Содержание к диссертации
Введение
1. CLASS Обзор литературы CLASS 8
2. Экспериментальная часть 45
2.1. Материалы и методы исследований, 45
2.2. Разработка технологии получения ликопинсодержащей биомассы на основе штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ- 129(-) и ВСБ-130(+) 48
2.3. Изучение условий стимулирования ликоіганообразования парой штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) 79
2.4. Изучение условий стабилизации ликопина в процессе культивирования и хранения биомассы гриба Blakeslea trispora ВСБ- 129(-) и ВСБ-130(+) 101
2.5. Способы получения вододисперсионной формы ликопина 107
2.6. Статистическая обработка результатов 119
Заключение 123
Выводы 126
Список использованных источников 128
Приложение 153
- Разработка технологии получения ликопинсодержащей биомассы на основе штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ- 129(-) и ВСБ-130(+)
- Изучение условий стимулирования ликоіганообразования парой штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+)
- Изучение условий стабилизации ликопина в процессе культивирования и хранения биомассы гриба Blakeslea trispora ВСБ- 129(-) и ВСБ-130(+)
- Способы получения вододисперсионной формы ликопина
Введение к работе
Современный уровень развития техники достиг таких масштабов, что практически любая форма хозяйственной деятельности, в большей или меньшей степени, оказывает негативное влияние на биосферу. Организм человека при этом подвергается все возрастающему действию разнообразных физических химических и биологических факторов (УФ воздействие, озон, повышенный радиационный фон, смог, табачный дым, употребление недоброкачественной воды, различных пестицидов, содержащихся в пище, попадание в организм тяжелых металлов и т.д.), приводящих к ослаблению сопротивляемости организма, нарушению обмена веществ, возникновению широкого круга заболеваний.
В связи с этим огромное значение приобретают природные биологически активные соединения, такие как витамины, антиоксиданты, добавление которых в пищу человека в небольшом количестве приводит к снижению риска развития многих заболеваний и укрепляет иммунную систему человека. В качестве одного из наиболее активных и универсальных средств такого назначения в последние годы рассматривают ликопин.
Ликопин - относится к природным соединениям группы каротиноидов. Это пигмент, который придает здоровую красную окраску фруктам и овощам, таким как помидоры, арбузы, розовые грейпфруты, облепиха и др. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что ликопин наряду с красящей функцией имеет самостоятельное значение как биологически активная добавка. Ликопин оказывает общеукрепляющее действие на организм и обладает большим набором ценных фармакологических свойств. Подавляя в организме свободнорадикальное окисление, ликопин стабилизирует имунный статус организма, улучшает протекание ряда важнейших биологических процессов в организме, в том числе нормализует уровень глюкозы в крови, липидный обмен, зрение и контролирует пролиферацию (новообразование) клеток. Была установлена высокая эффективность использования ликопина при лечении заболеваний предстательной железы, легких, желудка, катаракты, шпемической болезни сердца, атеросклероза [165], Биологическая активность ликопина связана прежде всего с его аитиоксидаятными свойствами, те. способностью ингибировать свободнорадикальные процессы в клетках.
В условиях растущей потребности в ликопине важным становится вопрос изыскания его новых источников.
До сих пор основным источником получения ликопина являются растения, в частности специально отселекцированные сорта томатов Lycopersicon sp. [165]. Однако очень низкий выход (0.3-0,4 мг/г сырья), сезонность, действие неблагоприятных погодных факторов и фитопатогенов делают этот способ экономически неэффективным. Один килограмм такого ликопина стоит около 5000 $ США. Высокая цена и дефицит ликопина на рынке являются основными причинами отсутствия необходимого человеческому организму антиоксиданта в ежедневном рационе питания.
Решение указанных проблем возможно путем создания биотехнологического способа получения ликопина. В этом случае производству не грозит сезонность и потеря урожая от действия неблагоприятных факторов. Кроме того, биотехнологический способ позволяет получить ликопин природного качества.
В настоящее время в РФ на предприятии «Уралбиофарм» реализован биотехнологический способ получения ликопина путем культивирования гетероталличного гриба Blakeslea trispora - продуцента бета-каротина. Для ингибирования циклаз и получения ликопина в среду культивирования добавляют соединения класса аминометилпиридинов или табачную крошку [22, 83]. Выход ликопина при этом составляет 0,49-0,7 г/л среды, продолжительность ферментации составляет 110-115 часов. Однако, до сих пор получение ликопина микробиологическим способом не получило практического применения в крупномасштабном производстве из-за возможного токсического эффекта гетероциклических соединений, используемых в качестве стимуляторов.
