Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Нейротоксические поражения как результат острой и хронической алкогольной интоксикации (обзор литературы) 14
1.1. Нейротоксичность и нейротоксиканты (основные понятия) 14
1.2. Этанол как нейротоксикант
1.2.1. Механизмы нейротоксического действия этанола при остром воздействии 21
1.2.2. Механизмы нейротоксического действия этанола при хроническом воздействии
1.3. Моделирование нейротоксических процессов в эксперименте на животных 31
1.4. Лекарственные препараты - потенциальные средства фармакологической коррекции нейротоксических эффектов этанола
1.4.1. Фармакологические эффекты пикамилона 36
1.4.2. Фармакологические эффекты ноопепта 38
1.4.3. Фармакологические эффекты мемантина 41
1.5. Патоморфологические изменения в головном мозге при остром
отравлении этанолом 43
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 47
2.1. Животные и их содержание 47
2.2. Токсические агенты и фармакологические препараты 48
2.3. Определение токсикометрических параметров этанола 49
2.4. Моделирование и оценка степени выраженности острого отравления этанолом 49
2.5. Методы оценки поведения, когнитивных функций и неврологических показателей животных 50
2.5.1. Методы оценки поведения и двигательной функции з
2.5.2. Методы оценки состояния памяти и обучения 52
2.5.3. Методы оценки болевой чувствительности
2.6. Схема экспериментов по оценке влияния острого отравления этанолом и средств фармакологической коррекции на поведение и неврологические показатели крыс 54
2.7. Патоморфологические исследования головного мозга крыс подвергшихся острому отравлению этанолом на фоне и без предварительной алкоголизации 56
2.8. Статистическая обработка результатов 57
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 58
3.1. Определение токсикометрических параметров этанола и экспериментальная оценка выраженности острого отравления этанолом 58
3.1.1. Токсикометрические параметры этанола у крыс 58
3.1.2. Экспериментальная оценка выраженности острого отравления этанолом 59
3.2. Оценка поведенческих, неврологических и патоморфологических нарушений у крыс после тяжёлой формы острого отравления этанолом 62
3.2.1. Поведение и двигательная активность 62
3.2.2. Нейромоторные функции 64
3.2.3. Память и обучение 65
3.2.4. Болевая чувствительность 66
3.2.5. Патоморфологические исследования головного мозга крыс, перенёсших тяжёлую форму острого отравления этанолом 67
3.3. Оценка поведенческих, неврологических и патоморфологических нарушений у крыс, перенёсших тяжёлую форму острого отравления этанолом на фоне предварительной алкоголизации 73
3.3.1. Поведение и двигательная активность 73
3.3.2. Нейромоторные функции 76
3.3.3. Память и обучение 78
3.3.4. Болевая чувствительность 82
3.3.5. Патоморфологические исследования головного мозга крыс, хронически алкоголизированных и крыс перенёсших тяжёлую форму острого отравления этанолом на фоне предварительной алкоголизации... 83
3.4. Фармакологическая коррекция неиротоксических поражений у крыс после тяжёлой формы острого отравления этанолом 91
3.4.1. Фармакологическая коррекция нарушений поведения и двигательной функции 91
3.4.2. Фармакологическая коррекция нарушений памяти и обучения96
3.4.3. Фармакологическая коррекция процессов ноцицепции 99
3.5. Фармакологическая коррекция нарушений когнитивных функций у крыс после тяжёлой формы острого отравления этанолом на фоне предварительной алкоголизации 101
3.5.1. Фармакологическая коррекция нарушений условной реакции активного избегания плавания 102
3.5.2. Фармакологическая коррекция нарушений условной реакции пассивного избегания электроболевого раздражения 104
Заключение 108
Выводы 127
Научно-практические рекомендации 129
Список сокращений 130
Список литературы
- Механизмы нейротоксического действия этанола при хроническом воздействии
- Определение токсикометрических параметров этанола
- Оценка поведенческих, неврологических и патоморфологических нарушений у крыс после тяжёлой формы острого отравления этанолом
- Фармакологическая коррекция неиротоксических поражений у крыс после тяжёлой формы острого отравления этанолом
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Высокий уровень алкоголизации населения в России является причиной большого количества острых отравлений алкоголем и его суррогатами, регистрируемых в последнее десятилетие [Заиграев Г.Г., 2009; Бонитенко Е.Ю., Бони-тенко Ю.Ю., 2010]. Особенно важным является изменение структуры алкогольных отравлений в сторону преобладания у лиц среднего и молодого возраста, а также увеличение числа подобных отравлений у детей [Альбицкий В.Ю. и др., 2010; Барачевский Ю.Е. и др., 2011]. По данным детского токсикологического центра г. Москвы, на долю острых отравлений алкоголем у детей приходится 21 % от общего количества госпитализаций [Лужников Е.А., Суходолова Г.Н., 2013]. В результате применения комплекса эффективных лечебных мероприятий летальность больных с острой алкогольной интоксикацией в специализированных центрах по лечению острых отравлений, как правило, не превышает 1-2% [Лужников Е.А. и др., 2008, 2012], в то же время по числу смертельных исходов на догоспитальном этапе алкогольные отравления в течение многих лет занимают ведущее место среди бытовых отравлений в нашей стране [Бонитенко Ю.Ю., 2003, 2005; Остапенко Ю.Н. и др., 2008; Шилов В.В. и др., 2008; Шабанов П.Д., 2012].
