Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Аналитический обзор 12
1.1 Микрофлора минимально обработанных фруктов и овощей 12
1.2 Свойства, механизм действия и классификация бактериоцинов, продуцируемых бактериями 19
1.3 Методы выделения и идентификации бактериоцинов 31
1.4 Заключение по обзору литературы, цель и задачи исследования 38
ГЛАВА 2. Методика выполнения работы 40
2.1 Организация выполнения работы 40
2.2 Объекты исследований 42
2.3 Методы исследований 44
ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 54
3.1 Изучение физиолого-биохимических, антимикробных свойств и генетические особенностей бактерий, выделенных с поверхности овощей 54
3.2 Подбор оптимальных условий культивирования бактерий, выделенных с поверхности овощей 73
3.3 Разработка технологии выделения и очистки бактериоцинов и способа обработки плодов и овощей 87
ГЛАВА 4. Практическая реализация результатов исследований 103
4.1 Технологическая схема по производству биоконсерванта для увеличения сроков хранения плодов и овощей 103
4.2 Свойства биоконсерванта 106
4.3 Технологические схемы обработки томатов биоконсервантом 111
4.4 Свойства томатов, обработанных биоконсервантом 113
4.5 Расчет ожидаемой экономической эффективности 118
Выводы и результаты 123
Список использованных источников 125
Приложения
- Свойства, механизм действия и классификация бактериоцинов, продуцируемых бактериями
- Заключение по обзору литературы, цель и задачи исследования
- Объекты исследований
- Свойства томатов, обработанных биоконсервантом
Введение к работе
Актуальность темы. По данным статистики деятельности АПК в
России потери при хранении плодоовощной продукции являются весьма
значительными и составляют около 40% от общего валового сбора. Широко
используемыми способами увеличения сроков хранения плодов и овощей
являются замораживание и консервирование. Эти способы позволяют
продлить срок годности продуктов, но при этом происходит значительная
потеря полезных веществ. Альтернативой существующим способам является
биоконсервация. Биоконсервация основана на использовании
дополнительной естественной или контролируемой флоры и/или
антибактериальных препаратов.
В связи с наличием антимикробных свойств у бактериоцинов и их природного происхождения, они обладают высоким потенциалом для их применения в составе биоконсервантов, что в свою очередь позволит решить проблему создания современных и эффективных технологий увеличения сроков хранения плодов и овощей. В связи с вышесказанным, работы по исследованию и разработке технологии получения биоконсерванта для увеличения сроков хранения плодов и овощей являются актуальными
Степень разработки темы исследования. Существенный вклад в развитие технологии получения биоконсерванта, а также получения бактериоцинов внесен российскими и зарубежными исследователями: Л.П. Блинкова, Е.В. Куксова, Н.А. Глушанова, В.А. Филиппов, Л.Г. Стоянова, Д.Г. Кудлай, K. Doi, T. Zendo, K. Sonomoto, I. F. Nes, T. Nilsen, P. Pattnaik, P. Pothuri, E. Rodriguez, R.P. Ross, T. Stein, T. Klaenhammer, J.E. Line, S. Ennahar, D. Drider, H. Ghalfi и др.
Существует значительное количество научных работ, направленных на выделение бактериоцинов различных микробных штаммов и исследование их свойств и антимикробного потенциала. Одним из актуальных направлений научных исследований является разработка новых технологий получения биоконсерватов на основе бактериоцинов с целью увеличения сроков хранения пищевых продуктов. Исследования в данном направлении являются актуальными и представляют интерес для пищевой промышленности, благодаря разнообразию бактериальных штаммов, способных продуцировать бактериоцины и их широкому спектру антимикробной активности.
Цель и задачи исследований. Целью работы является исследование и разработка технологии получения биоконсерванта для увеличения сроков хранения плодов и овощей на основе бактериоцинов выделенного штамма микроорганизмов. Для достижения поставленной цели сформулированы основные задачи исследований:
– изучить физиолого-биохимические свойства, генетические
особенности и антимикробные свойства бактерий, выделенных с поверхности овощей (репчатый лук, болгарский перец, помидор);
– подобрать рациональные условия культивирования бактерий, выделенных с поверхности овощей;
– разработать технологию выделения и очистки бактерицинов и способ обработки плодов и овощей;
– разработать технологическую схему получения биоконсерванта для увеличения сроков хранения плодов и овощей;
– изучить состав и свойства полученного биоконсерванта;
– рассчитать ожидаемую экономическую эффективность;
– провести промышленную апробацию технологии.