Поиск новых высокоэффективных продуцентов ликопина, разработка на их основе технологий получения ликопина, создание и использование в рационе питания пищевых добавок, содержащих данный каротиноид, является актуальной задачей, поскольку позволяет повысить уровень адаптационной защиты организма к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека и снизить риск развития ряда опасных заболеваний, в том числе и онкологических.
В связи с этим целью настоящих исследований явилась разработка биотехнологического способа получения ликопина с использованием новой пары гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+).
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи работы:
• изучение морфологических, биохимических и физиологических свойств пары штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+);
• разработка технологической схемы получения ликошшсодержащей биомассы;
• оптимизация физико-химических параметров культивирования, обеспечивающих максимальное накопление ликопина парой штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+):
- подбор и оптимизация питатльной среды
- подбор оптимального уровня рН среды
- подбор условий аэрации
- определение оптимальной продолжительности кульивирования
- определение количества посевного материала
- определение количества добавляемого (+) штамма гриба
• поиск эффективного стимулятора ликопинообразования;
• изучение и разработка условий стабилизации ликопина в процессе ферментации и длительного хранения биомассы;
• получение вододисперсионной формы ликопина.
Научная новизна работы заключается в следующем:
- разработана технологическая схема получения ликопинсодержащей биомассы на основе новой высокоэффективной пары гетероталличного гриба Biakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) без добавления в среду каких-либо предшественников ликопинообразования;
- определены оптимальные физико-химические параметры процесса, обеспечивающие максимальное накопление ликопина в процессе (1,15 г/л);
определены условия стабилизации ликопина в процессе культивирования и хранения биомассы;
- разработана технология получения вододисперсионной формы ликопина, стабильной в течении длительного времени (10 суток) с концентрацией ликопина 1-2 мг/100 мл.
Практическая ценность работы.
На основании проведенных исследований разработана технология получения ликопинсодержащей биомассы с использованием новой высокоэффективной пары штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+)? что делает данную технологию конкурентно-способной на рынке производства данного каротиноида.
В настоящее время данная технология внедряется в промышленных условиях предприятия НПО «Витан» г.Верхнеднепровска.
Апробация работы.
Материалы исследований обсуждались на международной конференции молодых ученых «Химия и технология пищевых веществ.
Экологически безопасные технологии на основе возобновляемых природных ресурсов» (г. Москва, 2000 г.)э международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (г. Саранск, 2001 г.), международной конференции «От фундаментальных исследований к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии» (Моска-Тверьэ 2001 г.).
Технология награждена бронзовой медалью Ш Международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 4-7 февраля 2003 г.).
Публикации.
По материалам экспериментальной работы опубликовано 6 печатных работ и получены три патента. Работа выполнена в лаборатории биологически активных веществ ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ».
Разработка технологии получения ликопинсодержащей биомассы на основе штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ- 129(-) и ВСБ-130(+)
Из коллекции лаборатории биологически активных веществ института ФГУП ГосНИИсинтезбелок была получена пара штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+), способная при совместном выращивании накапливать ликопин.
В ходе исследований было обнаружено, что при многократном пассировании штаммов ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) на агаризованной среде сусло отмечалась морфологическая изменчивость культур.
Штамм ВСБ-129(-) при пересевах на агаризованной среде образовывал мицелий различной степени окраски; от светло-желтой до оранжево-красной (фотої). Штамм ВСБ-130(+) был более однородным. В редких случаях отмечалось изменение окраски от желтого до бежевого цвета (фото2).
Данная морфологическая изменчивость штаммов существенным образом сказывалась на способности синтезировать ликопин при их совместном выращивании (ФотоЗ). В связи с этим были проведены селекционные работы по отбору пары штаммов, обладающей наибольшей ликопинсинтезирующей активностью и стабильностью морфологических признаков. Эффективность пары штаммов оценивали визуально по интенсивности окраски при совместном выращивании на агаризованной среде сусло.
