петрова и др.)
Использование люминесцентного сенсора, являющегося чувствительным элементом портативного фосфориметра, позволяет контролировать наличие ионов тяжелых металлов, присутствующих в биологических образцах, что востребовано в медицинской диагностике и при осуществлении экологического мониторинга.
Таким образом, актуальным является изучение взаимодействия различных люминесцентных зондов с белками и тяжелыми металлами, разработка технологических основ создания люминесцентного сенсора на основе молекулы белка, а также приборного обеспечения в виде портативного фосфориметра, основанного на регистрации фосфоресценции и флуоресценции люминесцентного сенсора для определения тяжелых металлов.
Цель работы – разработка технологических основ создания активного элемента люминесцентного сенсора на основе молекулы белка (создание надмолекулярных комплексов «белок-ТМ-эозин» и «белок-ТМ-пирен», а также «белок-квантовая точка» в растворах и в пленках) для осуществления контроля тяжелых металлов в биологических образцах и исследование его фотофизических свойств, а также проведение исследований конструктивных основ создания прибора – портативного фосфориметра для определения ионов тяжелых металлов в водных растворах.
Основные задачи работы:
Разработать технологические основы создания люминесцентных сенсоров для микро- и наноэлектроники на основе полярных и неполярных зондов, нековалентно связанных с макромолекулами белка.
Изучить функциональные и эксплуатационные характеристики сенсоров методами спектрального анализа и кинетической спектроскопии.
Исследовать процессы тушения флуоресценции сенсоров тяжелыми металлами с помощью модернизированной установки на базе спектрометра ДФС-24.
Определить константы скорости тушения фосфоресцентных состояний сенсора методами импульсной фосфориметрии и математического моделирования.
Исследовать особенности процессов тушения электронно-возбужденных синглетных состояний неполярного зонда – пирена методами флуоресцентной спектроскопии в буфере сывороточного альбумина человека.
Исследовать взаимодействие полупроводниковых квантовых точек ZnCdS с молекулами САЧ и БСА.
Исследовать тушение люминесценции квантовых точек ионами тяжелых металлов в САЧ.
Разработать и создать портативный импульсный фосфориметр для регистрации интенсивности фосфоресценции и определения времени жизни фосфоресцентных состояний сенсора.
Провести технические исследования прибора – портативного фосфориметра.
Методы исследования
В основе работы люминесцентного сенсора лежит разработанный люминесцентно-кинетический способ определения наличия ионов тяжелых металлов в водных растворах (Наумова Е.В. и др. Патент на изобретение РФ № 24311132 (2011), бюл. № 28). Изучение характеристик люминесцентных сенсоров осуществлялось методами спектрального анализа и кинетической спектроскопии.
Белковые пленки готовились по известным технологиям: на специально подготовленные кварцевые подложки наносили раствор сывороточного альбумина человека и равномерно распределяли по поверхности подложки, затем полученную пленку высушивали. В качестве аналитического сигнала использована флуоресценция введенных в пленку наномаркеров: квантовых точек ZnCdS.
Изучение спектров поглощения и люминесценции сенсоров проводилось методами абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии.
Эксперименты по регистрации функциональных и эксплуатационных характеристик, а также кинетики люминесценции сенсора на основе молекулы белка проводились на специально разработанном портативном импульсном фосфориметре (Наумова Е.В. и др. Пат. РФ № 24311132 (2011), бюл. № 28).
Научная новизна:
Разработанный уникальный люминесцентно-кинетический способ (Наумова Е.В. и др. Пат. РФ № 24311132 (2011), бюл. № 28) обеспечил определение наличия ионов тяжелых металлов в растворах белка.
Математическая модель процессов тушения люминесценции зондов, связанных с молекулами белка, под действием ионов тяжелых металлов позволила уточнить константы скорости тушения фосфоресценции, что обеспечивает повышение точности определения концентрации ионов тяжелых металлов в белках.
Исследования процессов тушения флуоресценции и фосфоресценции полярных и неполярных люминесцентных зондов, связанных с сывороточным альбумином человека (САЧ) в фосфатном буфере рН 7,4, позволили обнаружить влияние структурных изменений белков, под действием солей тяжелых металлов, на процессы тушения синглетных и триплетных состояний зондов, а также эффект экранировки зарядов белков ионами солей тяжелых металлов. Определены константы Штерна-Фольмера тушения флуоресценции антрацена и пирена и фосфоресценции эозина, а также константы скорости тушения триплетных состояний эозина.
Впервые полученная зависимость индекса полярности пирена в САЧ от концентрации нитрата таллия позволяет определять структурные изменения в белках под действием ионов тяжелых металлов.
Установлено, что флуоресценция квантовых точек ZnCdS чувствительна к наличию белков в водных растворах. Полученные результаты свидетельствуют об эффективном взаимодействии квантовых точек ZnCdS с сывороточным альбумином человека и БСА.