Научная новизна работы.
– изучены физиолого-биохимические свойства и генетические
особенности штаммов, выделенных с поверхности овощей (репчатый лук, болгарский перец, помидор). Установлено, что штаммы относятся к следующим видам: Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus endophyticus, Bacillus licheniformis;
– установлены рациональные условия для культивирования штаммов Bacillus pumilus, Bacillus safensis, Bacillus endophyticus и Bacillus licheniformis: температура 30 ± 2 С; pH 6,5; продолжительность 18 ч; оптимальный состав среды для культивирования штаммов (г/л: дрожжевой экстракт – 5,0; калия фосфат двухзамещенный – 5,0; натрия хлорид – 2,0; магния сульфат – 0,2; сахароза – 5,0, мочевина – 1,5).
– изучены антимикробные свойства штаммов Bacillus pumilus, Bacillus
safensis, Bacillus endophyticus и Bacillus licheniformis, показано, что все
выделенные штаммы имеют ингибирующий потенциал (от 28 до 91%) против
таких патогенных микроорганизмов, как Pseudomonas fluorescens,
Arthrobacter cumminsii, Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Listeria monocytogenes, Yersinia spp., Escherichia coli, Enterobacter ludwigii, Erwinia aphidicola, Salmonella enterica, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas aeruginosa.
– для разработки биоконсерванта выбран штамм Bacillus safensis, проявляющий наиболее высокую антагонистическую активность (от 45 до 91%) по отношению к таким распространенным патогенным штаммам как Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas fluorescens, установлена минимальная ингибирующая концентрация штамма Bacillus safensis – 1,5103 КОЕ/мл.
– определена технология очистки бактериоцинов, получен препарат бактериоцина с концентрацией белка 0,9 мг/мл и удельной активностью 1624,0 УЕд. Установлена молекулярная масса бактериоцинов, составляющая 4,21 кДа и их принадлежность к классу лантибиотиков.
– установлено, что оптимальным способом нанесения
биоконсерванта на поверхность свежих томатов является распыление, температура 18±2 С, продолжительность 30-60 с. При обработке разработанным биоконсервантом сроки хранения томатов увеличиваются до 39 суток, температура хранения 4±2 С.
Практическая значимость работы. В результате проведения
исследований разработана технология выделения и очистки бактериоцинов штамма Bacillus safensis.
Новизна разработанных технологических решений подтверждена
заявками на патент РФ № 2014150635 «Способ получения биоконсерванта»;
№ 2015115875 «Способ увеличения срока хранения свежих овощей и
фруктов». Разработаны и утверждены технические условия и технологическая
инструкция на производство биоконсерванта (ТУ 9291-144-02068315-2016 и
ТИ 9291-144-02068315-2016). Проведена промышленная апробация
технологии на ООО «МКС».
Осуществлено национальное патентное депонирование штаммов во
Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов
(регистрационные номера ВКПМ: В – 12224, В-12180, В-12181, В-12182).
Методология и методы исследований. При проведении исследований
использовались общепринятые, стандартные и оригинальные методы
биохимического, физико-химического, микробиологического и
генетического анализа, в том числе спектрофотометрия, электрофорез в агарозном геле, электрофорез в полиакриламидном геле по Лэммли, выделение ДНК микроорганизмов, ВЭЖХ и др.
Положения, выносимые на защиту:
– физиолого-биохимические, антимикробные свойства и
генетические особенности бактерий, выделенных с поверхности свежих овощей (репчатый лук, болгарский перец, помидор);
– оптимальные условия культивирования бактерий, выделенных с поверхности свежих овощей;
–технология очистки биоконсерванта и способ обработки
поверхности свежих плодов и овощей биоконсервантом на примере томатов;
– технологическая схема получения биоконсерванта для увеличения сроков хранения свежих плодов и овощей.
