Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 14
1.1. Генезис сапропеля 14
1.2. Биологическая стратиграфия озерных отложений 25
1.3. Органическое вещество сапропелей 31
1.4. Минеральная часть сапропелей 48
1.5. Классификация сапропелей 55
1.6. Применение сапропелей 59
2. Объект и методы исследования, аппаратура 71
2.1. Объект исследования 71
2.2. Методы исследования, аппаратура 71
2.2.1. Технический анализ сапропеля 72
2.2.2. Зоотехнический анализ сапропеля 72
2.2.3. Ботанический анализ сапропеля 73
2.2.4. Элементный анализ 73
2.2.5. Дифференциально-термический и дифференциально-гравиметрический анализ 73
2.2.6. Определение молекулярной массы 73
2.2.7. Эмиссионный спектральный анализ 74
2.2.8. Рентгено-флуоресцентный анализ 74
2.2.9. Атомно-абсорбционный анализ 74
2.2.10. Фурье-ИК-спектроскопия 75
2.2.11. 'Н-ЯМР-спектроскопия 75
2.2.12. Электронная спектроскопия 76
2.2.13. Хромато-масс-спектроскопия 76
2.2.14. Капиллярная газожидкостная хроматография 76
2.2.15. Адсорбционная газожидкостная хроматография 77
2.2.16. Препаративная тонкослойная хроматография 77
2.2.16.1. Аминокислоты 77
2.2.16.2. Сахара 77
2.2.16.3. Водорастворимые карбоновые кислоты 77
2.2.17. Экстракция сапропеля 78
2.2.18. Химический групповой анализ экстрактов сапропеля 78
2.2.19. Выделение гуминовых кислот 78
2.2.20. Экстракция гуминовых кислот 78
2.2.21. Выделение гиматомелановых кислот 79
2.2.22. Определение органических пигментов и витаминов 79
2.2.23. Определение порфиринов 80
2.2.24. Определение суммы флавонолов 80
2.2.25. Функциональный анализ 81
2.2.25.1. Определение фенольных гидроксилов 81
2.2.25.2. Определение хиноидных групп 81
2.2.25.3. Определение кетонных групп 82
2.2.25.4. Определение карбоксильных групп 82
2.2.25.5. Определение йодного числа 82
2.2.26. Кислотный и щелочной гидролиз сапропеля 83
2.2.27. Определение биологической активности сапропеля и препаратов на его основе 83
2.2.27.1. Определение биологической активности сапропеля 83
2.2.27.2. Определение биологической активности сапропелевых препаратов 84
3. Экспериментальная часть. Химический состав сапропеля Белгородской области 87
3.1. Характеристика сапропеля 87
3.1.1. Ботанический состав сапропеля 87
3.1.2. Технический анализ сапропеля 87
3.1.3. Зоотехнический анализ сапропеля 88
3.1.4. Фурье-ИК-спектроскопия сапропеля 88
3.1.5. Химический состав органической массы сапропеля (ОМС) 90
3.1.5.1. Химический состав водного экстракта, кислотных и щелочного гидролизатов 90
3.1.5.2. Химический состав экстрактов сапропеля 95
3.1.5.2.1. Гексановый экстракт 95
3.1.5.2.2. Толу ольный экстракт 100
3.1.5.2.3. Хлороформный экстракт 104
3.1.5.2.4. Ацетоновый экстракт 108
3.1.5.2.5. Этанольный экстракт 113
3.1.5.3. Групповой состав экстрактов 119
3.1.5.3.1. Органические основания 120
3.1.5.3.2. Карбоновые кислоты 121
3.1.5.3.3. Фенолы 122
3.1.5.3.4. Асфальтены 123
3.1.5.3.5. Нейтральное масло 125
3.1.5.4. Химический состав гуминовых кислот 142
3.1.5.4.1. Общая характеристика ГК 142
3.1.5.4.2. Ступенчатая экстракция ГК 148
3.1.5.4.3. Адсорбционная жидкостная хроматография ГК 167
1. Ацетоновый элюат 167
2. Этанольный элюат 169
3. Уксуснокислотный элюат 173
4. Остаток ГК 175
Выводы к главе 3 178
4. Биологическая активность сапропеля и препаратов на его основе 179
4.1. Биологическая активность сапропеля 179
4.1.1. Характеристика животных 179
4.1.1.1. Морская свинка (Cavia арегеа porcellus) 179
4.1.1.2. Белая мышь (Mus musculus) 180
4.1.2. Биологическая активность сапропеля 181
4.2. Биологическая активность сапропелевых препаратов 187
Выводы к главе 4 192
5. Сравнительная характеристика сапропелеи различных месторождений 193
Выводы к главе 5 205
Выводы 206
Литература
- Биологическая стратиграфия озерных отложений
- Дифференциально-термический и дифференциально-гравиметрический анализ
- Химический состав органической массы сапропеля (ОМС)
- Морская свинка (Cavia арегеа porcellus)
Введение к работе
Сложные микробиологические, биохимические и механические процессы, протекающие при генезисе сапропеля, обуславливают большое n t разнообразие его вещественного состава.
