Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Аналитический обзор
1.1 Современное состояние и перспективы производства продуктов переработки плодово-ягодного сырья .
1.2 Общие сведения о подлинности и фальсификации товаров 13
1.3 Понятие идентификации товаров и ее роль при оценке качества товаров 22
1.4 Методы идентификации продовольственных товаров 28
1.5 Современные методы ДНК-диагоностики в идентификации продовольственных товаров 35
ГЛАВА 2 Организация, объекты и методы проведения исследований 42
2.1 Структура и организация исследований 42
2.2 Объекты исследований 45
2.3 Методы исследований 46
ГЛАВА 3 Результаты исследований и их обсуждение 55
3.1 Изучение потребительских предпочтений к продуктам переработки плодово-ягодного сырья 55
3.2 Исследование компонентов растительных объектов, оказывающих влияние на специфичность полимеразной цепной реакции 64
3.2. Определение содержания веществ фенольной природы 65
3.2.2 Определение содержания полисахаридов в составе плодово-ягодного сырья 68
3.2.3 Определение содержания общего белка и его фракционного состава.. 69
3.3. Сравнительная оценка методов экстракции ДНК из растительного сырья и продуктов переработки на его основе з
3.4 Компьютерный анализ первичных структур и построение филогенетических дендограмм 81 CLASS 3. Конструирование универсальных праймеров, определение оптимальных параметров проведения ПЦР 87 CLASS
3.6 Определение чувствительности ПЦР-тест-системы при идентификации вида сырья в пищевых системах 101
3.7 Влияние способов температурной обработки на эффективность видовой идентификации ПЦР-тест-системы . 105
3.8 Идентификация вида плодово-ягодного сырья в многокомпонент ной пищевой системе традиционными методами и методом ПЦР 109
ГЛАВА 4 Практическая реализация результатов 121
Выводы 123
Список сокращений и условных обозначений 126
Библиографический список
- Понятие идентификации товаров и ее роль при оценке качества товаров
- Объекты исследований
- Определение содержания веществ фенольной природы
- Идентификация вида плодово-ягодного сырья в многокомпонент ной пищевой системе традиционными методами и методом ПЦР
Введение к работе
Актуальность работы. Продукты питания во все времена были важнейшей составляющей жизни людей. Они являются исходным материалом для построения и обновления человеческого организма, гармоничного развития и работоспособности.
В настоящее время российский рынок заполнили поддельными низкокачественными продуктами питания, зачастую вредными для здоровья населения. Согласно данным Института питания РАМН у большинства населения России выявлены нарушения полноценного питания, обусловленного недостатком белков, витаминов, макро- и микроэлементов в связи с этим безопасность и качество пищевой продукции имеют первостепенное значение для каждого потребителя и общества в целом.
Понятие «качество» пищевых продуктов включает не только питательную и биологическую ценность продукта, его сохранность и безопасность, наличие в нем химических веществ в качестве добавок, но и возможность их фальсификации. Фальсификация продуктов, как правило, связана с частичной или полной подменой одного объекта другим, что приводит к изменению не только вида, но и качества, которое выражается в несоответствии состава, указанного в информации на этикетке.
За последнее время значительно увеличился объем фальсифицированного сырья и готовой продукции. На сегодняшний день существует проблема с проведением всесторонней экспертизы подлинности продуктов питания, реализуемых на современном потребительском рынке, связанной с совершенствованием способов их фальсификации. В связи, с чем требуется постоянная модернизация существующих, а также создание принципиально новых методов анализа, которые не требуют большого количества материала и пригодны для рутинной диагностики. В условиях экономических санкций и отсутствия отечественных тест-систем, выпускаемых современной промышленностью, возникает необходимость принятия соответствующих мер для защиты здоровья населения от фальсифицированной продукции. Все вышеизложенное указывает на актуальность темы настоящей диссертационной работы.
Степень разработанности темы исследования. Значительный вклад в установлении видовой принадлежности растительного сырья методом полимераз-ной цепной реакции, внесли многие зарубежные исследователи, а также отечественные ученые. Среди наиболее значимых работ в этой области выделяются фундаментальные исследования D.C. Hunter, J. Zhang, L.M. Stevenson, P. Taberlet, L. Gielly, G.Pautou, J. Bouvet, J. Sabate, E.Barrio A. Ortola-Vidal. H. Schnerr, M. Ro-jmyr,. Светличкин A.M., Обухов И.Л., Комаров А.А. и др.