Определены константы тушения флуоресценции КТ нитратом меди. Возрастание константы тушения от 0,04104 М-1 в воде до 0,14104 М-1 в САЧ можно объяснить концентрирующим действием САЧ.
Практическая значимость и реализация результатов.
Полученные результаты исследований фотофизических процессов дезактивации энергии электронного возбуждения сенсора под действием тяжелых металлов и атомов в люминесцентных сенсорах (красителях и КТ) позволяют разработать новые методы создания сенсоров для определения экотоксикантов.
Созданные сенсоры и приборное обеспечение в виде портативного импульсного фосфориметра, предназначенные для осуществления контроля содержания ТМ в биологических объектах, востребованы в медицинской диагностике и в экологическом мониторинге объектов окружающей среды
Основные результаты и положения, выносимые на защиту:
-
-
Технология создания люминесцентных сенсоров на основе надмолекулярных комплексов «белок-ТМ-эозин» и «белок-ТМ-пирен», а также «белок-квантовая точка», позволяющая определять наличие ТМ в водных растворах белка.
-
Установлено возрастание интенсивности люминесценции КТ ZnCdS с увеличением концентрации САЧ и БСА в растворе, связанное с эффективным взаимодействием белков с поверхностью КТ. Тушение люминесценции КТ ионами меди позволяет создать принципиально новые активные элементы электронных сенсоров для медицинской диагностики и экологического мониторинга.
-
Результаты по исследованию процессов тушения флуоресценции и фосфоресценции полярного зонда эозина, а также флуоресценции неполярных зондов пирена и антрацена в САЧ и БСА, свидетельствующие о проникновении ионов тяжелых металлов таллия, свинца, цезия, меди и др., а также тяжелого атома йода в полярные и неполярные микрообласти белков.
-
Методика, основанная на возрастании индекса полярности пирена в САЧ при увеличении концентрации ТМ, связанного с изменением структуры белков под действием ионов тяжелых металлов.
-
Установлено изменение чувствительности интенсивности и кинетики затухания фосфоресценции люминесцентного зонда – эозина к наличию ионов тяжелых металлов, используемое при разработке перспективных оптических методов определения наличия ионов тяжелых металлов и атомов в биологических средах.
Личный вклад соискателя заключается в участии при обсуждении постановки задач исследования, при проведении экспериментов, обработке и обобщении полученных результатов.
Гранты. Разработки по теме диссертационного исследования поддержаны следующими грантами: УМНИК «Разработка макета импульсного фосфориметра для определения наличия тяжелых металлов в водных растворах» – октябрь 2010, грант РФФИ 10-02-00159-а «Исследование триплет-триплетного переноса энергии электронного возбуждения между люминесцентными зондами, связанными с биополимерами» – 2010-2011, конкурс молодежных инновационных проектов КУМИР «Люминесцентный сенсор для контроля тяжелых металлов в медицинской диагностике» – март 2012, грант РФФИ №12-02-31196 «Особенности синглет-синглетного переноса энергии и тушения тяжелыми металлами возбужденных состояний люминесцентных зондов, связанных с биополимерами» – июнь 2012.
Достоверность и обоснованность полученных результатов обусловлены использованием в экспериментах стандартной измерительной аппаратуры и подтверждаются воспроизводимостью экспериментальных данных, полученных с использованием современных спектральных методов. Полученные результаты не противоречат существующим воззрениям на физико-химические процессы взаимодействия ТМ с белками и на процессы тушения возбужденных состояний люминесцентных зондов тяжелыми металлами.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, МГУ, 2007, 2008), Симпозиуме «Нанофотоника» (Московская обл., г.Черноголовка, 2007), Международной научной конференции «Математические методы в технике и технологиях» (Саратов, СГТУ, 2008; Псков, ППУ, 2009), International conference «Organic nanophotonics» (ICON – RUSSIA 2009) (St. Petersburg, 2009), Международной научной конференции «Проблемы управления, передачи и обработки информации АТМ-ТКИ-50» (Саратов, СГТУ, 2009), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Инновации и актуальные проблемы техники и технологий» (Саратов, СГТУ, 2009; Саратов, СГТУ, 2010), Второй Всероссийской школе-семинаре студентов, аспирантов и молодых ученых по направлению «Наноинженерия» (Москва, МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2009), конференции «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, СГТУ, 2011), Международной конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2012), 4-м Съезде биофизиков России (г. Нижний Новгород, 2012), ICIT (Саратов, СГТУ, 2012).
Публикации. Материалы, отражающие основное содержание работы, изложены в 25 публикациях, в том числе 3 в изданиях, включенных в перечень периодических изданий ВАК РФ. По теме диссертации получены патенты РФ № 24311132, № 118755 и свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2013615068.
Структура и объем диссертационной работы. Работа состоит из введения, четырех глав, заключения, списка использованной литературы из 141 наименования, изложена на 113 страницах, содержит 29 рисунков, 6 таблиц.
Похожие диссертации на Технологические основы создания люминесцентного сенсора для определения тяжелых металлов в белках
-