В составе органической массы сапропелей присутствуют водорастворимые, легко- и трудногидролизуемые вещества, гуминовые, гиматомелановые и фульвокислоты, широкий спектр аминокислот, Сахаров, пептиды, целлюлоза, лигнин, липиды, каротиноиды, ксантофилы, спирты, кетоны, карбоновые кислоты, производные хлорофилла, алкалоидов, металлопорфирины, фосфолипиды, витамины, ферменты, антибиотики, стероидные соединения. Значительна доля микроэлементов: Ni, V, Си, Ті, Zr, Al, Fe, Co, Mo, W, Ge, Ga, La, большинство из которых связаны в форме металлоорганических комплексов. Данный спектр соединений определяет широкое применение сапропелей в сельском хозяйстве, животноводстве, птицеводстве, рыбоводстве, ветеринарии, медицине и технике.
Сапропель и препараты на его основе положительно влияют на нервную, эндокринную, сердечно-сосудистую системы, улучшают состояние опорно-двигательного аппарата, стимулируют процессы метаболизма в печени. Присутствие в сапропеле антибиотиков и отсутствие патогенных микроорганизмов обеспечивает быстрое прекращение воспалительных процессов и хорошее излечение экзем, дерматитов, ожогов за счет усиления фагоцитарной активности лейкоцитов в крови, регенерации ткани; успешно \»„ лечатся различные флегмоны, маститы, фурункулезы хронические гастриты, язвенные болезни желудка и двенадцатиперстной кишки.
Применение сапропелевых препаратов, в сочетании с электрофорезом, улучшает состояние больных придатками матки; выявлена высокая эффективность при лечении хронической воспалительной патологии суставов, шейного остеохондроза позвоночника с неврологическими проявлениями.
Получены интересные данные при использовании сапропелевых препаратов в ветеринарии: при лечении гнойного дерматита у поросят, трещин копытиевого рога у свиней, гнойно-некротического поражения пальцев у овец. При скармливании сапропеля вследствие повышения обмена веществ улучшается общее состояние животных, увеличивается содержание гемоглобина, эритроцитов, общего белка, неорганического фосфора, витаминов А и С, кислотной емкости, стимулируется усвоение органами и тканями макро- и микроэлементов, повышается прочность рогового чехла копытец. Установлено восстановление паренхимы печени пораженной токсическим гепатитом.
Перспективно применение сапропелей в виде минерально-витаминных добавок в комбикорма и получение гранулированных комбикормов на основе травяной муки, когда сапропель выполняет связующую роль и выступает как антиокислитель биологически ценных компонентов кормов. Огромна физиологическая и биологическая роль сапропелевых удобрений, которые снижают поражаемость болезнями сельскохозяйственных культур, накопление нитратов; увеличивают содержание крахмала, белка, сырого протеина, сахара; существенно повышается урожайность.