Цели и задачи. Целью данной диссертационной работы является исследование и разработка тест-системы, основанной на методе полимеразной цепной реакции амплификации ДНК, позволяющей качественно идентифицировать плодово-ягодное сырье (на примере земляники, малины, крыжовника и шиповника) в составе продуктов его переработки.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи: изучить потребительские предпочтения к продуктам переработки плодово-ягодного сырья;
– исследовать компоненты растительных объектов (на примере земляники, малины, крыжовника и шиповника), влияющие на идентифицирующую способность тест-системы;
– сравнить эффективность различных способов выделения и очистки ДНК при подготовке проб при ПЦР-анализе плодово-ягодного сырья и продуктов его переработки;
– проанализировать нуклеотидные последовательности ДНК малины Rubus idaeus), земляники Fragaria), крыжовника (лат. Ribes uva-crispa), шиповника Rsa); провести филогенетический и сравнительный анализ нуклео-тидных последовательностей данного плодово-ягодного сырья;
– сконструировать универсальные праймеры для амплификации Rubus
idaeus, Fragari, Ribes uva-crispa, Rosa; определить оптимальные параметры проведения ПЦР для идентификации Rubus idaeus, Fragari, Ribes uva-crispa, Rosa;
– определить чувствительность и специфичность разработанной тест-
системы при идентификации видовой аутентичности плодово-ягодного сырья;
– исследовать влияние технологической обработки плодово-ягодного сырья на эффективность видовой идентификации ПЦР-тест-системы;
– дать сравнительную характеристику методам идентификации вида плодово-ягодного сырья в многокомпонентной пищевой системе.
Научная новизна. Экспериментально исследован и научно обоснован состав реакционной смеси ПЦР-тест-системы для определения видовой принадлежности плодово-ягодного сырья (на примере земляники, малины, крыжовника и шиповника) и продуктов его переработки.
Доказана чувствительность и специфичность разработанной ПЦР-тест-системы для целей идентификации плодово-ягодного сырья и продуктов его переработки.
Предложен наиболее эффективный способ подготовки проб для ПЦР-анализа плодово-ягодного сырья, обеспечивающий высокую степень экстракции и очистки ДНК.
Доказана возможность применения полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения видовой принадлежности плодово-ягодного сырья, прошедшего тепловую обработку.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе результаты могут явиться основой для дальнейших перспективных разработок методов идентификации плодово-ягодного сырья и продуктов его переработки.
Разработана идентифицирующая ПЦР-тест-система для контроля качества продуктов переработки плодово-ягодного сырья (на примере земляники, малины, крыжовника и шиповника).
Отдельные этапы работы выполнены в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме: «Молекулярно-генетический анализ ДНК растительного происхождения с целью разработки ПЦР-тест-систем для идентификации фальсификации продуктов на их основе», соглашение № 14.В37.21.1968.
Результаты работы внедрены в деятельность Научно-исследовательского института биотехнологии при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)».
Результаты работы нашли применение в учебном процессе на кафедре «Бионанотехнологии» ФГБОУ ВО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)», используются при подготовке бакалавров, обучающихся по направлению 19.03.01 «Биотехнология», и магистрантов, обучающихся по направлению 19.04.01 «Биотехнология».
Методология и методы исследований.
При проведении исследований пользовались общепринятыми, стандартными и специальными методами испытаний, в т.ч. социологическими, маркетинговыми, органолептическими, физико-химическими, спектроскопическими, хрома-тографическими и биологическими.
Положения, выносимые на защиту.
– экспериментальные данные о компонентном составе растительных объектов родов Rubus idaeus, Fragari, Ribes uva-crispa, Rosa, влияющем на идентифицирующую способность тест-системы;
– результаты сравнительной оценки методов выделения ДНК из плодово-
ягодного сырья и продуктов его переработки;
– параметры проведения полимеразной цепной реакции изученных родов растительного сырья;
– результаты оценки чувствительности разработанной ПЦР-системы и влияния технологической обработки плодово-ягодного сырья на эффективность видовой идентификации тест-системы;
– сравнительные результаты идентификации вида плодово-ягодного сырья в многокомпонентной пищевой системе традиционными методами и методом ПЦР.