Степень достоверности и апробации работы. Основные результаты
диссертационной работы обсуждены на конференции 4 international Scientific
Conference «Applied Sciences and technologies in the United States and Europe:
common challenges and scientific findings» (USA, 2013), международном
конкурсе «Интеграция мировых научных процессов как основа
общественного прогресса» (Казань, 2013), IX международной научно-
практической конференции «Техника и технология: новые перспективы
развития» (Москва, 2013), II международном осеннем симпозиуме
«Инновации в современной науке» (Москва, 2013), фестивале науки
«Изобретатель XI века» (Иркутск, 2013), международной научной конференции «Пищевые инновации и биотехнологии» (Кемерово, 2014), международной заочной научно-практическая конференция «Актуальные вопросы образования и науки» (Тамбов, 2014), XXVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии
и биотехнологии» (Москва, 2014), III всероссийской конференции с
международным участием «Биотехнология в интересах экологии и
экономики Сибири и Дальнего Востока», (Улан-Удэ, 2014), XI international
scientific and practical conference «Science and civilization» (Sheffield, 2015), XI
Midzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji «Strategiczne pytania
wiatowej nauki» (Przemyl, 2015), XIV-XXV международной заочной научно-
практической конференции «Научная дискуссия: вопросы математики,
физики, химии, биологии» (Москва, 2015), конференции «Интеграция
мировых научных процессов как основа общественного прогресса» (Казань,
2015), научной конференции «Современный научный потенциал, (Шеффилд,
2015), XVIII международной научно-практической конференции
«Актуальные вопросы науки» (Москва, 2015), международной научно-практической конференции « Теоретические и практические вопросы науки XXI века», (Уфа, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано двадцать печатных работ, в том числе две статьи в отраслевых журналах, рекомендованных ВАК. Поданы две заявки на получение патента Российской Федерации (№ 2014150635 «Способ получения биоконсерванта»; № 2015115875 «Способ увеличения срока хранения свежих овощей и фруктов»).
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из следующих основных разделов: введение, аналитический обзор, методика выполнения работы, результаты исследования и их обсуждение, практическая реализация результатов исследований, выводы и результаты, список использованных источников и приложения. Основное содержание работы изложено на 125 страницах машинописного текста, содержит 44 таблиц и 25 рисунков. Список литературы включает 181 наименований. В приложениях к диссертации приведены материалы, подтверждающие научную новизну и практическую значимость результатов исследований.
Свойства, механизм действия и классификация бактериоцинов, продуцируемых бактериями
Известно, что на свежих фруктах и овощах содержится большое количество микроорганизмов. Микроорганизмы, населяющие овощи и фрукты, значительно различаются в зависимости от части растения, так, микрофлора растений в их надземной части отличается от микрофлоры корневой системы. Плотность микроорганизмов в основном зависит от естественной изменчивости продукта и составляет в среднем от 103 - 107. Значения могут варьироваться в зависимости от многочисленных фактов, таких как урожай, погодные условия, почвы. Кроме того, другим источником изменений является то, что микроорганизмы быстрее растут на поврежденных поверхностях овощей и фруктов, чем на неповрежденных поверхностях [90].
Молочнокислые бактерии (например, Lactobacillus), Pseudomonas, Erwinia, Pantoea, Micrococcus, Flavobacterium и грамположительные спорооб-разующме бактерии (например, Bacillus. Clostridium), как правило, являются доминирующими бактериями в свежих фруктах и овощах. Кроме того, различные типы бактерий, таких как Alternaria, Penicillium, Aspergillus, Fusarium, также могут быть найдены в больших количествах. Наконец, Torulopsis дрожжи, Saccharomyces и Candida являются частью доминирующей микроорганизмов особенно в тех фруктах, которые имеют высокое содержание сахара. Свежие фрукты и овощи могут быть также колонизированы патогенными микроорганизмами, такими как бактерии, вирусы и паразиты простейших [77]. Основные характеристики минимально обработанных овощей, влияю-щие на развитие микробной порчи включают в себя: – наличие разреза и повышенной влажности; – активного метаболизма тканей растений; – все методы обработки, которые не могут обеспечить стерильность или микробную стабильность продукта [58].
Микроорганизмы влияют на экономическую ценность минимально обра-ботанных продуктов, уменьшают срок годности продукта и создают риск для здоровья населения. Основные источники бактериального загрязнения, влияющие на качество и безопасность конечного продукта присутствуют даже до посадки урожая. Эти источники включают в себя характеристики почвы, где патогенные микроорганизмы, такие как листерии, могут выжить в течение трех или более месяцев, диких и домашних животных, орошение водой, использование навоза в качестве удобрений, недостаточное количество работников, температура этой области [103].