Сапропели повышают плодородие почвы, снижают избыточную кислотность, увеличивают содержание в почве подвижных форм фосфора и калия. Это особенно важно для многих регионов России, имеющих отрицательных баланс гумуса, как основного показателя плодородия почвы. Согласно обобщенным отечественным и зарубежным данным, уменьшение содержания гумуса на 10% снижает урожайность зерновых культур в среднем на 5-6 ц/га. В то же время на территории России около 3 млн. озер, запасы сапропеля в которых оцениваются в 250 млрд. т.
Сапропели применяются также в строительстве, нефтяной, газовой и химической промышленности.
Приведенные выше сведения о вещественном составе и областях применения сапропелей позволяют констатировать актуальность и своевременность проведения комплексных исследований последних с привлечением современных методов анализа, включая Фурье- ИК-, УФ/ВИС-, Н и 13С ЯМР- спектроскопию, хромато-масс-спектрометрию, капиллярную газожидкостную, адсорбционную жидкостную и препаративную тонкослойную хроматографию, элементный, эмиссионный спектральный, рентгено-флуоресцентный, атомно-абсорбционный, количественный функциональный, рентгенофазовый, структурно-групповой и химический групповой, экстракцию растворителями различной полярности, кислотный и щелочной гидролиз, озонолиз, гидрогенолиз и другие.
Особое внимание следует уделить разработке методологии биологического тестирования исходного сапропеля и различных продуктов, полученных из него.
Объектом настоящего исследования является ранее не изучавшийся сапропель р. Тихая Сосна Белгородской области Красногвардейского района.
В работе ставились следующие задачи: выполнить подробное комплексное исследование вещественного состава сапропеля, установить особенности структурной организации соединений органической, а также качественный и количественный состав минеральной части сапропеля, провести биологическое тестирование исходного сапропеля и различных препаратов на его основе, наметить рациональные пути применения последних; сравнительным анализом химического состава сапропелей различных месторождений выявлены особенности природы исходного биологического материала и условий его биогеохимической деградации для сапропеля Белгородской области.
Для решения указанных выше задач необходимо: обобщить и критически проанализировать литературные сведения о качественном и количественном составе сапропелей, генезисе, классификации, генетической связи соединений сапропелей с исходным биологическим материалом, методах изучения и областях применения сапропелей; разработать схему разделения сапропеля с получением большого числа продуктов, различающихся значением молекулярной массы, элементным, структурно-групповым и функциональным составом; выполнить экстракцию, кислотный и щелочной гидролиз, химический групповой, адсорбционную жидкостную, препаративную тонкослойную и капиллярную газожидкостную хроматографию, хромато-масс-спектрометрию, Фурье- ИК-, УФ/ВИС- и НЯМР- спектроскопию различных сапропелевых продуктов; провести биологическое тестирование исходного сапропеля и различных сапропелевых продуктов с использованием большого набора микроорганизмов, отдельных животных; предложить области эффективного применения сапропеля, а также продуктов, полученных из него; получить сравнительную характеристику вещественного состава сапропелей различных месторождений.
В первой главе диссертации приведен обстоятельный обзор литературных источников, позволяющий подробно рассмотреть и критически проанализировать различные точки зрения по вопросам генезиса и классификации сапропелей, современных взглядов на процесс сапропелеобразования, химического состава минеральной и органической частей сапропелей различных месторождений, методологии исследования сапропелей и продуктов, полученных из них. Особое внимание уделено исходному биологическому материалу, послужившему образованию сапропелей, его генетической связи с различными соединениями, определяющими состав органической массы последних, а также структурным особенностям компонентов формирующим биологическую активность сапропелей. Подробно описаны наиболее перспективные направления применения сапропелей.
Сделано заключение, что, несмотря на длительное время изучения и большое количество публикаций, до сих пор отсутствуют работы, посвященные детальному исследованию вещественного состава сапропелеи по единой методологии; уделено мало внимания установлению структурных особенностей соединений, отвечающих за их высокую биологическую активность, генетической связи компонентов органической массы сапропелеи с растительным и животным материалом, участвовавшим в сапропелеобразовании; крайне ограничены работы по биологическому тестированию сапропелеи и различных продуктов, выделенных из них, а также включающие получение сравнительной характеристики для сапропелеи различных месторождений, что необходимо для создания основ научной классификации сапропелеи. Все это доказывает актуальность и своевременность настоящей работы.