Степень достоверности и апробация результатов исследования. Основные положения и результаты диссертационного исследования были предметом обсуждения на научно-практических конференциях международного, межрегиональных уровнях: V Международная научно-практическая конференция (Новосибирск, 2014); Международная научная конференция «Пищевые инновации и биотехнологии» (Кемерово, 2014,); Международная научно-практическая конференция «Интеграционные процессы развития мировой научной мысли XXI веке» (Казань, 2014,2016); XII Международная научно-практическая конференция «Проблемы современной биологии» (Москва, 2014); Международная научно-практическая конференция «Инновационные вопросы в научной среде» (Уфа, 2014); V Международная научно-практическая конференция «Современные достижения биотехнологии. Актуальные проблемы молочного дела» (Ставрополь, 2015); Международная научно-практическая конференция «Новая наука от идеи к результату» (Сургут, 2016); Международная научно-практическая конференция «Влияние науки на инновационное развитие» (Пермь, 2016).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Содержание и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав основного текста, заключения, библиографического списка использованной литературы, включающего 250 источников информации. Основное содержание работы изложено на 125 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 32 рисунка.
Понятие идентификации товаров и ее роль при оценке качества товаров
В связи с увеличением объемов потребления населением плодово-ягодных культур, в мире наблюдается тенденция роста их возделывания. Сегодня все большее внимание уделяется малине, землянике, крыжовнику и шиповнику, отличающихся от других культур высоким содержанием важнейших биологически активных веществ [70]. Ведущей культурой мира остается земляника. На ее долю приходится более 2/3 общемирового объема. Лидируют по выращиванию земляники такие страны как США (83 тыс. т), Испания (3 0 тыс. т), Япония (208 тыс. т); Южная Корея (204 тыс. т) и Польша ( 96 тыс.т) . Россия, по данным FAO, занимает третье место в мире по производству земляники (230 тыс.т) [2,4].
Россия занимает первое место в мире по производству малины, ее доля со ставляет четверть мирового рынка ( 7 тыс тон). Далее следуют Сербия (93 тыс. т), Польша ( тыс. т), Германия (30 тыс. т). Все перечисленные страны, занима ются активно экспортом, данной культурой [10,71]. Мировой производство крыжовника сконцентрировано в Европе, Северной Азии, Австралии и Новой Зеландии. В России производиться (67 тыс. т). Что касается шиповника то он широко распространен в Северной и Центральной Европе, Средней Азии, Иране и на Кавказе и др.
Однако yесмотря на высокий сельскохозяйственный потенциал отечественный рынок плодов и ягод в настоящее время находится в зависимости от импорта, доля которого составляет около 70% [149].
Употребление в пищу плодов и ягод в свежем виде носит сезонный характер. В связи с чем возникает проблема длительного хранения и подбора способов переработки с возможностью максимального сохранения пищевой и биологической ценности исходного сырья в течение всего года [19].
Сохранение данного природой натурального сырья и произведенных человеком продуктов питания эта одна из основных целей в технологии переработки пищевой промышленности. В настоящее время известно достаточно большое ко 11 личество способов и методик переработки плодово-ягодного сырья. Эти способы основаны на принципах биоза, анабиоза и абиоза в соответствии с классификацией, предложенной Никитинским Я.Я.[168].
Сохранение сельскохозяйственной продукции осуществляется путем заморозки, сушки, консервирования при помощи термического или химического воздействия. Рассматривая процессы сохранения продукции, существующие на сегодня, следует отметить, что практически все они в той или иной степени нашли применение в современных технологиях, либо как доминантный фактор или как вспомогательный[157]. Производство из плодово-ягодного сырья консервов, сушеных овощей и фруктов, порошкообразных продуктов, быстрозамороженных изделий и полуфабрикатов позволяет равномерно в течение года обеспечивать население этой продукцией и создавать резервы [2].
Производство консервов, сушеных овощей и фруктов, порошкообразных продуктов, быстрозамороженных изделий и полуфабрикатов из плодово-ягодного сырья позволяет равномерно в течение года обеспечивать население этой продукцией [170].
По пищевой ценности переработанные плоды и ягоды делят на две группы: продукты, близкие к свежим плодам и ягодам (быстрозамороженные плоды и ягоды); продукты с измененной пищевой ценностью вследствие разрушения или внесения добавок, при их переработке (полуконсервы и консервы). В свою очередь консервы из плодов и ягод подразделяются на следующие группы: натуральные (плоды в натуральном соке, пюре или пульпе); ягоды, пастеризованные с сахаром; пюреобразные, в том числе протертые или дробленые; компоты и маринады (стерилизованные и пастеризованные); варенье, джемы, повидло [72,137].