Надо отметить, что во время обработки и упаковки причиной появления микроорганизмов является антисанитарное обращение при сортировке, использование различного оборудования (транспортные средства), неправильной температуры при хранении, неправильной упаковки или перекрестного загрязнения при хранении. Особое внимание должно быть обращено на готовые к использованию овощи, производство которых выросло в связи с постоянно растущим спросом на свежие, здоровые и удобные продукты. Международная ассоциация свежих продуктов (IFPA) производит свежие очищенные фрукты и овощи и утверждает, что 100 % полезной продукции содержится в мешках или специальной упаковке. Они уверяют, что предлагают потребителям высокока-чественное питание, сохраняя при этом молочнокислые бактерии, в качестве биозащитных агентов [71]. Из литературных источников [133,136,174] известны патогенные микроорганизмы, вызывающие порчу свежих фруктов и овощей. Свежие продукты и минимально обработанные свежие продукты обеспечивают благоприятные условия для распространения микроорганизмов, вызывающих порчу и имеют значение для общественного здравоохранения. Значительное увеличение количества фруктов и овощей, вызывающих болезни пищевого происхождения, было обнаружено в последние годы. Основные патогенные микроорганизмы свежих фруктов и овощей приведены в таблице 1.1.1.
Несколько патогенов, таких как грамотрицательные бактерии Aerotnonas hydrophyla, Esherishia coli, Salmonella sp., Shigella sp., Plesiomonas shigelloides, Vibrio cholera и грамположительные Listeria monocytogenes, Staphylococcus au-reus, Clostridium botuliuuni и Bacillus ceirus были выделены из свежих продуктов и могут иметь серьезное санитарное значение. Тем не менее, сам факт наличия патогенных бактерий не всегда означает, что они будут являться причиной болезни. Несмотря на широкий спектр продуктов, из которых патогенные бактерии были выделены, лишь немногие из них были утверждены в качестве возбудителей пищевых заболеваний [113].
В соответствии с имеющейся информацией, известно, что E. coli 0157:H7, является главным возбудителем пищевых заболеваний и быстро растет в нескольких типах сырых фруктов и овощей, особенно при хранении при температуре более 10 С. Инфекционная доза этого возбудителя является довольно низкой, от 10 до 700 жизнеспособных клеток. Так как крупный рогатый скот, является основным источником этой бактерии, большинство вспышек заболеваний, связанных с E. coli 0157: H7 были связаны с потреблением недоваренной говядины и молочных продуктов. Тем не менее, имеются данные, что вспышки также были связаны с употреблением салата, непастеризованного яблочного сидра, дыни и капусты [90].
Заключение по обзору литературы, цель и задачи исследования
Учитывая высокую чувствительность микроорганизмов к антибиотикам первой группы и менее выраженную чувствительность ко второй группе антибиотиков, подавляющих грамотрицательные микроорганизмы, сделали вывод, что выделенные микроорганизмы действительно принадлежат к грамположительным штаммам. Все изучаемые штаммы также проявили чувствительность к антибиотикам, нарушающим синтез клеточной стенки бактерий – -лактамным антибиотикам (бензилпенициллин, ампициллин).
Одними из важных свойств некоторых штаммов микроорганизмов являются антимикробные свойства, которые обусловлены образованием вторичных метаболитов: органических кислот, этанола, диацетила, перекиси водорода и белковых соединений, которые известны как бактериоцины [2, 3].
Исследовали антагонистическую активность выделенных штаммов и их метаболитов по отношению к патогенным штаммам, вызывающим порчу фруктов и овощей. Результаты представлены в таблице 3.1.5 и на рисунке 3.1.7.
Из данных, представленных в таблице 3.1.5 и на рисунке 3.1.6, видно, что штамм Bacillus licheniformis проявил антагонистическую активность против: Arth-robacter cumminsii, Staphylococcus aureus, Alcaligenes faecalis, Escherichia coli, Er-winia aphidicola, Salmonella enterica, Yersinia spp. Штамм микроорганизмов Bacillus safensis подавлял рост следующих бактерий: Pseudomonas fluorescens, Escheri-chia coli, Enterobacter ludwigii, Salmonella enterica, Yersinia spp., Staphylococcus au-reus ATCC 25923 и микрококков: Micrococcus luteus. Из результатов анализа следует, что штаммы Bacillus licheniformis и Bacillus safensis подавляли рост большинства патогенных микроорганизмов и, таким образом, обладали более широким спектром антагонистической активности. Данные штаммы подавляли рост грамположительных и грамотрицательных бактерий. Выделенный штамм микроорганизмов Bacillus endophyticus являлся антагонистом по отношению к следующим штаммам: Alcaligenes faecalis, Yersinia spp., Staphylococcus aureus. Штамм Bacillus pumilus подавлял развитие Leuconostoc mesenteroides, Enterobacter ludwi-gii, Salmonella enterica, Yersinia spp., Staphylococcus aureus.