Во второй главе приведены методики исследования и экспериментальное оборудование.
Третья глава посвящена детальному комплексному исследованию особенностей вещественного состава сапропеля р. Тихая Сосна Белгородской области Красногвардейского района; приведены данные ботанического состава, технического, элементного, эмиссионного спектрального, рентгено-флуоресцентного и зоотехнического анализов, а также Фурье- ИК-спектроскопии исходного сапропеля; разработанная схема исследования, включающая экстракцию водой, органическими растворителями различной полярности, кислотный и щелочной гидролиз, химический групповой анализ, последовательную экстракцию и адсорбционную жидкостную хроматографию гуминовых кислот; дана подробная характеристика гидролизатов, экстрактов, элюатов, групп соединений отдельных сапропелевых экстрактов и минеральной части сапропеля.
Показано, что основу органической массы сапропеля составляют водорастворимые (11.3), легко- и трудногидролизуемые вещества (21.5 и 17.7, соответственно), гуминовые (11.2) и фульвокислоты (19.6), мас.% от ОМС. В составе водорастворимых веществ, уроновых и фульвокислот идентифицированы аминокислоты (L-a-аланин, лейцин, фенилаланин, валин, глицин, аспарагин, аргинин, лизин, гистидин, тирозин, цистеин, триптофан, глутамин, серии, изолеицин, треонин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты); сахара (арабиноза, D-галактоза, D-глюкоза, L-рамноза, лактоза, мальтоза, раффиноза); водорастворимые карбоновые кислоты (щавелевая, янтарная, адипиновая, пимелиновая, винная, яблочная, салициловая, о-фталевая, галловая, феруловая, винилиновая, сиреневая, терефталевая, бензойная, малоновая, метилянтарная).
Сделан вывод, что основное количество аминокислот, Сахаров и водорастворимых карбоновых кислот сапропеля связано в форме полипептидов, полисахаридов, сложных эфиров, поэтому они извлекаются только после кислотно-щелочного гидролиза ОМС.
Обобщением данных Фурье- РІК-, УФ/ВИС-, НЯМР- спектроскопии, криоскопии, элементного, количественного функционального, химического группового, капиллярной газожидкостной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии подробно охарактеризована битумная часть ОМС. Установлено, что в образовании сапропеля велика доля водорослевого углеводно-белкового комплекса, продуцирующего липиды, белки, углеводы, полисахариды, жиры, воски, нуклеиновые кислоты. Незначительное содержание ароматических соединенений, терпенов, абиетиновой, сиреневой, ванилиновой кислот является доказательством малой роли высшей растительности в сапропелеобразовании.
В составе гуминовых кислот методами Фурье- ИК-, УФ/ВИС-, 1НЯМР-спектроскопии, функционального анализа, а также препаративной тонкослойной хроматографии со свидетелями обнаружены ароматические, преимущественно неконденсированные, а также нафтеновые циклы, замещенные алкильными цепями различной длины, фенольные и спиртовые гидроксилы, карбоксильные, хиноидные, кетонные, алкоксильные и сложноэфирные группы, циклические ангидриды, пиридиновые, хинолиновые, изохинолиновые, пиперидиновые, пиррольные и нафтеновые циклы, первичные и вторичные амиды, порфирины, хлорофиллы "а", "Ь", "с", бактериохлорофилл "а", дикетоны, каротиноиды, производные витамина "А".
Отношение интегральных интенсивностей полос поглощения протонов -СН3 и -СН2- групп позволяет приписать среднестатистическому алкильному радикалу структуру СНз(СНг)б-. Отношение числа ароматических и алифатических протонов - 13:16. Присутствие в гуминовых кислотах паромагнитных центров обусловлено ионами Fe (II) и Со (III), что подтверждено эмиссионным спектральным и рентгено-флуоресцентным анализами.