Наряду со значительной смертностью при невозможности оказания своевременной медицинской помощи серьёзным последствием перенесённого острого тяжёлого отравления алкоголем являются нарушения функций различных тканей и органов, проявляющиеся на поздней, соматогенной стадии интоксикации [Лужников Е.А., Остапенко Ю.Н., Суходолова Г.Н., 2001]. Следует отметить, что нейротоксические поражения, как последствия тяжёлой формы острого отравления алкоголем, существенно влияющие на социальный статус и качество жизни этой категории больных, в том числе, являющиеся причиной их ин-валидизации, изучены явно недостаточно. Поэтому исследование динамики развития различных проявлений нейротоксического действия этанола в эксперименте определяет актуальность настоящего исследования с учётом последующего использования полученных данных в токсикологической клинике.
Этанол является политропным ядом, поскольку его токсическое действие на нервные ткани обусловлено комплексом факторов, включая изменение физико-химических свойств липидов мембран нервных клеток и внутриклеточных образований и связанное с этим изменение активности регуляторных белков и ионных каналов - компонентов ряда медиаторных систем головного мозга. В частности, в последние годы внимание исследователей привлечено к участию глутаматергической системы мозга в формировании патологических процессов при острой и хронической алкогольной интоксикации [Беспалов А.Ю., Звартау Э.Э., 2000; Долго-Сабуров В.Б. и др., 2011]. В связи с этим представляет интерес изучения влияния лекарственных препаратов, связанных с глутаматергической медиацией, в частности антагониста NMDA-рецепторов мемантина, на выраженность нейротоксических поражений, как последствий острого отравления этанолом в условиях хронической алкогольной интоксикации [Гладких
В.Д. и др., 2007; Руденко А.А. и др., 2009]. Учитывая, что одним из проявлений нейротоксичности этанола является нарушение когнитивных функций, следует считать перспективным использование в качестве нейропротекторов препаратов ноотропного действия с целью фармакологической коррекции последствий острой алкогольной интоксикации [Васильев С.А., 2008; Башарин В.А., Иванов М.Б., 2008]. По современным представлениям, к ноотропам относится большое количество препаратов, представляющих различные группы химических веществ. Среди них следует выделить соединения - производные у-аминомасляной кислоты (ГАМК), для одного из которых (пикамилон) установлена лечебная эффективность в комплексной терапии острой алкогольной интоксикации [Ковлер М.А. и др., 1997; Белова Е.И., 2006; Анцыперов В.В., 2008]. Препарат из группы регуляторных пептидов - ноопепт, наряду с ноотропным, обладает нейропротективным и нейромодулирующим действием, а также высокой биодоступностью для тканей мозга [Островская Р.У., 2002, 2009; Стуров Н.В., 2012], что обосновывает его изучение, как средства фармакологической коррекции нейротоксических последствий алкогольных отравлений.
Исследование влияния препаратов из перечисленных фармакологических групп на скорость восстановления нарушенных функций ЦНС в соматогенной стадии острой алкогольной интоксикации и интоксикации на фоне предшествующей алкоголизации является актуальным, поскольку позволит сформулировать рекомендации для их последующего использования в комплексной терапии острых алкогольных отравлений и их отдалённых последствий.
Степень разработанности темы диссертационного исследования
В доступной нам отечественной и зарубежной литературе исследования по экспериментальному моделированию последствий нейротоксических поражений, наблюдающихся в соматогенной стадии тяжёлой формы острого отравления, встречаются в единичном количестве. Практически отсутствуют экспериментальные работы по изучению поражений функций центральной и периферической нервной системы у животных с острым отравлением этанолом на фоне предшествующей хронической алкоголизации. Весьма ограничены данные по доклиническим исследованиям лекарственных препаратов, как средств фармакологической коррекции и восстановления нарушенных функций в отдалённом периоде острого отравления этанолом. Всё указанное позволило сформулировать цель и задачи настоящей работы.