В настоящее время переработка плодово-ягодной продукции ассоциируется с особенностями питания современного человека. Раньше большинство людей занимались приготовлением варенья, повидла, джема, мармелада, сиропов, желе и др. в домашних условиях, заготавливая их впрок на зиму. И хотя такая продукция ничуть не утратила свою популярность, большинство людей предпочитают приобретать ее в магазинах, а не тратить свое время и силы на домашнее консервирование. В связи с чем, на рынке наблюдается положительная тенденция в отношении продажи продуктов переработки плодово-ягодного сырья. За последнее время доля продаж данной продукции выросли на 2 %. Большое влияние на его увеличение оказывает расширение ассортимента в рознице. Кроме этого на рынке присутствуют товара импортируемые из стран дальнего и ближнего зарубежья [169].
Если оценивать популярность импортной продукции у россиян, то ситуация будет выглядеть так: первое место - джем. На сегодня в структуре импортируемой в РФ плодово-ягодной консервации он занимает самую большую долю - 60 % от общего количества всех «сладких законсервированных» продуктов; второе место - у конфитюра (иногда его называют «французским братом» джема). Он занимает около 2 % от общего объёма; третье место занимает любимое россиянами варенье (14 %); четвертое место заграничных фруктово-ягодных сладостей принадлежит повидлу (3 %); пятое место - у протёртых ягод. На их долю пришлись оставшиеся 2 % [70]. Несмотря на обеспеченность предприятий отечественным сырьем, в том числе и за счет собственных сырьевых зон, на российском рынке преобладают за рубежные производители. Эксперты отмечают, что в России основные поставки сырья для производства продуктов питания на основе плодово-ягодного сырья идут из других стран и лишь % составляет отечественное сырье . Это обуслов лено, в первую очередь, климатическими условиями, в силу которых обеспечить себя собственным сырьем производители просто не в состоянии [98]. Определяющими факторами конъюнктуры рынка данной категории товаров являются природные условия, урожайность, уровень потребления, колебания курса валют. Сложившаяся в последнее время политика эмбарго в отношении сырья и продуктов питания на основе плодов и ягод резко сократило их ввоз на территорию Российской Федерации, что повлекло за собой роста фальсифицированных продовольственных товаров [45].
Объекты исследований
При анализе теоретических положений применялись методы систематизации, классификации, сравнения, обобщения, экспертных оценок. При проведении исследований пользовались общепринятыми, стандартными и специальными методами испытаний, в т.ч. социологическими, маркетинговыми, статистическими, органолептическими, физико-химическими и др. Исследования проводились в трёх-пятикратной повторности.
Сбор первичной информации о потребительских предпочтениях жителей г. Кемерово в отношении продуктов переработки плодово - ягодного сырья, а также о степени информативности в вопросе фальсификации пищевых продуктов, осуществляли путем социологического опроса. Формой для сбора данных являлась анкета, содержащая вопросы по задачам исследования. Потребители опрашивались на улице, в торговых организациях, на рабочих местах. Обработка анкет проводилась с помощью компьютерной программы Microsoft Excel 20 0 и Statistica 8.
При формировании выборочной совокупности для получения достоверных данных применяли методику квотного отбора с жесткими требованиями по признакам пола и возраста. Объем выборки определялся на основе статистического анализа при уровне доверительной вероятности 99 %, допустимой ошибке ±6 % и составил 503 человека. Таким образом, выводы, сделанные в исследовании можно распространить на всех жителей г. Кемерово с точностью ±6 %. Структура генеральной совокупности населения Кемерово и выборочной совокупности респондентов, отвечавших на вопросы интервью, представлена в таблице 2.3.1.
Итого 47 53 46 54 Сбор сырья осуществляли с учетом индивидуальных особенностей каждого вида, в период наибольшего содержания биологически активных веществ и оптимального соотношения вкусо-ароматических свойств. Исследуемое сырье собирали вручную в сухую погоду в период технической зрелости, чтобы избежать увлажнения и последующей порчи продукции. Для наилучшего качества растительного сырья в процессе его сбора проводились одновременно сортировка и освобождение от примесей.
Отбор проб и подготовку их к анализу проводили по ГОСТ 26313 2014 «Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки и методы отбора проб»[40].