В четвертой главе приведены данные биологического тестирования исходного сапропеля, а также гуминовых, гиматомелановых и фульвокислот, извлеченных из него, с использованием стандартных бактерий Esherihia coli (Е. coli), Staphylococcus aureus (St. aureus), дрожжеподобных грибов рода Candida, высокотребовательных микроорганизмов, например, C.diphtherie, для роста которых требуется среда с высоким содержанием амминного азота, глюкозы, нативного белка, что достигается введением в состав среды крови, сыворотки животных, а также анаэробной токсигенной культуры Clostridium perfringens. Исходный сапропель использовался в качестве пищевой добавки для скармливания морским свинкам и белым мышам.
Установлено, что большое содержание в сапропеле протеина, жира, клетчатки и микроэлементов сбалансировало рацион питания животных, и тем самым оказало положительное влияние на их рост и иммунитет, улучшило гематологические показатели крови. У опытных животных относительное развитие сердца, печени, желудка, тонкого и толстого кишечника уступало контролю, что, по-видимому, связано с более эффективным функционированием данных органов.
Показана высокая антибактериальная активность сапропелевых продуктов по отношению к использованным микроорганизмам. Отмечается избирательность воздействия исследуемых сапропелевых препаратов.
Бактерицидным эффектом по отношению к микроорганизмам обладают гуминовые кислоты в больших концентрациях, в минимальных концентрациях отмечается обильный рост нетребовательных Е. coli и St. aureus и умеренный рост высокотребовательных С. diphtherie и Candida, тогда как в отсутствии гуминовых кислот рост микроорганизмов на агаре отсутствует. Фульвокислоты вызывают угнетение роста микроорганизмов; причем, чем больше их концентрация, тем заметнее эффект угнетения, вплоть до отсутствия роста микроорганизмов. Гиматомелановые кислоты вызывают значительное размножение клеток микроорганизмов. Сделан вывод, что гуминовые, гиматомелановые и фульвокислоты, выделенные из сапропеля, могут быть успешно использованы в конструировании питательных сред для диагностики инфекционных заболеваний. Биологическая активность сапропелевых продуктов имеет положительную корреляцию с особенностями структуры соединений, определяющих их химический состав, предложены альтернативные пути рационального применения сапропеля и препаратов на его основе.
В пятой главе дана сравнительная характеристика сапропелей различных месторождений, изученных по единой схеме. Показано, что использование данных по выходу, качественному и количественному составу водорастворимых и легкогидролизуемых веществ, уроновых, гуминовых и фульвокислот, отношений C/N; ГК/ФК, элементного и функционального анализов позволяет получить информацию о природе биологического материала, участвовавшего в сапропелеобразовании, направлении и степени его деградации; оценить уровень биологической активности сапропеля и препаратов на его основе.
Биологическая стратиграфия озерных отложений
В качественной оценке сапропелей важную роль играет состав сохранившихся в них остатков объектов — водорослей, животных и высших растений [99-101].
Видовой состав и количество гидробионтов тесно связано с физико-химическими свойствами вод и режимом водоемов. В связи с этим в озере выделяются участки с однородными условиями обитания - биотопы. Ископаемые остатки водорослей и фрагменты водных животных повсеместно присутствуют в отложениях озер, являются их ярким отличительным признаком и используются для реконструкции условий палеосферы [99-101]. Результаты биологического изучения донных отложений водоемов позволяют определить основные этапы развития озер, расчленить толщу озерных отложений на стратиграфические горизонты, соответствующие историческим этапам в развитии [99-101].
В систематическом отношении водоросли — это основные сапропелеобразователи. В сапропелях находят остатки: диатомовых, сине зеленых, вольвоксовых, золотистых, зеленых, десмидиевых и протококковых [107-111, 243].
Диатомовые водоросли населяют водную толщу - планктон и дно -бенталь. Они лучше всего сохраняются в сапропелях, так как покрыты прочной стекловидной оболочкой, состоящей из кремнезема. Химический анализ панциря показал, что он состоит из аморфной формы кремнезема с плотностью 2,07. Толщина стенок панциря зависит от концентрации кремния в среде. В клетках содержатся девять пигментов: бурые — каротин /?- и є-; пять ксантофилов - фукоксантин, диатоксантин, неофукоксантины А и В и диадиноксантин; диатомин; хлорофиллы а и с. В процессе фотосинтеза у диатомовых водорослей образуется масло, служащее запасным питательным веществом. Кроме масла, для некоторых видов характерно наличие капель волютина. Конечным продуктом фотосинтеза являются жиры, а не углеводы.