Следует отметить, что при совместном выращивании штаммов на агаризованной среде сусло пара штаммов ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) не образует характерную черную полосу зигоспор. При контакте (+) штамма с (-) штаммом вся поверхность (-) штамма приобретает ярко-красный цвет (фотоЗ). 130(-+-} и ВСБ-129(-) на агаризованной среде сусло. Как показали исследования наиболее активной ликогашсинтезирующей активностью обладала пара, в которой штаммы ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) имеют следующую характеристику [1, 2, 31: штамм Blakeslea trispora ВСБ-129(-) образует на среде сусло-агар плотный, ярко-оранжевого цвета, субстратный мицелий. Воздушный мицелий практически не развит, В "старой" культуре (более 20 суток) образуется слабо развитый, белого цвета, воздушный мицелий. Спороношение практически отсутствует (Фото 4). штамм Blakeslea trispora ВСБ-130(+) образует субстратный мицелий бежевого цвета и воздушный мицелий палевого цвета, Спороношение штамма активное (Фото 5),
В составе пигментного комплекса данной пары гриба при тонкослойной хроматографии в системе растворителей гексан:ацетон (50:1) обнаружены ликопин и незначительное количество р-кароттша (рис, 2.2.1). Соотношение ликопин : р-каротин составляет 96 : 4.
Для дальнейших исследований отбирали штаммы ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+), характеризующиеся вышеописанными свойствами.
На следующем этапе исследований была изучена динамика роста штаммов гриба Blakeslea trispora на кукурузно-соевой среде, которая используется в промышленном производстве бета-каротина. Засев проводили 10-суточной культурой ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+), предварительно выращенной на агаризованной среде сусло при t=27C - 28С. Колбы выращивали на качалке при t=27C, при 200 об/мин в течение 90 часов.
В табл, 2,2 Л. представлена динамика накопления биомассы штаммами ВСБ-129(-) и ВСБ-130(н-) на кукурузно-соевой среде.
Таблица 2,2.1 Накопление биомассы штаммом ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) гриба Blakeslea trispora на кукурузно-соевой среде.
Как видно из таблицы 2.2.1 накопление биомассы штаммами на кукурузно-соевой среде сопровоаедается снижением абсолютно сухого веса, что, вероятно, обусловлено перераспределением компонентов твердой фазы среды в процессе роста штаммов. В связи с этим для получения кривой роста более привычного вида были построены графики роста биомассы в координатах 1/АСВ [л/г]. Результаты представлены на рис. 2.2.2,
На рис. 2.2.2 видно, что на кукурузно-соевой среде штаммы ВСБ-Ї29 (-) и ВСБ-130(+) имели различный характер роста, У штамма ВСБ-129(-) отмечалась более продолжительная лаг-фаза по сравнению со штаммом ВСБ-130(+) и максимальное накопление биомассы достигалось к 68 часам. У
Поскольку штаммы гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-ІЗО(-) имеют разную скорость роста, применение традиционньтх технологических приемов культивирования для получения биомассы, обогащенной ликопином, не представляется возможным. При попытке совместного выращивания (+) и (-) штаммов при их одновременном засеве на жидкую питательную среду не отмечалось роста (-) штамма,, а происходил рост лишь (+) штамма. Количество (-) штамма оставалось на уровне засева. Однако он окрашивался в ярко-красный цвет.
В связи с этим для получения биомассы, обогащенной ликошшом, была использована двухстадийная технологическая схема, когда: на 1 стадии выращивали (-) штамм гриба Blakeslea trispora 59 - на 2 стадии в выросшую (-) культуру добавляли (+) штамм гриба и далее вели совместное выращивание штаммов.
По данной технологической схеме было проведено выращивание пары штаммов гриба Biakesiea tnspora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) на жидкой питательной среде. Исследования проводили на лабораторной среде с глюкозой, которая ранее была подобрана и оптимизирована для бета-каротиновой пары штаммов гриба Biakesiea tnspora. Как видно из рис. 2.2.3 при совместном выращивании штаммов гриба Biakesiea tnspora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) в течение 48 часов на минеральной среде с глюкозой в биомассе накапливалось в среднем около 20 мг/г АСВ ликопина. Однако, как показали исследования, содержание ликопина в биомассе колебалось в широком диапазоне от 15 мг/г АСВ до 25 мг/г АСВ.