Для обеспечения условий, предотвращающих загрязнение, изменение со става и состояния образца общую пробу отбирали следующим образом: в однора зовый плотный полиэтиленовый пакет отбирали 0 образцов проб ( по - 0 г), формируя общую пробу массой от 0 до 00 г; далее из общей пробы отбирали среднюю пробу в 10-20 г, помещали в полиэтиленовый пакет с застежной молни ей размером не более 0 см. Далее этот маленький пакет помещали в однора зовый плотный полиэтиленовый пакет размером 2030 см, опечатывали. От пар тии продуктов плотной консистенции отбирали общую пробу весом 0- 0 г в од норазовый плотный полиэтиленовый пакет с застежной молнией размером не бо лее 0 см. Пробы жидких продуктов отбирали в чистые емкости из стекла или пластика с герметично закрывающими крышками объемом не более 0 см3, опе чатывали. Массовую долю сухих веществ определяли по ГОСТ ISO 2 73-2013 «Продукты переработки плодов и овощей. Рефрактометрический метод определения растворимых сухих веществ» [42];
Массовую долю титруемых кислот определяли по ГОСТ ISO 7 0-2013 «Продукты переработки плодов и овощей. Определения титруемых кислот» [43].
Массовую долю минеральных примесей определяли по ГОСТ 2 .3-82
«Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения минеральных примесей» [39]. Наличие/отсутствие примесей определяли по ГОСТ 26323-2014 «Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения содержания примесей растительного происхождения» [41].
Содержание полифенольных соединений проводили спектрофотометриче-ским методом, который основан на образовании окрашенных продуктов окисления фенольных соединений с фосфорномолибденово-вольфрамовым реактивом в щелочной среде, создаваемой насыщенным раствором карбоната натрия. Интенсивность окраски позволяет судить о количестве полифенольных соединений. Для определения суммы полифенольных соединений анализируемых образцов измеренное светопоглощение пересчитывали в единицы концентрации по градуи-ровочному графику, полученному для стандартного полифенола, например рутина. Поэтому полученный результат является усреднённым аналитическим откликом всех полифенольных соединений, содержащихся в объекте анализа [48].
Фракционный состав флавоноидов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографией, на жидкостный хроматограф LC-20 компании Shimadzu [183].
Общее содержание полисахаридов (ПСХ) определяли гравиметрическим методом. Водорастворимые полисахариды получали методом последовательной экстракции водой и пектиновые вещества водой, подкисленной кислотой хлористоводородной с последующим осаждением указанных групп соединений трехкратным объемом 96 %ного этилового спирта [69]. Определение количественного содержания сахаров в гидролизатах полисахаридов проводили денситометри-чески после хроматографии их в тонком слое сорбента.
Общее количество белка в пробах определяли методом Дюма, основанным на измерении теплопроводности молекулярного азота, образующегося после сжигания анализируемого образца при температуре около 000С в атмосфере кислорода и последующего восстановления всех образующихся оксидов азота при помощи восстанавливающего агента (меди) с использованием анализатора белкового азота Rapid N Cube (Elementar, Германия), предназначенного для автоматического определения содержания азота в пищевых и сельскохозяйственных продуктах в различных агрегатных состояниях: твердых, жидких, пастообразных. Перед сжиганием анализируемый образец помещали в специальную оловянную капсулу и затем в ячейку автосамплера анализатора белкового азота. По абсолютному содержанию азота в пробе и массе пробы автоматически рассчитывали массовую долю азота, затем рассчитывали массовую долю белка, используя пересчетный коэффициент [94].
Определение аминокислотного состава проводили с помощью аминокислотного анализатора (Analytical Systems Gmb, Германия) в соответствии с инструкцией по использованию прибора.
.Для проведения экстракции ДНК использовали коммерческие наборы «ПРОБА–ЦТАБ (ООО «НПО ДНК–Технология», Москва), «Сорб-ГМО-А» (ЗАО «Синтол», Москва) и метод фенольной экстракции. Выделение проводили согласно рекомендованными протоколами приведёнными ниже. Метод фенольной экстракции:
В пробирку с исследуемым образцом добавляется 00 мкл буфера для экстракции. Содержимое перемешивают при помощи встряхивателя типа Вортекс до полного смачивания пробы. Затем пробирку с пробой инкубируют в твердом термостате в течение 4 мин при 6 С. Далее в пробирку вносят 400 мкл хлороформа и эмульгируют содержимое вручную, переворачивая пробирку в течение мин и центрифугируют пробирку мин. при 2 тыс.об/мин, полученную верхнюю водную фазу переносят в чистый «Эппендорф». К надосадочной жидкости добавя-лется равный объем фенола и эмульгируют содержимое вручную, переворачивая пробирку в течение 3 мин. Затем центрифугировали пробирку мин. при 2 тыс. об/мин, полученную верхнюю водную фазу переносили в чистый «Эппендорф».