Цели и задачи исследования
Изучить характер и выраженность нейротоксических поражений у крыс после тяжёлой формы острого отравления этанолом и обосновать возможность фармакологической коррекции выявленных нарушений.
Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:
1. Обосновать алгоритм экспериментального моделирования тяжёлой
формы острого отравления этанолом у крыс с целью последующей оценки нев
рологических нарушений, наблюдающихся в соматогенной стадии алкогольной
интоксикации.
2. Провести сравнительное изучение последствий острого тяжёлого от
равления этанолом и острого отравления на фоне предварительной алкоголиза-
ции (ежедневное внутрижелудочное введение этанола в течение месяца) на структуру поведения, состояние нейромоторной функции, память и обучение, а также болевую чувствительность белых крыс.
3. Осуществить патоморфологическое исследование головного мозга
крыс, перенёсших тяжёлую форму острого отравления этанолом и острого от
равления этанолом на фоне предварительной алкоголизации.
4. Изучить влияние фармакологических препаратов: пикамилона, ноопеп-
та и мемантина на динамику восстановления нарушенных функций нервной
системы, как последствий токсического действия этанола.
Научная новизна исследования
В работе с помощью использованной батареи тестов осуществлена комплексная оценка поведения, двигательной активности, состояния координации движений, мышечной силы, когнитивных функций и процессов болеощущения у крыс, перенёсших тяжёлую форму острого отравления этанолом. В результате проведённых исследований охарактеризована и сопоставлена выраженность и продолжительность нейротоксических нарушений, проявлявшихся после острого периода алкогольной интоксикации у экспериментальных животных с однократным воздействием токсической дозы этанола, и у крыс, подвергнутых предварительной алкоголизации.
Показано, что у крыс, перенёсших тяжёлую форму острого отравления этанолом, наряду с угнетением двигательной активности и сложных форм поведения (исследовательская активность, уровень мотивации, пространственная ориентация) отмечалось ухудшение способности животных к приобретению и сохранению навыка активного и пассивного избегания аверсивного стимула, свидетельствующее о нарушении процессов памяти и обучения. Выявленные изменения функций головного мозга под влиянием этанола, в конечном итоге, могут лежать в основе когнитивных нарушений и снижения психической работоспособности в отдалённом периоде интоксикации.
Проведена оценка эффективности и обоснована возможность использования фармакологических препаратов, обладающих нейропротективной: ноо-тропной и нейромодулирующей активностью (пикамилон, ноопепт) и влияющих на глутаматергическую медиацию (мемантин) в качестве средств фармакологической коррекции нейротоксических поражений как последствий острого отравления этанолом.
Практическая и теоретическая значимость работы
Предложены методические подходы, позволяющие осуществить объективную количественную оценку состояния поведения, двигательной, когнитивной и сенсорной функций экспериментальных животных, которые могут быть использованы при доклинической оценке лекарственных средств, предназначенных для фармакологической коррекции нейротоксических поражений и восстановления нарушенных функций ЦНС у лиц, перенёсших тяжёлые отравления алкоголем.
Обосновано применение препаратов, обладающих нейропротективным действием: производного никотиновой и у-аминомасляной кислоты пикамилона
и дипептидного препарата ноопепта и их сочетания для коррекции нейротокси-ческих поражений в соматогенной стадии острого отравления этанолом.
Проанализирована эффективность курсового введения пикамилона, ноопепта и блокатора NMDA-рецепторов мемантина при экспериментальной терапии последствий острого отравления этанолом на фоне предварительной алкоголизации.
Полученные в работе данные об эффективности исследованных лекарственных препаратов, выпускаемых фармацевтическими предприятиями Российской Федерации и разрешённых к медицинскому применению в стране, являются обоснованием для их включения в схемы лечебных и реабилитационных мероприятий после алкогольных отравлений.
Методология и методы исследования
Методология исследования состояла в моделировании последствий острой алкогольной интоксикации у крыс (на интактных животных и на фоне предварительной алкоголизации), оценённых в батарее тестов («открытое поле», крестообразный лабиринт, вращающийся стержень, сила хватки, условная реакция пассивного избегания, условная реакция активного избегания плавания, болевые тесты - Tail Flick и механического отдёргивания лапы), с последующей оценкой сроков и степени восстановления нарушенных функций. Также с помощью данной батареи тестов была определена степень и выраженность фармакологической коррекции выбранными препаратами (пикамилон, ноопепт, мемантин). Исследования выполнены в соответствии с соблюдением всех правил доказательной медицины.