По литературным данным известно, что на стабильность процесса и накопление биологически активных веществ в биомассе микроорганизмов оказывают влияние такие факторы, как;
В связи с этим были проведены исследования по определению условий стабилизации данного процесса.
Как показали исследования на накопление ликопина парой штаммов гриба Blakeslca trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) большое влияние оказывает морфологическое состояние (-) штамма, которое достигается на 1 стадии процесса. Соответствующие опыты проводили на минеральной среде с глюкозой, а посевной материал выращивали на кукурузно-соевой среде,
В результате исследований было установлено, что при пассировании (-) штамма ВСБ-129(-) на минеральной среде с глюкозой изменялся характер роста культуры и ее морфологическое состояние, что оказывало значительное влияние на накопление ликопина и стабильность процесса при дальнейшем совместном выращивании с (+) штаммом ВСБ-130(+). При этом более стабильный процесс накопления ликопина отмечался в том случае, когда (-) штамм на минеральной среде с глюкозой рос в виде глобул диаметром da3 мм, что достигалось при 2-ух кратном пассировании (-) штамма на минеральной среде с глюкозой (табл. 2.2,2).
Поскольку для процесса каротинообразования важным фактором является физиологическое состояние продуцента [18, 60] были проведены исследования по изучению влияния физиологического состояния (-) штамма ВСБ-129(-) на накопление ликопина парой штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+). С этой целью штамм ВСБ-129(-) на минеральной среде с глюкозой на 1 стадии процесса выращивали: в течение 18 часов. При этом штамм ВСБ 129(-) находился в фазе замедления роста; в течение 24 часов. При этом штамм ВСБ-129(-) находился в конце фазы замедления роста и в начале стационарной фазы; в течение 36 часов. Штамм ВСБ-129(-) находился в стационарной фазе роста. в течение 48 часов. Штамм ВСБ-129( ) находился в начале фазы отмирания культуры (рис. 2.2.4).
Изучение условий стимулирования ликоіганообразования парой штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+)
По литературным данным известно, что любой фактор, провоцирующий общую стрессовую ситуацию оказывает стимулирующее влияние на накопление у микроорганизмов продуктов вторичного метаболизма и в частности пигментов . Это различные пестициды, которые ингибируют рост микроорганизмов [66], гетероциклические соединения [83], рН среды [180], свет [25], кислород [161], количество субстрата [69],
При изучении условий стимулирования ликопинообразования пара штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-ІЗО ) мы в наших исследованиях руководствовались в первую очередь не только простотой и доступностью стимулирующего фактора, а также отсутствием какого-либо возможного токсического влияния на конечный продукт. В связи с этим, различные гетероциклические соединения, пестициды, действие которых описывается в литературе, нами были исключены из исследований.
Была изучена возможность стимулирования ликопинообразования у пары штаммов гриба Blakeslea trispora путем изменения некоторых параметров технологического процесса.
Известен технологический прием стимулирования каротинообразования путем добавления в начало процесса биомассы с конечной стадии [69]. Были проведены исследования, в которых в среду культивирования на старте ферментации добавляли гомогенизированную ли копинсо держащую биомассу, полученную из предыдущей ферментации после 48 часов совместного культивирования. Биомассу добавляли в количестве 2,5 и 5%. Результаты представлены в табл. 2.3.1. Таблица 2.3.1. Влияние добавок ликопинсодержащей биомассы, взятой с конечной стадии процесса, на рост и накопление ликопина пара штаммов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+).
Как показали исследования внесение в среду культивирования гомогенизированной биомассы, полученной в предыдущей ферментации, увеличивает выход ликопина на 45,5 %(табл. 2.3.1).
Известно, что накопление каротиноидов зависит от степени аэрации среды [180] . Проводились исследования по изучению влияния аэрации на накопление ликопина культурой гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ 130(0 Поскольку процесс культивирования данной пары гриба Blakeslea trispora является 2-ух стадийным процессом, в котором ликопин накапливается на 2-ой стадии, после завершения роста, представляет интерес изучение вопроса о необходимости изменения условии аэрации в процессе культивирования при переходе от 1-ой ко 2-ой стадии.
Исследования проводили таким образом, что на 1-ой стадии процесса культивирование вели при оптимальных для качалочных колб условиях аэрации (1220 мг/л/час), а на 2-ой стадии процесса при добавлении в среду (+) штамма ВСБ-130 (+) условия аэрации изменяли в диапазоне 340 мг/л/час -4280 мг/л/час.