Определение содержания веществ фенольной природы
Известно, что растения способны накапливать разные активные вещества белковой и небелковой природы. Азот в растительных объектах представлен двумя формами: азотом белковым и азотом небелковых соединений, к которым относят амиды, амины, свободные аминокислоты, нитраты и аммиак. Растительные ткани содержат большое количество полисахаридов, полисахариды в комплексе с белками; белки в комплексе с липидами, комплексы белков с нуклеиновыми кислотами, полифенолы и другие вторичные метаболиты, это существенно затрудняет изолирование ДНК из многокомпонентной смеси, элементы которой могут как физически связывать, так и химически деградировать молекулы нуклеиновой кислоты [192].
Общее количество белка в пробах определяли методом Дюма. На рисунке 3.2.3.1 в представлены спектральные кривые исследуемых образцов, в таблице 3.2.3.1 расшифрованы спектры паров азота исследуемых растительных объектов. Помимо этого, после постановки дополнительных опытов, приведено определение содержания отдельных белковых фракций.
Наименование образца Малина (Rubus idaeus) Земляника (Fragari) Шиповник (Rоsa) Крыжовник (Ribes uva-crispa)
Содержание белка, % 0,66±0,03 0, 3±0,03 0,78±0,04 0,8 ±0,04 На основании представленных в таблице 3.2.3.1 данных, можно сделать вывод о том, что наибольшая массовая доля общего белка наблюдается в образцах шиповника 0,78±0,04% и крыжовника 0,8 ±0,04%. Незначительно меньше содержание белка отмечается в пробах малины (на уровне 0,66±0,03%). Как следствие, в указанных образцах процесс выделения очистки растительной ДНК от веществ, являющихся потенциальными ингибиторами, в перспективе будет наиболее затруднительным и продолжительным по времени.
Известно, что фракционный состав растительных белков очень часто идентичен, различия заключаются в количественном соотношении фракций белков. Поэтому дальнейшее исследование посвящено определению процентному содержанию каждой фракции в растительных объектах.
Анализ белков растительных объектов по фракциям показывает, что значительную часть анализируемых составляют глютелины и альбумины, что соответствует литературным данным. Также во всех представленных объектах ягодного сырья обнаружены глобулиновые фракции, однако их массовое содержание незначительно (0,020,04 %). Из таблицы видно, что преобладающе содержание щелочерас-творимых фракций отмечается в образцах крыжовника, массовая доля глютелина в них составила 0, 2±0,03% соответственно. Это , раза больше, чем в других исследуемых объектах (малине, клубнике, шиповнике). Процентное содержание водорастворимых фракций в анализируемых образцах изменяется в пределах 0, 7-0,25 %. Больше альбуминовых фракций наблюдается в пробах малины, крыжовника. Общее содержание трех фракций меньше общего содержания белков, вероятно, вследствие присутствия неидентифицированных веществ белковой природы.
Для определения количественного содержания аминокислот в экстракте использована методика, основанная на реакции взаимодействия аминокислот с раствором нингидрина с последующим спектрофотометрированием полученного окрашенного комплекса при длине волны около 70 нм. Аминограммы состава исследуемых образцов приведены на рисунке 3.2.3.2, процентное содержание аминокислот представлено в таблице 3.2.3.2.
Таким образом, в ходе исследования получены спектрометрические профили, определяющие соотношение аминокислот в составе белков растительного происхождения. Несмотря на разнообразие выявленного аминокислотного состава белков, для каждого индивидуального белка характерен строго определенный аминокислотный состав, что обусловлено генетическим кодом, сформированным в процессе эволюции. Экспериментальный материал, полученный при анализе растительных белков, свидетельствуют о том, что они имеют в своем составе как заменимые, так и незаменимые аминокислоты, содержание которых варьируется в различных пределах. В структуре многих белков идентифицированы как заменимые аминокислоты (аланин, аргинин, аспаргиновая кислота, гистидин, глицин, глута-миновая кислота, пролин, серин, тирозин и цистеин) так и незаменимые аминокислоты (валин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилала-нин).