Антимикробная активность микроорганизмов, во многом проявляется за счет продуцирования микроорганизмами органических кислот, этанола, диацети-ла, перекиси водорода. Данные вещества способны оказывать антимикробное действие против некоторых штаммов микроорганизмов.
Известно, что антимикробная активность штаммов микроорганизмов проявляется не только за счет вышеперечисленных вторичных метаболитов, но и за счет бактериоцинов. Бактериоцины – это гетерогенные антибактериальные комплексы, разнообразные по уровню активности, спектру и механизму действия, молекулярной массе, физико-химическим свойствам, основной биологически активной частью всех бактериоцинов является белковый компонент. Бактериоцины являются перспективными для изучения антимикробными компонентами и представляют интерес для разработки биоконсерванта. Важно отметить, что другие метаболиты, которые продуцируются бактериями, помимо бактериоцинов, могут также оказывать антимикробное действие, в связи с этим, наиболее точные данные об уровне активности бактериоцинов, можно получить при нейтрализации остальных метаболитов. Таким образом, для определения антимикробной активности бактериоцинов использовали метод анализа в жидкой питательной среде. В качестве контроля использовали суспензию патогенного штамма в чистой питательной среде. Результаты исследования антимикробной активности выделенных штаммов в жидкой питательной среде представлены на рисунках 3.1.7 – 3.1.10.
Данные, приведенные на рисунках 3.1.7 – 3.1.10, свидетельствуют о том, что все штаммы ингибировали рост Pseudomonas fluorescens (от 53 до 88 %). Сильную антагонистическую активность проявили штаммами Bacillus pumilus и Bacillus en-dopheticus по отношению к Arthrobacter cumminsii и Staphylococcus aureus (от 55 до 85 %). Bacillus licheniformis, Bacillus endopheticus, Bacillus safensis показывают сильную ингибирующую активность по отношению к Micrococcus luteus и Listeria monocytogenes (от 55 до 91 %). Штаммы Bacillus endopheticus и Bacillus safensis проявили значительное ингибирование Yersinia spp., Escherichia coli (от 54 до 76 %). Все изоляты проявили степень ингибирования от 28 до 49 % по отношению к Enterobacter ludwigii и Erwinia aphidicola, соответственно.
Необходимо отметить, что все выделенные штаммы, кроме Bacillus licheni-formis, проявили антагонистическую активность по отношению к Salmonella ente-rica от 25 до 38 %, в то время как Bacillus licheniformis не ингибировал рост Salmonella enterica. Штаммы Bacillus safensis, Bacillus endopheticus, Bacillus licheni-formis подавляли развитие Alcaligenes faecalis (52-54 %). Небольшую активность против штамма Pseudomonas aeruginosa проявили штаммы Bacillus endophyticus (18 %) и Bacillus pumilus (30 %).
Объекты исследований
При изучении антимикробной активности штамма Bacillus pumilus наблюдалась задержка роста у таких патогенных штаммов как: Leuconostoc mesente-roides, Escherichia coli, Enterobacter ludwigii, Salmonella enterica, Yersinia spp., Staphylococcus aureus. Размер зон задержки роста составлял 9 – 10 мм.
Второй метод выделения бактериоцинов заключался в высаливании сульфатом аммония, с последующим центрифугированием и промыванием в ацетатном буфере. Результаты определения антимикробной активности бактерио-цинов, выделенных данным методом, представлены в таблице 3.3.2.
По результатам анализа данных, приведенных в таблице 3.3.2, заключили, что штамм Bacillus endophyticus подавлял рост трех патогенных штаммов: Alca-ligenes faecali, Yersinia spp., Staphylococcus aureus, с образованием зон ингиби-рования 10 – 11 мм.
Штамм Bacillus safensis активен по отношению к следующим штаммам Pseudomonas fluorescens, Candida albicans, Arthrobacter cumminsii, Alcaligenes faecalis, Escherichia coli, Enterobacter ludwigii, Erwinia aphidicola, Micrococcus luteus, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus. Проявленная данным штаммом активность выражалась в образовании зон ингиби-рования в размере 14 – 18 мм.