Как показали исследования, при увеличении аэрации на 2-ой стадии технологического процесса с 1220 мг/д/час до 2930 мг/л/час повышалось накопление ликопина в биомассе гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) на 24% (с 26,2 до 32,4 мг/г АСВ) (Табл. 2.3.2).
Были проведены исследования по изучению влияния рН среды на рост и накопление ликопина штаммами гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+). Поскольку оптимальное значение рН для роста гриба Blakeslea trispora составляет рН=6,3 были поставлены две серии экспериментов. В первой серии экспериментов рН изменяли на старте ферментации, т.е. культуру (-) штамма ВСБ-129(-) сразу выращивали с момента засева при разных значениях рН. При этом было установлено, что после стерилизации рН среды несколько отличается от того значения, которое устанавливали первоначально.
Во второй серии экспериментов культуру (-) штамма ВСБ-129(-) выращивали при оптимальном значении р№=6,3; рН изменяли на второй стадии процесса при добавлении (+) штамма ВСБ-130(+). При этом в обоих вариантах опытов при переходе ко 2 стадии технологического процесса увеличивали уровень аэрации.
Как показали исследования при рН = 6,8 установленных на старте ферментации отмечался наибольший выход ликопина (362,8 мг/л), несмотря на снижение концентрации биомассы по сравнению с оптимальными для роста условиями.
Таким образом, в результате проведенных исследований определены основные параметры культивирования, обеспечивающие накопление ликопина в биомассе до 50 мг/гАСВ. Однако выход ликопина в процессе ферментации в данных условиях невелик, вследствие низкого накопления биомассы, В связи с этим дальнейшие исследования направлены па оптимизацию состава питательной среды, обеспечивающей повышение накопления биомассы.
Как отмечалось выше для выращивания пары штаммов гетероталличного гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) использовали производственную среду, на которой выращивают штаммы гриба Blakeslea trispora синтезируюнще бета-каротин в условиях НПО «Витай» г. Верхнеднепровска. Данная среда имеет следующий состав;
Химический анализ данной среды показал, что в ее составе содержатся основные биогенные элементы: азот, углерод, фосфор, калий, магний и т.д. (табл. 2.3.4).
Как видно из таблицы 2.3.5, в производственной среде на основе гидрола отмечается недостаток фосфора, аммонийного и общего азота, а также избыток магния и калия. При оптимизации данной среды изучено влияние 4 факторов; гидрола (зеленой патоки), кукурузного экстракта, минерального азота и фосфора. В качестве источников азота и фосфора использовались соли (NH SG и КН2РО4 соответственно.
В исследованиях по оптимизации питательной среды применяли метод с использованием аддитивно-решетчатого описания, в котором каждый из 4 факторов варьируется на 4 различных уровнях, для получения наиболее удобного плана эксперимента (в виде ортогонального латинского квадрата) [7], В качестве выходного параметра была взята концентрация ликонина (г/л) по окончанию процесса совместного культивирования.
Эффект определенного уровня фактора, при использовании данного метода, равен разнице между средним значением выхода во всех вариантах, где данный фактор находился на этом уровне и средним значением выхода для всей серии опытов. Если получается значение со знаком плюс, то это говорит о положительной степени влияния данного фактора, и наоборот.
Данный метод оптимизации целесообразно использовать по нескольким причинам. Во-первых - это простота расчетов и наглядность интерпретации. Во-вторых - имеется возможность изучения влияния выбранных факторов на несколько параметров выхода. Таким образом, получив кривые зависимости различных параметров выхода от входных факторов процесса, можно легко выбрать вариант, оптимальный с нескольких точек зрения или компромиссный. В-третьих, данный метод позволяет получить достоверные результаты даже по 1 опыту (без повторностей), т.к. эффект каждого уровня определяется по 4 4=16 данным.
Ниже приведены расчеты по поиску оптимальных концентраций компонентов питательной среды в соответствие с выбранным методом.