Положения, выносимые на защиту
-
Последствием тяжёлой формы отравления этанолом белых крыс являются нейротоксические поражения, приводящие к нарушениям поведения, двигательной функции, процессов памяти, обучения и ноцицепции, регистрируемые в течение нескольких суток после исчезновения у экспериментальных животных признаков острой интоксикации.
-
Ежедневное внутрижелудочное введение крысам субтоксических доз этанола в течение месяца приводит к развитию поведенческих, неврологических и когнитивных нарушений, выраженность которых существенно увеличивается в результате острого отравления этанолом предварительно алкоголизи-рованных животных. При этом в особенности страдают процессы приобретения и сохранения выработанного навыка.
-
Перспективным подходом к коррекции нейротоксических поражений после тяжёлой формы острого отравления этанолом является использование фармакологических препаратов, обладающих нейропротективным - ноотроп-ным, нейромодулирующим и нейромедиаторным действием и их сочетаний.
Степень достоверности и апробация результатов
Степень достоверности определяется достаточным количеством экспериментальных животных использованных в исследовании, рандомизацией и формированием групп сравнения и контроля, адекватными поведенческими, токсикологическими и фармакологическими моделями и методами исследования,
длительными сроками наблюдения и корректными методами статистической обработки.
Результаты проведённых исследований были доложены и обсуждены на Российской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы токсикологии и радиобиологии» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской молодёжной конференции-школы «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийском симпозиуме, посвященном 50-летию со дня основания ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России «Медико-биологические аспекты обеспечения химической безопасности Российской Федерации» (Санкт-Петербург, 2012); VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2012); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы радиационной медицины и промышленной токсикологии» (Красноярск, 2012); IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); Научно-практической конференции, посвященной 20-летию ФГУП НПЦ «Фармзащита» ФМБА России «Состояние и перспективы развития средств медицинской защиты от экстремальных факторов» (Москва, 2012); Всероссийской научной конференции молодых ученых «Медико-биологические аспекты химической безопасности» (Санкт-Петербург, 2013); Научно-практической конференции «Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации» (Республика Узбекистан, Ташкент, 2013); IV съезде токсикологов России с международным участием (Москва, 2013); Всероссийской конференции молодых ученых «Нейробиология интегративных функций мозга» (Санкт-Петербург, 2013); I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации» (Санкт-Петербург, 2013). Материалы, вошедшие в диссертацию, также были доложены на Санкт-Петербургском обществе токсикологов (Санкт-Петербург, 2012).
Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения
Работа выполнена в соответствии с задачами научно-исследовательской
работы «Поиск» (тема «Разработка и обоснование методологии клинической,
химико-токсикологической, судебно-медицинской диагностики и лечения от
равлений веществами депримирующего действия» (клинико-
экспериментальное исследование)) входящей в Федеральную целевую про
грамму «Национальная система химической и биологической безопасности
Российской Федерации (2009-2013 гг.)».
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, включает 21 таблицу, 30 рисунков. Состоит из введения, четырёх глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследова-
ний, заключение), выводов, научно-практических рекомендаций и библиографического списка литературы, включающего 219 источников (123 - на русском языке и 96 - на иностранных языках).
Механизмы нейротоксического действия этанола при хроническом воздействии
Нейротоксичность - это свойство химических веществ, действуя на организм немеханическим путём, вызывать нарушение структуры и/или функций нервной системы [Куценко С.А., 2004]. По мнению P.J. Landrigan с соавторами способностью вызывать неблагоприятные функциональные или структурные изменения в нервной системе обладают также биологические и физические агенты [Landrigan P.J. et al., 2005].
В основе развивающегося токсического процесса может лежать повреждение любого структурного элемента нервной системы путём модификации пластического и энергетического обменов, нарушения генерации, проведения нервного импульса по возбудимым мембранам, передачи сигнала в синапсах. Практически любая острая интоксикация в той или иной степени сопровождается нарушениями функций нервной системы. Вещества, для которых порог чувствительности собственно нервной системы (отдельных её гистологических и анатомических образований) существенно ниже, чем других органов и систем, и в основе интоксикации которыми лежат нарушения моторных, сенсорных функции, памяти, мышления, эмоций, поведения, относят к нейротоксикантам, даже если не известны механизмы их токсического действия [Голиков С.Н., Саноцкий И.В., Тиунов Л.А., 1986; Куценко С.А., 2004; Федотова И.Н. и др., 2013].