Наиболее важным фактором ПЦР анализа является качество и чистота нуклеиновых кислот. В ходе проведения серии экспериментов было установлено присутствие веществ фенольной, полисахаридной и белковой природы. Физико-химические свойства подобных веществ в определенной степени совпадают со свойствами нуклеиновых кислот, что затрудняет их полное отделение от ДНК и в дальнейшем препятствует полимеразной цепной реакции [62]. Поэтому дальнейшее исследование диссертационной работы связано с выбором наиболее оптимального метода выделения и очистки ДНК.
Идентификация вида плодово-ягодного сырья в многокомпонент ной пищевой системе традиционными методами и методом ПЦР
В процессе оценки параметров учитывали наличие или отсутствие фоновой амплификации, наличие дополнительных продуктов амплификации.На основании выбранных в процессе экспериментов оптимальных параметров времени и температур для всех стадий амплификации, был составлен следующий режим для проведения ПЦР: 950С- 200 с- цикл, 640С- 0 с- 3 циклов, 72 0С – 20 с- цикл. Подобранные условия позволили хорошо визуализировать результаты полимеразной цепной реакции и зафиксировать их.
Современный продовольственный рынок представлен множеством пищевых продуктов различных групп, видов, разновидностей, торговых марок и наименований. Не секрет, что значительное расширение ассортимента продуктов питания на потребительском рынке не обходится без стремления выпускать продукцию заведомо заниженного качества [90].
Зачастую пищевые предприятия могут фальсифицировать содержание в продуктах плодово-ягодных путем недовложения компонентов, предусмотренных рецептурой; заменой дорогостоящего сырья менее ценным, включение различных добавок красителей и ароматизаторов, которые по экономическим соображениям, являются более дешевыми ингредиентами. Реализую продукцию заведомо ложного состава, производитель не только пытается обмануть потребителя, но и наносит вред его здоровью и жизни, причем рядовой потребитель зачастую даже не догадывается об этом [103,120].
Как известно, одним из достоинств ПЦР-анализа являются его высокая чувствительность и специфичность, основанные на принципе экспоненциального накопления продукта и выявлении уникальных последовательностей генома. Благодаря высоким показателям чувствительности тест-систем, основанных на применении методов ДНК-диагностики, удается выявлять и идентифицировать даже следовые количества (менее 1 %) ДНК того или иного биологического объекта, а вероятность его обнаружения при этом составляет 99,9 %[133].
В связи с чем, представляло интерес определить порог чувствительности ПЦР-тест-системы, предназначенный для выявления возможной фальсификации, связанной с замещением сырьевого состава.
Для определения возможности выявления факта смешения разных сырьевых источников при производстве продуктов переработки плодово-ягодного сырья были приготовлены смеси пюре, содержащие от 0, % до 00% плодово-ягодного сырья.
Интерпретацию результатов ПЦР-анализа по определению видовой принадлежности исследуемых проб производили при помощи сконструированных положительных контролей. Продукты амплификации положительных контролей для разработанных праймеров на электрофореграмме представляли собой яркую четкую полосу. Если на электрофореграмме размер ампликонов по размеру соответствовал ПЦР- ампликону положительного контроля, то такие образцы считали «положительными», то есть содержащими ДНК соответствующего объекта плодово-ягодного сырья.
Для контроля реагентов, используемых для ПЦР-анализа, на предмет контаминации ампликонами применяли отрицательный контроль, содержащих ионизованную воду. В электрофоретической дорожке с отрицательным контролем окрашенные полосы должны были отсутствовать. Допускалось присутствие только одной слабо окрашенной полосы. В противном случае результаты ПЦР-анализа считали недостоверными.
В случаях, когда в ходе электрофоретического анализа ПЦР-продуктов из какой-либо пробы был получен неоднозначный результат (слабая окраска, диффузное размывание полос и пр.), проводили повторную амплификацию с той же пробой ДНК. Результаты проведения ПЦР принимали недостоверными, если: в дорожке с внутренним положительным контролем отсутствовал фрагмент ДНК указанного размера; в дорожке с отрицательным контролем присутствовала специфическая полоса; в электрофоретических дорожках присутствовали неспецифические полосы различного размера