Как видно ил пред ста вленных результатов, в первой серии опыюв максимальные эффекты входных факторов достигались при следующих концентрациях: гидрш - 60 г/зк кукурузный экстракт - 80 г/л. KH2PO-i - КЗ г л, (MJIj hSO.i - 4,5 п л. Уровни входных факторов в следующей серии будут варьироваться вблизи этих значений. Таким обраюм осуществляется последовательное приближение к опгимшіьньїм значениям входных факторов, которые будут приняты за общий оптимум пропесса.
Изучение условий стабилизации ликопина в процессе культивирования и хранения биомассы гриба Blakeslea trispora ВСБ- 129(-) и ВСБ-130(+)
Ликопин, также как и р-каротин, являясь полиненасыщенным соединением с сопряженными двойными связям легко и быстро окисляется под воздействием света повышенной влажности, температуры и т.д. При этом ликопин является более нестабильным соединением по сравнению с бета-каротином.
Проведенные исследования показали, что весь ликопин синтезируемый грибом Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСЬ-ІЗО(-і-) под воздействием стимуляторов разрушается в течение первых суток, что, вероятно, обусловлено недостатком собственных внутриклеточных антиоксидантних систем (табл 2.4Л).
В связи с этим изучение и разработка условий стабилизации ликопина в процессе культивирования и хранения биомассы гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) является актуальной задачей.
В настоящее время в медицине, биологии и пищевой промышленности широко используют антиоксиданти биогенного и синтетического происхождения [138, 6]: жирорастворимые витамин Е, большинство фосфолипидов, в т. ч. лецитин и кефалин, витамин К, каротиноиды, флавоноиды, убихиноны; водорастворимые аскорбиновая кислота, лимонная кислота, никотиновая кислота, мочевина, серосодержащие аминокислоты, витамины группы В, бензойная кислота-Высокие антиоксидантные свойства имеют многие антибиотики (тетрациклин, пенницилин, левомицетин, стрептомицин и др.). Среди синтетических антибиотиков широко известны органические соединения серы, пирогаллол и его производные. Антиокислительными свойствами обладают и ряд металлов: селен, ионы трехвалентного железа,
В настоящее время в практике производства бега-каротина для повышения его стабильности в процессе культивирования в питательную среду добавляют неприродные антиоксиданты, в частности сантохин или ионол [61, 75], Однако сантохин и ионол могут оказывать токсическое действие на организм человека и их применение в продуктах медицинского и пищевого назначения в РФ строго ограничено, а за рубежом запрещено [13, 53].
Следует отметить, что липиды гриба Blakeslea trispora содержат довольно большое количество антиоксидантов [29, 32], В таблице 2,4,2 представлено содержание липидов и фракционный состав лиггадов из биомассы гриба Blakeslea trispora, который используется для получения бега-каротина, а также из биомасса гриба, синтезирующего ликопин.
Кроме того, в лигщдах гриба Blakeslea trispora, продуцирующего бета-каротин, обнаружены витамин Е (191,5 мг/100г), витамин К (0,4 мг/ЮОг), эргостерин (2,7%)- Это дало основание предполагать, что липиды гриба Blakeslea trispora, добавленные в среду культивирования могут играть роль антиоксидантов и обеспечить сохранение ликопина как в процессе культивирования, так и на стадии хранения готовой продукции.
Были проведены исследования по изучению возможности использования собственных липидов гриба Blakeslea trispora в качестве антиоксиданта для стабилизации ликопйна в процессе культивирования и хранения биомассы.
Липиды получали при экстракции биомассы смесью органических растворителей хлороформ:этанол в соотношении 2:1. Из полученных липидов готовили маслянный раствор с концентрацией 10 % в масле и далее использовали для внесения в среду в качестве шпиоксидантов.
Полученный масляный раствор добавляли в среду на старте ферментации в количестве 051 % и 055%.
Процесс культивирования вели по вышеописанной двухстадийной схеме.
Однако, как показали исследования, внесение в среду культивирования раствора липидов в масле ингибировало синтез ликопйна вбиомассе (табл. 2,4.3), что, вероятно, обусловлено внесением в среду растительного масла, т.к. добавление его в количестве даже 0Э5%щ ингибировало образование ликопйна в биомассе гриба до 6,1 мг/гАСВ.
Были проведены исследования, в которых масляный экстракт, полученный нз грибной биомассы добавляли на стадии совместного культивирования за 20 минут до окончания культивирования. Для получения масляного экстракта использовали биомассу «Витатон», содержащую бета-каротин, и биомассу из штаммов ВСЕ-129(-) и ВСБ-130(н-), содержащую ликопин.