Несмотря на то, что ЦНС и периферическая нервная система определённым способом защищены гистогематическими барьерами, они остаются потенциально доступными к токсическим повреждениям. Уязвимость нервной системы для повреждающего действия токсикантов обусловлена следующими факторами [Rosenstock L. et al., 2005]: - высокий уровень кровоснабжения нервных тканей, особенно ЦНС, увеличивает чувствительность к циркулирующим токсикантам; - нейроны и их отростки (аксоны и дендриты) имеют большую площадь поверхности, что значительно увеличивает площадь контакта нейрона с окружающей его средой, увеличивая уязвимость клеток для токсического повреждения; - высокий уровень метаболизма нейронов определяет их особую подверженность дефициту энергии и поступлению питательных веществ; - большое содержание липидов в нервных тканях (особенно в мембранных структурах) приводит к накоплению и к сохранению в них липофильных ксенобиотиков-токсикантов; - токсиканты могут вмешиваться в процессы нормальной нейромедиации и имитировать структуры эндогенных молекул - лигандов рецепторов нейромедиаторов; - восстановление последствий токсических повреждений структур нервной системы, в частности, синаптических контактов, может происходить не полностью и в длительные сроки; - относясь к постмитотическим образованиям, нейроны неспособны к делению, и поэтому их гибель приводит к относительно стойким последствиям.
Нейротоксиканты, как и другие ксенобиотики, могут попадать в организм ингаляционно, через рот или кожу, некоторые из них могут действовать несколькими путями. В большинстве случаев неполярные, хорошо растворимые в липидах токсиканты имеют самую большую доступность к нервной системе. Важнейшим условием прямого действия нейротоксиканта на ЦНС является его способность проникать через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Вещества, не проникающие через ГЭБ, могут вызывать токсические эффекты на периферии, главным образом в области синаптических контактов нервных волокон с иннервируемыми клетками органов, вегетативных и чувствительных ганглиев [Зобнин Ю.В., 2008]. Эффекты нейротоксикантов на ЦНС проявляются в виде широкого круга расстройств, включающих нарушения ментального статуса (изменения настроения и психозы), энцефалопатию, коматозные состояния, миелопатию, локальные мозговые расстройства, расстройства движения и судороги. Страдают интегративные функции мозга, такие как память и обучение, а также сенсорные функции, что может привести к нарушениям зрения, слуха, тактильной и болевой чувствительности. Нейротоксические поражения периферической нервной системы проявляются нейропатией, миопатией и симптомами нарушения нервно-мышечной передачи [Estruch R. et al., 1998].
Принадлежность определённых химических веществ к нейротоксикантам основывается как на достоверных клинических наблюдениях, так и на экспериментальных исследованиях. Spencer и Schaumburg в своём руководстве по нейротоксикологии приводят основанные на доказательной базе критерии, согласно которым химическое вещество считается нейротоксикантом [Spencer P.S., Schaumburg Н.Н., 2000.]. На основании раздельных экспериментальных и клинических доказательств авторы включают каждый рассматриваемый потенциальный токсикант в, так называемый «нейротоксический рейтинг». В частности, ими отобрано 465 химических веществ, обладающих потенциальным нейротоксическим действием. Для определения характера нейротоксического действия вещества важно иметь представление о видах вызываемых нарушений и определяемых различными методами конечных результатах токсического действия. С этой целью Агентство по охране окружающей среды США -Environmental Protection Agency [ЕРА] в 1998 выпустило специальные рекомендации для определения риска нейротоксического действия (Guidelines for Neurotoxicity Risk Assesment), в которых в общих чертах сформулированы основные виды нейротоксических расстройств и их конечные результаты [Wallace D.R., 2009] (Таблица 1).
Определение токсикометрических параметров этанола
Состояние процессов памяти и обучения исследовалось с помощью методов условной реакции активного и пассивного избегания (УРАИ и УРПИ).
Исследование условной реакции активного избегания (УРАИ) плавания проводилось в квадратном бассейне размерами 1x1 м, глубиной 1 м. Бассейн наполнялся на 75% водопроводной водой температурой 24±2С, температура окружающего воздуха не должна превышать 24С. В центр бассейна устанавливался оплетённый верёвкой вертикальный стержень. Крысу медленно погружали в воду, причём голова животного была обращена в угол бассейна. Животному позволяли плавать до тех пор, пока оно не найдёт канат и не выберется из воды, или после истечения 5 минут плавания. Регистрировали латентный период избегания плавания (время от помещения животного в воду до обнаружения оплетённого стержня и выхода из воды).
Изучение УРАИ проводилось в двух вариантах: в первом варианте крысы предварительно обучались в течение 7 суток перед введением этанола (0,8 ЛД5о), после чего у них осуществлялось тестирование УРАИ. Такая постановка эксперимента позволяла, наряду с динамикой процесса обучения, оценить состояние памяти экспериментальных животных. Во втором варианте фиксировалось состояние выработки УРАИ у крыс при тестировании реакции в течение нескольких суток после острой алкогольной интоксикации без предварительного обучения, что позволяло судить о состоянии приобретения навыка избегания плавания в бассейне [Буреш Я. и др., 1991].