Помимо неорганического вещества, диатомовым водорослям для роста и развития нужны небольшие количества ОВ. Очень хорошее воздействие на них оказывает витамин Вп [69,201].
Преобладающую численность в планктоне имеют кремнеземки. Систематический состав планктонных диатомей представлен следующими организмами: из перистых - синедра (Synedra) в виде тонких игл, астерионелла (Asterionella) - колонии в виде звездочки, фрагиллярия (Fragillaria), табеллярия (Tabellaria) - в виде лентовидных колоний, диатома (Diatoma) - в виде цепочковидных колоний.
Из центрических - планктон представлен колониальными формами в виде нитей мелозиры (Melosira), одиночными клетками - стефанодискус (Stephaodiscus), циклотелла (Cyclotella).
В бентосе из диатомей представлены виды следующих родов: гомфонема (Yompphhonema), цимбелла (Cymbella), пиннулярия (Pinnuloria), навикула {Navicula), ницшия (Nitzsschia), гиросигма (Yyroigno), сурирелла (Surirela).
Диатомовые водоросли используются в стратиграфических и палегеографических целях. Видовая и экологическая характеристика комплексов створок диатомий, найденных в осадках, позволяет. судить о процессе образования осадков и условиях среды в период образования. Количественное распределение диатомий позволяет определить температурные условия, существовавшие во время отложения осадков, и восстанавливать климатическую зональность прошедших эпох [69,107].
В среднерусских сапропелях наиболее часто встречаются отдельные виды, которые можно принять в качестве руководящих форм. Б. Перфильев [165] отмечал, что состав флоры и фауны водоемов определяет состав сапропелей. Видовой состав водорослей, макрофитов и животных имеет специфические черты в каждом типе водоема. Это характерно и для биологического состава сапропелеобразователей, которые откладываются в верхних слоях различных по трофности водоемов [99-101].
Дифференциально-термический и дифференциально-гравиметрический анализ
Спектры сняты на ИК - Фурье спектрофотометре модели Impact 400 d (фирма NICOLET США) в области спектра 1000 - 400 см 1 с образцов в таблетках из КВг. Диаметр таблетки - 3 мм. Количество сконирований - 16. 4h± Разрешение - 4 см 1. Формат - % Transmittance. Дополнительная обработка выравнивание базовой линии.
Отнесение полос поглощения в ИК-спектрах проводилось в соответствии с литературными данными [46,112, 160, 186].
Спектры ЯМР - Н записаны на Фурье - спектрометре INMFX - 90 Q (фирма IEOL, Япония) в частоте 89.6 МГц при комнатной температуре. В качестве растворителей использовались гексадейтеробензол, ацетон-о!б, &JL ДМСО-сІб, СДзОД. В этих растворителях не происходит гидролиза сапропелевых препаратов, а также доступна область, закрываемая обычно при использовании ДгО.
Методика эксперимента: 1-5 мг подготовленного образца растворяли в 0.6-0.7 мл дейтерированного растворителя. Раствор помещали в ампулу ЯМР- спектрометра (Ф 0.5 мм) и фиксировали спектр ЯМР - гН после сканирований. Общее число сканирований составляло 200-300 с накоплением сигнала в форме -ЯМР-спектра. Если образец полностью не растворялся, нерастворенную его часть помещали вне приемной катушки спектрометра. В качестве внутреннего стандарта использовали примеси в деитерированных " растворителях: C6HD5 (7.10 м.д.), ацетон-ds (2.05 м.д.), ДМСО-ds, или гексаметилдисилосан (0.05 м.д.) [73].