Масляную экстракцию проводили в 3 ступени, при t=55 С в течение 45 минут каждую ступень. Далее экстракты, полученные на каждой ступени объединяли и применяли для исследований. Количество добавляемых экстрактов составляло 10%. По окончанию ферментации биомассу высушивали в термостате при 80С, растирали в ступке до порошкообразного состояния и помещали на хранение в открытых емкостях при t=37 С. Согласно данному способу хранения 1 месяц хранения биомассы в условиях термостата с t=37C соответствует 6 месяцам хранения в закрытой таре при температуре окружающей среды.
Как показали исследования, масляный экстракт биомассы гриба, добавленный в конце ферментации перед сливом увеличивает срок хранения ликопинсодержащей биомассы и в дальнейшем может рассматриваться как альтернатива использованию таких антиоксидантов как саптохин или ионол.
Поскольку ликопин, также как и бета-каротин, являясь полиненасыщенным соединением с сопряженными двойными связями, легко и быстро окисляется под воздействием света, повышенной влажности, температуры и т.д., были проведены исследования по стабилизации ликопина во время хранения биомассы.
Показано, что в качестве антиоксидантов для стабилизации ликопина при хранении биомассы могут быть использованы собственные липиды гриба, добавленные в среду культивирования в виде масляного раствора перед окончанием процесса ферментации
Способы получения вододисперсионной формы ликопина
Ликопин, как было отмечено, имеет немаловажное значение в шнневой, фармакологической и косметической промышленностях. При этом, наряду с жирорастворимой формой, существует большая потребность в водорастворимой форме ликопина.
Поскольку ликопин не является водорастворимым соединением, то на следующем этапе исследований проводились испытания по созданию вододисперсионной формы ликопина, полученного из биомассы исследуемого гриба.
Проведенные в лаборатории биологически активных веществ института ФГУ11 ГосНИИсинтезбелок исследования по получению вододисперсионной формы убихинона, основанные на использовании собственных фосфолипидов гриба Blakeslea trispora легли в основу исследований по получению вододисперсионной формы ликопина [32].
Суть метода получения водорастворимого ликопина заключается в том, что при смешивании жирорастворимого ликопина с фосфолипидами в определенном соотношении полученная смесь приобретает вододисперсионную форму. Согласно данному методу, при смешивании с водой фосфолипиды образуют так называемые мицеллы, в которые включаются кристаллы ликопина. При этом ликопин не растворен в воде, а образует с ней эмульсию, поэтому правильней называть такую форму ликопина вододисперсионной. Преимущество данного метода заключается в том, что, во-первых, фосфолипиды можно получать совместно с ликопином в одном технологическом процессе, а, во-вторых, фосфолипиды также обладают ценными биологическими свойствами.
Ниже описаны методики получения ликопина и фосфолипидов из биомассы гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+),
По литературным данным известно, что для выделения каротиноидов как из растительного сырья, так и из биомассы микроорганизмов, могут использованы различные растворители: полярные, неполярные или их смеси, что определяется их экономической эффективностью и целесообразностью.
В настоящее время для выделения ликопина из биомассы гриба Blakeslea trispora на предприятии «Уралбиофарм» используют следующие растворители: этилацетат, подсолнечное масло илихладон-11 [26].
При этом биомасса в экстракторе нагревается до 105 С. Затем растворитель отгоняют под вакуумом. Полученные кристаллы ликопина промывают этанолом и сушат под вакуумом. При этом получают кристаллы с содержанием основного вещества 90-94%.
Поскольку в составе липидов гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) помимо ликопина обнаружены и другие ценные компоненты (убихинон Q-10, эргостерин, фосфолипиды, полиненасыщенные жирные кислоты) для выделения ликопина из биомассы гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) использовали разработанную в лаборатории технологию, применявшуюся для выделения бета-каротина [32]. Согласно этой методике, экстракцию проводили в мягких условиях (t=50-55C), чтобы в дальнейшем, после выделения ликопина, оставшуюся часть биолипидного комплекса можно было использовать для переработки.
В качестве растворителя использовали ацетон. Экстракцию проводили в 2 ступени при t=55C по 30 минут каждая ступень. Данные параметры процесса обеспечивали наибольший выход ликопина.