Условная реакция пассивного избегания болевого раздражения (УРПИ) -метод основан на выработке условной реакции пассивного избегания в челночной камере у крыс в ответ на безусловный электрокожный болевой раздражитель, предъявляемый в предпочитаемом грызунами тёмном отсеке камеры [Кругликов Р.И., 1981]. В данной работе использовалось обучение животных в двухкамерной установке PACS-30 (Columbus Instruments, США) состоящей из затемненного и освещенного отсеков, соединенных дверцей. Был использован ток силой 1 мА, который предъявлялся в течение 3-х секунд, однократно.
Эксперимент состоял из 3-х стадий:
1) исследование норок («норковый рефлекс») - крысу помещали в светлый отсек (хвостом к дверце). Вследствие своих биологических особенностей (врождённое предпочтение тёмных участков пространства у грызунов) крыса предпочитала находиться в тёмном помещении. Животных, не имеющих «норкового рефлекса», не использовали для дальнейшего эксперимента. В эксперимент отбирались крысы, время пребывания которых в светлой камере не превышало 20 секунд, данное время регистрировали как латентный период первого захода (ЛП0);
2) обучение - при переходе в тёмный отсек животное там получает болевое электрокожное раздражение через электродный пол. Обучение животных проводилось непосредственно перед введением этанола в дозе 0,8 ЛД5о;
3) воспроизведение - через 12 часов и 24 часа после обучения и введения этанола в дозе 0,8 ЛД50 крысу помещали в светлый отсек. В течение 2 минут регистрировали следующие параметры: количество обученных крыс (не зашедших в тёмную камеру на протяжении 2 минут) в процентах от общего количества животных, и латентный период первого захода через 12 и 24 часа после обучения (ЛПіг и ЛІІ24). При дальнейших расчётах использовали разницу между латентными периодами ЛПі2 - ЛПо и ЛГЫ - ЛП0.
Состояние болевой чувствительности инструментально исследовалось с помощью методов регулируемого термического и механического раздражения. Тест отдёргивания хвоста - крысу помещали в горизонтально расположенный цилиндр соответствующих размеров, сделанный из пластика (с перфорацией), закрепляя при этом хвост животного. Световой пучок большой интенсивности, генерируемый лампой прибора «Tail Flick Analgesia Meter» (Columbus Instruments, США) фокусировался на хвосте до тех пор, пока не происходило отдёргивание хвоста (т.е. когда тепловое воздействие на кожу достигало критического уровня). Для определения изменения порога болевой чувствительности регистрировалось время отдёргивания хвоста в секундах.
Тест механического сдавливания лапы - задняя лапа крысы фиксировалась под конусовидным выступом прибора «Analgesy-meter» (Ugo Basile, Италия). Регистрировали в граммах силу сдавления, вызывающего отдёргивание задней лапы животного, увеличение которой говорило о снижении болевой чувствительности.
Острое отравление этанолом экспериментальных животных осуществлялась в двух вариантах: без предварительной алкоголизации и после предварительной алкоголизации крыс (см. раздел 2.4).
В опытах без предварительной алкоголизации выделяли следующие группы животных (по 12 крыс-самцов в группе): - интактные крысы, которым вводили воду для инъекций; - выжившие животные после введения этанола в дозе 0,8 ЛД5о без лечения; - выжившие животные после введения этанола в дозе 0,8 ЛД50 с последующим в/б введением 300 мг/кг пикамилона, однократно; - выжившие животные после введения этанола в дозе 0,8 ЛД50 с последующим в/б введением 30 мг/кг ноопепта, однократно; - выжившие животные после введения этанола в дозе 0,8 ЛД50 с последующим в/б введением 300 мг/кг пикамилона и 30 мг/кг ноопепта, однократно. Через 12 часов после введения этанола в дозе 0,8 ЛД50 и далее ежедневно в течение 3-9 суток, у крыс 2 группы (без лечения), осуществляли регистрацию параметров оцениваемых показателей (см. раздел 2.5). Фармакологические препараты в опытах без предварительной алкоголизации вводились однократно в указанных дозах через 12 часов после введения этанола (0,8 ЛД5о). Регистрацию оцениваемых показателей осуществляли через 30 минут после инъекции препаратов и далее ежедневно на протяжении 3-9 суток (Рисунок 1).
Оценка поведенческих, неврологических и патоморфологических нарушений у крыс после тяжёлой формы острого отравления этанолом
Установлено, что в результате ежедневного в течение одного месяца внутрижелудочного введения этанола у крыс отмечалось резкое снижение продолжительности их удерживания на вращающемся стержне по сравнению с интактными животными в течение 9-ти суток наблюдения. Введение этанола в дозе 0,8 ЛД50 не вызывало достоверного ухудшения этого показателя по сравнению с группой предварительно алкоголизированных крыс (Таблица 16).