Спектры в УФ- и видимой областях снимались на СФ-46 в растворе спектрально чистых гексана, толуола, хлороформа, ацетона и этанола. Спектры ПС и ФК снимались в предварительно отфильтрованном 1% »w растворе NaOH. Концентрация растворов составляла 4 мг/100 мл. Кюветы кварцевые, длина рабочей грани 2 и 10 мм. Спектральная область 200 — 800 нм.
Режим экстинкции. Интерпретация электронных спектров проводилась в соответствии с литературными данными [73,175,198,199, 256].
Хромато-масс-спектрометрия и масс-спектрометрия выполнялись на приборе (Hewlett - Packard 5840 А, США). Условия анализа: колонка ?х кварцевая капиллярная с OV - 101 (0.2 мм х50 м); деление газового потока 1:100; объем вводимой пробы 0.05-0.10 мкл; температура испарителя хроматографа и ионного источника 300 и 250 С, соответственно; энергия ионизации 70ЭВ; скорость сканирования 2 с/спектр.
Обработка масс- спектров и их расшифровка осуществлялась с помощью ЭВМ с банком данных 600000 соединений различных классов. КГЖХ выполнялась на хроматографе модель 3700. Кварцевая - капиллярная колонка (0=0,1 мм, 1=50 м), стационарная неподвижная фаза OV - 101. Газ-носитель - Аг, детектор ДИП, температура 300 С; режим программирования; t = 150-290 С, скорость подъема 5 С/мин. Температурная программа: изотермическая выдержка при 150 С 5 мин; при 290 С-40 мин.
АЖХ осуществлялась на активированном при 110 С в течение 1 часа силикагеле марки АСКМ. Массовое соотношение: разделяемое вещество: силикагель = 1:100. Элюирование колонки продолжалось до достижения значения коэффициента преломления для исходного растворителя.
Анализ водорастворимых продуктов осуществлялся методом ТСХ на активированных стандартных пластинах "Silufol" 20x20 см. Длина пробега смеси растворителей - 100 мм. В качестве "свидетеля" использовались стандартные растворы индивидуальных органических кислот, Сахаров и аминокислот. Смеси элюентов и проявители:
Химический состав органической массы сапропеля (ОМС)
Основу аминокислот ВРВ составляют лейцин (612.22), аспарагиновая (153.84) и глутаминовая (105.75), треонин (75.72), фенилаланин (41.54), аспарагин (50.67) и тирозин (32.75), мае. % 10 2 от ОМС, как известно, наиболее стабильные при диагенезе. Меньший вклад вносят L - а - аланин (2.87), гистидин (2.21), глицин (1.54), валин (1.44).
Сахара представлены, в основном, D - галактозой (7.54), D - глюкозой (3.76), L - рамнозой (2.08); водорастворимые карбоновые кислоты: щавелевой (1.27), янтарной (0.78) салициловой (0.93), бензойной (0.59), малоновой (0.50), (мас.% 10 2 ОМС).
J11В (гемицеллюлозы), извлекаемые хлороводородной кислотой с массовой долей 2%, составляют 21.5 (мае. % ОМС), или 2.85 (мас.% от воздушно-сухого сапропеля). Среди аминокислот ЛГВ доминируют: гистидин (588.66), лейцин (395.66), аспарагин (335.03), фенилаланин (138.33), глутаминовая (98.47) и аспарагиновая (78.15); Сахаров: D - галактоза (79.17), D - глюкоза (39.53), L - рамноза (16.87), мальтоза (11.99); водорастворимых карбоновых кислот: янтарная (40.60), щавелевая (16.90), феруловая (11.22), метилянтарная (6.47), мае. % 102 ОМС. Среди других кислот представляют интерес ванилиновая, галловая, сиреневая, являющиеся, вероятно, продуктами окислительной деструкции дигидрокониферилового спирта, составляющего основу лигнина высших растений.
Достаточно велика доля УК, извлекаемых хлороводородной кислотой с массовой долей 12%, что составило 7.7 (мас.% ОМС), или 1.02 (мас% от воздушно-сухого сапропеля). Аминокислоты в основном представлены: глутамином (152.33), гистидином (55.47), валином (39.03) и глутаминовой кислотой (7.35), табл. 3.1.5.1.1. Для УК, по сравнению с ЛГВ, отмечается преобладание Сахаров и водорастворимых карбоновых кислот. Среди первых доминируют: D - галактоза (153.01)HD- глюкоза (81.19); в составе вторых -щавелевая (93.31), янтарная (71.87), салициловая (14.68) и метилянтарная (11.75).