Штамм Bacillus pumilus ингибировал рост Leuconostoc mesenteroides, Enerobacter ludwigii, Salmonella enterica, Yersinia spp., Staphylococcus aureus, с образованием зон задержки роста от 10 до 11 мм.
Штамм Bacillus licheniformis был активен по отношению к штаммам Arth-robacter cumminsii, Alcaligenes faecalis, Escherichia coli, Erwinia aphidicola, Salmonella enterica, Yersinia spp., Staphylococcus aureus, зоны задержки роста ва-риьировались от 9 до 11 мм.
Третий метод анализа позволил выделять бактериоцины, продуцируемые бактериальными клетками, путем добавлении хлороформа с дальнейшим их отделением, центрифугированием и ресуспендированием в буфере Tris-HCl. Результаты исследований, полученные этим методом, представлены в таблице 3.3.3.
При анализе данных, представленных в таблице 3.3.3, пришли к выводу о том, что штамм Bacillus safensis подавлял развитие большинства патогенных штаммов, таких как Pseudomonas fluorescens, Candida albicans, Arthrobacter cum-minsii, Escherichia coli, Enterobacter ludwigii, Erwinia aphidicola, Micrococcus luteus, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus. Зоны ин-гибирования роста данных патогенных штаммов варьировались в зависимости от вида штамма и составили 13 – 15 мм.
Штамм Bacillus endophyticus проявил активность против штаммов Alcali-genes faecali, Yersinia spp., Staphylococcus aureus. Зоны ингибирования составили 8 – 9 мм, что свидетельствует о низкой активности данного штамма, по сравнению с антимикробной активностью, проявленной штаммом Bacillus sa-fensis. При изучении активности штамма Bacillus pumilus выявили антимикробное действие, проявленное по отношению к нескольким патогенным штамма: Leuco-nostoc mesenteroides, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus. Зоны задержки роста данных микроорганизмов начинались от 8 мм и не превышали 9 мм. Штамм Bacillus licheniformis ингибировал рост Alcaligenes faecalis, Escherichia coli, Erwi-nia aphidicola, Yersinia spp. Staphylococcus aureus, с образованием зон ингибиро-вания 9 мм, что является значительно ниже показателя активности штамма Bacillus safensis.
. По результатам, приведенным таблицах 3.3.1 – 3.3.3, пришли к выводу о том, что наиболее высокая антимикробная активность проявлена бактериоцинами штаммов Bacillus safensis, Bacillus endophyticus, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, выделенных вторым методом, основанном на высаливании сульфатом аммония. Наиболее низкая антимикробная активность наблюдалась при выделении бактериоцинов третьим методом, основанным на экстракции хлороформом. Исходя из полученных результатов для дальнейшего выделения бактериоцинов выбрали метод высаливания сульфатом аммония.
При выделении бактериоцинов, с использованием трех исследуемых методов выделения, бактериоцины штаммов Bacillus endophyticus , Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis не проявили антимикробной активности по отношению ко многим патогенным штаммам. Вышеперечисленные штаммы рода Bacillus проявили антогони-стичекую активность по отношению к нескольким патогенным штаммов микроорганизмов, но, при этом, наблюдаемые зоны ингибирования были не значительными. Это свидетельствует о том, что в предыдущих исследованиях, данные штаммы проявляли антимикробную активность в основном за счет дополнительных метаболитов, в то время как сами бактериоцины этих штаммов не обладали выраженными антимикробными свойствами. При этом бактериоцины штамма Bacillus safensis обладали значительными антагонистическими свойствами при использовании всех трех методов выделения. Таким образом, для дальнейшего исследования выбрали штамм Bacillus safensis, который проявлял наиболее высокую антагонистическую активность, и являлся наиболее перспективным для производства биоконсерванта для увеличения сроков хранения свежих плодов и овощей.
Свойства томатов, обработанных биоконсервантом
Процесс обработки состоял из восьми последовательных этапов. На начальном этапе проводили сортировку сырья, мойку и сушку в теплом потоке воздуха при температуре 20±2 С в течение 3 мин. Следующий этап включал разведение биоконсерванта в воде, концентрация 4 мл/л. Далее осуществляли погружение томатов в раствор биоконсерванта, при температуре 20±2 С, в течение 60 сек. Следующий этап включал сушку при температуре 20±2 С в течение 3 мин. На заключительном этапе проводили упаковку в мешки из полимерных и комбинированных материалов и осуществляли хранение при 4±2 С в течение 30 сут.