ГруппыЖИВОТНЫХ(п=12) Время наблюдения после прекращения предварительной алкоголизации и введения этанола (0,8 ЛД50) часов (1 сутки) 3 сутки 5 сутки 7 сутки 9 сутки Интактные 594,7±3,2 594,8±3,2 593,3±4,1 592,2±4,2 593,8±3,8 Предварительная алкоголизация 194,8±35,1 211,7±41,9 195,2±26,1 350,8±26,0 410,9±18,0 Предв. алк.+ 0,8 ЛД50 этанола 134,8±10,9 188,2±17,5 193,8±21,2 358,4±24,0 419,4±15,0 Примечания - по сравнению с группой интактных животных (р 0,05). В опытах с использованием анализатора «Bioseb-GS3» было показано снижение силы хватки экспериментальных животных на 30-40% в течение 7-ми суток наблюдения после прекращения хронической алкоголизации. После введения этанола (0,8 ЛД50) сила хватки крыс в ещё большей степени снизилась по сравнению с интактными и предварительно алкоголизированными животными (Таблица 17). Таблица 17 - Динамика изменения силы хватки после введения этанола в дозе 0,8 ЛД5о на фоне предварительной алкоголизации (М±тп, Н)
В данном разделе исследования были совмещены варианты оценки УРАИ с предварительным обучением крыс в течение 7 суток и последующим тестированием выработанной реакции в течение 9 суток, осуществлявшимся после введения животным этанола в дозе 0,8 ЛД50. Подобная постановка эксперимента позволила оценить влияние предварительной алкоголизации на выработку и сохранения навыка избегания.
В ходе обучения интактных животных у них наблюдалось постепенное сокращение общего времени плавания. Продолжительность плавания, зарегистрированная в последний день обучения, сохранялась на протяжении всего периода дальнейшего наблюдения, что свидетельствовало о формировании процесса приобретения навыка - избегания аверсивного стимула путём нахождения стержня в бассейне. Выработка УРАИ у крыс на фоне хронической алкогольной интоксикации сопровождалась достоверным увеличением времени плавания, особенно выраженным в первые дни обучения. Тем не менее, к завершению обучения у крыс этой группы отмечалось сокращение латентного периода избегания (времени плавания), что указывает на выработку УРАИ, правда, на более низком уровне, чем у интактных животных. Величина достигнутого латентного периода избегания у крыс с предварительной алкоголизацией сохранялась на протяжении всех последующих 9-ти суток тестирования УРАИ. Через 12 часов после острого отравления этанолом крыс, подвергнутых хронической алкоголизации, продолжительность плавания при тестировании выработанного УРАИ увеличивалась в 15 раз по сравнению с группой интактных животных и почти в 10 раз по сравнению с крысами с ежедневным в течение одного месяца введением этанола. В последующем у крыс этой группы наблюдалось сокращение времени плавания, однако его продолжительность достоверно превышала этот показатель у крыс обеих выше перечисленных групп (Таблица 18).
Примечания - по сравнению с группой интактных животных (р 0,05); - по сравнению с группой предварительно алкоголизированных животных (р 0,05). Учитывая выраженное увеличение латентного периода избегания плавания в течение первых суток после введения этанола (0,8 ЛДзо) у крыс с выработанным УРАИ, целесообразно было изучить состояние памяти по методу УРПИ. Установлено, что через 12 и 24 часа после прекращения хронической алкоголизации и одноразовой выработки УРПИ количество обученных крыс (не зашедших в тёмный отсек в течение 2 минут) уменьшилось соответственно на 70% и 80% по сравнению с группой интактных животных. Незначительное ухудшение этого показателя у предварительно алкоголизированных крыс после острого отравления этанолом (на 80% и 90% по отношению к интактным животным), по всей вероятности, объясняется выраженным уменьшением числа обученных животных в результате хронической алкоголизации.
Сопоставление изменения ЛП УРПИ через 12 и 24 часа после обучения (ЛП[2 и ЛП24) с его значением при обучении (ЛП0) показало значительное уменьшение разницы между этими показателями у хронически алкоголизированных крыс и в ещё большей степени у животных, подвергнутых острому отравлению этанолом (Таблица 19). Уменьшение ЛП захода в наказуемый отсек после введения этанола в дозе 0,8 ЛД5о свидетельствует об ухудшении воспроизведения приобретённого навыка, что может оцениваться как нарушение процессов памяти.q
Фармакологическая коррекция неиротоксических поражений у крыс после тяжёлой формы острого отравления этанолом
Проведённые в данном разделе исследования позволили установить возможность фармакологической коррекции поведенческих, двигательных, мнестических и ноцицептивных нарушений у крыс, перенёсших острое тяжёлое отравление этанолом.