Процесс кристаллизации ликопина проводили при t=20C в течение 24 часов при слабом перемешивании. В качестве высаливающего агента на стадии кристаллизации исползовали ацетон, который позволяет добиваться коэффициента извлечения ликопина равного 0,67 при частоте кристаллов около 80%.
Проведение перекристаллизации в этаноле позволило получить кристаллы ликопина 92% чистоты.
Была проведена проверка качества и токсичности полученного кристаллического ликопина и получено заключение аналитической лаборатории института ФГУП ГосНИИсинтезбелок (аттестат акредитации № РОСС RU.0001.511345, см. приложение).
Фосфолипиды из биомассы гриба Blakeslea trispora ВСБ-129(-) и ВСБ-130(+) получали по разработанной в лаборатории технологии [32]. Выделение суммарных фосфолипидов проводили экстракцией этанолом. Полученный экстракт упаривали на роторно-пленочном испарителе, фосфолипиды осаждали из раствора ацетона. Процесс осаждения фосфолипидов с получением порошкообразного осадка проводили при следующих параметрах: соотношение фаз ацетон : липиды равно 5:1, температура процесса -5СС, время контакта 20 мин. Полученный осадок фосфолипидов промывали несколько раз этанолом для удаления следов ацетона и высушивали под вакуумом при температуре 40С в течении 2 часов.
Суммарные фосфолипиды, при смешивании с водой, позволяют получить эмульсию, стабильную в течение 48 часов. При этом концентрация фосфолипидов составляла 0,4 - 1,4 мг/г [32]. Однако, продолжительность сохранения стабильности эмульсии слишком мала, и это послужило основанием для дальнейших исследований по получению стабильной эмульсии.
Фосфолипиды гриба Blakeslea trispora представляют собой сложную многокомпонентную смесь, в составе которой обнаружены фосфотидилхолин (лецитин), фосфотидилэтаноламин, а также фракция лизофосфотидилхолина, фосфотидилсерина [32] и др.
Известно, что наибольшей способностью образовывать мицеллы в воде обладают те липиды, которые имеют объемную и/или заряженную полярную головку и сравнительно небольшую углеводородную цепь. К мицеллообразуюшим липидам относят соли жирных кислот и лизоформы фосфолипидов, у которых на молекулу приходится всего лишь одна углеводородная цепь [32].
Таким образом, для создания наиболее стабильных эмульсий, представлялось интересным разделение фосфолипидного комплекса на отдельные группы компонентов. В частности были проведены эксперименты по созданию эмульсий на основе фракции фосфолипидов не содержащей лецитин (фосфотидилхолин), как компонента обладающего наиболее низкой способностью образовывать мицеллы, содержание которого во фракции фосфолипидов значительно и составляет 34,5%.
Выделение лецитиновой фракции из комплекса фосфолипидов осуществляли, используя физико-химические свойства лецитина - лучшую, по сравнению с другими компонентами, растворимость в этиловом спирите. Для этого, полученные по предлагаемой технологии фосфолипиды подвергали экстракции этанолом. Экстракцию проводили при комнатной температуре, в течение 25 минут, при постоянном перемешивании и соотношении компонентов фосфолипиды : этанол равным 1 : 10 (масс.)- По завершению процесса экстракционную смесь отфильтровывали, спиртовой фильтрат отбрасывали, а осадок на фильтре промывали этанолом, и высушивали под вакуумом при температуре 30С. Из 12,5 г. суммарных фосфолипидов было получено 8,1 г. фосфолипидов, не содержащих лецитин. Полученный образец исследовали на способность образовывать стабильные эмульсии в течение определенного количества времени. Результаты исследований представлены в табл. 2.5.1.
Как видно из табл. 2.5.1 эмульсии, приготовленные на основе фосфолипидов, не содержащих фракцию лецитина, оказались наиболее стабильными в течение длительного промежутка времени (10 суток) от момента их создания. Учитывая полученные результаты, в дальнейших экспериментах нами использовались фосфолипиды, выделенные после обработки суммарных фосфолипидов этиловым спиртом.
Инкапсулирование ликопина в липосомы осуществляли с использованием метода пассивного инкапсулирования, в соответствие с которым диспергирование фосфолипидов и активного вещества (ликопина) осуществляется одновременно.