На первом этапе обработки проводили сортировку свежих томатов, затем осуществляли мойку томатов и их сушку при 20±2 С в течение 3 мин. Консервант разводили в воде при концентрации 4 мл/л и наносили методом распыления при температуре 18±2 С, продолжительность обработки 30-60 сек. После нанесения биоконсерванта проводили повторную сушку томатов при температуре 20±2 С в течение 3 мин и осуществляли их упаковку в мешки из полимерных и комбинированных материалов. Томаты хранят при температуре 4±2 С в течение 39 сут.
Для оценки качества томатов, после проведения их обработки провели исследование органолептических свойств, микробиологических свойств и показателей безопасности. Оценку органолептических показателей томатов проводили в соотвествии нормами ГОСТ 1725-85 «Томаты свежие. Технические условия». Ор-ганолептические характеристики томатов после обработки методом распыления и погружения приведены в таблицах 4.4.1 и 4.4.2, соответственно.
По результатам экспериментальных данных, приведенных в таблице 4.4.1, сделали следующие выводы. При хранении томатов, обработанных биоконсервантом методом распыления, в течение 39 суток, наблюдали характерные для свежих томатов свойства, такие как характерный приятный вкус, без посторонних привкусов, яркий красный цвет, без наличия гнилостных образований, приятный запах, плотная структура. На 51 сутки исследований наблюдали признаки порчи, выраженные в наличие неприятного вкуса, тусклом цвете томатов, с наличием гнилостных образований, неприятного запаха и несвойственной томатам водянистой структуры.
При анализе данных, приведенных в таблице 4.4.2, пришли к выводу, что при хранении томатов, обработанных биоконсервантом методом погружения, изменение органолептических показателей томатов наблюдалось уже на 35 сутки хранения и сопровождалось возникновением признаков, характерных для испорченных томатов.
Провели изучение проказателей безопасности и микробиологических свойств томатов в соответствии с нормами СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов». Результаты, полученные при исследовании микробиологических свойств томатов, представлены в таблицах 4.4.3 – 4.4.4. По результатам анализа данных, приведенных в таблицах 4.4.3-4.4.4, установили что при хранении обработанных томатов, микробиологичексие пока 116 затели варьировались в пределах норм в течение 30 суток. Превышение норм, установленных СанПиН 2.3.2.1078-01 (содержание дрожжей и плесеней - 1102 КОЕ/г и показатель КМАФАнМ - 1104 КОЕ/г), наблюдалось при продолжительности хранения 35 сут.
Микробиологическитй анализ томатов, обработанных методом распыления, позволил выявить, что показатель КМАФАН и содержание дрожжей и плесеней, превысили допустимые нормы, установленные СанПиН на 45 сутки хранения. Из этого следует, что при нанесении биоконсерванта методом распыления, сроки хранения томатов составили 39 сут, а при их обработке методом погружения – 30 сут, как и предустмотрено в технологических схемах.
Для изучения показателей безопасности томатов исследовали содержание токсичных элементов и радионуклеидов, пестицидов и нитратов. Результаты исследования показателей безопасности томатов, приведены в таблице 4.4.5.
По результытам, приведеным в таблице 4.4.5, сделали вывод о том, что показатели безопасности томатов, при их обработке разработанными методами, не превышали допустимых норм. Из этого следует, что разработанные методы обработки томатов биоконсервантом являются эффективными и возможно их использование на производстве.
На последнем этапе исследований провели расчет экономической эффективности разработанного продукта. Экономическую эффективность биоконсерванта рассчитывали по нормативным расценкам на 01.11.2016.
Для последующей оценки экономической эффективности производства биоконсерванта проведен расчет суммарных затрат на сырье и на основные материалы для получения 1 л биоконсерванта. Результаты расчета представлены в таблице 4.5.1. В связи с тем, что для производства биоконсерванта необходимо осуществлять очистку культуральной жидкости, необходимо провести расчет затрат на очистку биоконсерванта. Затраты по статьям калькуляции на производство продукции учитываются при формировании себестоимости биоконсерванта. Необходимо осуществить конечный расчет себестоимости для производства 1 л биоконсерванта, с учетом затрат на оборудование и энергию. Результаты, полученные при оценке структуры себестоимости биоконсерванта, приведены в таблице 4.5.2.