Наряду с улучшением показателей общей двигательной активности, пространственной ориентации и исследовательской активности непосредственно после введения всех исследованных препаратов, под влиянием однократного введения пикамилона, ноопепта и их сочетания, динамика изменения нарушенных функций продемонстрировала восстановление у этих животных естественных процессов неассоциативного обучения. Такие показатели моторики как координация движений и сила хватки при использовании пикамилона, ноопепта и в особенности их сочетания восстанавливались уже на раннем этапе после острого отравления этанолом.
Установлено, что однократное введение пикамилона и пикамилона совместно с ноопептом уже в первые 12 часов после отравления этанолом способствовало нормализации процессов памяти и обучения. Использование ноопепта на раннем этапе после острого отравления этанолом способствовало улучшению процессов сохранения выработанного навыка.
Под влиянием использованных средств фармакологической коррекции: пикамилона и ноопепта происходила нормализация процессов ноцицепции, нарушенных вследствие токсического действия этанола. В наиболее выраженной степени этот эффект проявлялся при сочетанном использовании пикамилона и ноопепта.
Одним из последствий острого отравления этанолом крыс на фоне их предварительной алкоголизации явилось выраженное нарушение процессов памяти и обучения. У животных на протяжении 9-ти суток наблюдения отмечалось достоверное ухудшение воспроизведения выработанного навыка по тесту УРАИ по сравнению с интактными крысами и на протяжении 7-ми суток по сравнению с крысами, предварительно получавшими этанол в течение одного месяца. В силу этих обстоятельств было изучено влияние повторного ежедневного введения фармакологических препаратов: пикамилона, ноопепта и мемантина (соответственно в дозах 300 мг/кг, 30 мг/кг и 10 мг/кг, в/б, на одно введение) на состояние УРАИ плавания. С целью выяснения влияния фармакологических препаратов на процессы памяти исследовано состояние сохранения навыка по избеганию электроболевого раздражения с использованием метода УРПИ.
Ежедневное введение пикамилона крысам приводило к достоверному укорочению продолжительности плавания при повторных тестированиях УРАИ предварительно алкоголизированных крыс на протяжении 9 суток после введения им этанола в дозе 0,8 ЛД5о (Рисунок 26). 60 50
Изменение латентного периода избегания плавания у крыс после фармакологической коррекции пикамилоном острого отравления этанолом (0,8 ЛД50) на фоне предварительной алкоголизации, п = 12 во всех группах (М±т, сек.) Однако более выражено положительный эффект препарата проявился на 3-5 день его введения (уменьшение продолжительности плавания соответственно на 57,3% и 56% по сравнению с группой крыс, перенёсших острое отравление).
Под влиянием мемантина достоверное улучшение этого показателя УРАИ проявилось, начиная с 3-го дня введения препарата (Рисунок 27). (М±т, сек.) В наибольшей степени коррекция нарушения воспроизведения выработанного навыка УРАИ отмечена при ежедневном введении крысам ноопепта. Уже через 12 и 24 часа после острого отравления этанолом наблюдалось достоверное укорочение времени плавания в этой группе животных на 47,3% и 49,8% соответственно, а на 3-й сутки этот показатель достоверно уменьшался на 70,8% по сравнению с группой крыс, получивших этанол в дозе 0,8 ЛД50 (Рисунок 28). 70 0_
Через 12 часов и 24 часа после обучения и введения этанола в дозе 0,8 ЛД5о предварительно алкоголизированных крыс у них показано достоверное уменьшение латентного периода УРПИ, что свидетельствует о нарушении процессов памяти. Введение исследованных препаратов перед тестированием УРПИ через 12 часов после обучения привело к существенному увеличению разницы ЛПі2-ЛП0 и в ещё большей степени ЛП24-ЛПо, что свидетельствовало об их нормализующем влиянии на процессы воспроизведения выработанного навыка (Рисунок 29).
Изменение латентного периода (ЛП) УРПИ после фармакологической коррекции острого отравления этанолом (0,8 ЛД50) на фоне предварительной алкоголизации, п = 12 во всех группах (М±т, сек.) Использование ещё одного показателя сохранения выработанного УРПИ количества обученных крыс в группе (не вошедших в тёмную, «наказуемую» камеру в течение 2-х минут наблюдения) также продемонстрировало антиамнезический эффект исследованных фармакологических препаратов (Рисунок 30).