Определенное количество аминокислот, Сахаров и водорастворимых карбоновых кислот соизвлекается при щелочном гидролизе сапропеля в ходе выделения ПС, определяя состав их водорастворимой части - ФК. Вероятно, при щелочном гидролизе расщепляются сложноэфирные связи, посредством которых аминокислоты связаны с макромолекулой ГК. Обнаружение моносахаридов (D - глюкозы, L - арабинозы) может быть следствием гидролиза сложных полисахаридов, фрагментарно включенных в макромолекулу ГК.
ФК обогащены лейцином (171.42), глутаминовой кислотой (226.77), треонином (169.63), гистидином (35.71), цистеином (35.71), изолейцином (35.71), D - галактозой (358.91), D - глюкозой (205.35), L - рамнозой (78.56), мальтозой (53.57), щавелевой (151.78), янтарной (107.14), салициловой (37.49), малоновой (14.28) и метилянтарной кислотой (21.43), мае. % 10 2 ОМС.
Сравнительный анализ позволяет сделать вывод, что основное количество аминокислот, Сахаров водорастворимых карбоновых кислот сапропеля связано в форме полипептидов, полисахаридов, сложных эфиров, поэтому они извлекаются только после кислотно-щелочного гидролиза ОМС (табл. 3.1.5.1.1).
Экстракция сапропеля осуществлялась согласно (глава 2) (рис. 3.1.5.1). Выход экстрактов (мае. % ОМС): гексановый (0.60), толуольный (0.66), хлороформный (0.94), ацетоновый (0.54), этанольный (0.56).
Молекулярная структура соединений, определяющих состав экстрактов, характеризовалась обобщением данных Фурье- ИК-, УФ/ВИС и НЯМР спектроскопии, криоскопии, элементного, количественного функционального, химического группового анализов, капиллярной газожидкостной (КГЖХ) хроматографии и хромато-масс-спектрометрии (ХМС).
Морская свинка (Cavia арегеа porcellus)
Молекулярная масса 1272 а.е.м., элементный (мас.% daf): С 64.7, Н 5.1, N 4.0, O+S 26.2 и функциональный состав (мг-экв / г): ХГ 9.05, ФГ 13.45, КрГ 5.10, КГ 0.98, ИЧ 2.10; Н/С(ат) 0.946; молекулярная формула C68.59H64.88N3.64O+S20.83.
Фурье ИК- спектроскопия ПС позволила идентифицировать п.п. следующих структурных фрагментов (v, см"1), (рис. 3.1.5.4.1.1 - 3.1.5.4.1.3): - ароматические, преимущественно, неконденсированные циклы (3000-3100, дублет 1500-1600, 1235, 1459, серия п.п. в областях 900-1200, и 650-900, 3030-3080, 1125-1175, 1070-1100); насыщенные циклы и алкильные заместители (2921, 2960, 2854, 1459, 1383, 725); фурановые гетероциклы (пл. 3125-3165, 1547, 1495, 1015-1030, 870, 740-802); интенсивные п.п. кислородсодержащих функциональных групп: фенольных и вторичных спиртовых (3300-3500, 3630, 3615, 1200, 1310-1410), карбоксильных (пл. 2600, 1700-1714, 1300), включая карбоксилат-ионы солей металлов (1418, 1546-1610, 515-570,470), метоксильных (2850-2830), хиноидных (1645, 1675), сложноэфирных и кетонных (1735-1740, 1175, 960), циклических ангидридов (1835-1850, 1765-1785), тропонов и трополонов (1653). Кроме того присутствуют аминогруппы и пиррольные циклы (широкая 3200, 3300-3550, 1680, несколько полос 1800-2200); пиридиновых, хинолиновых, изохинолиновых и пиперидиновых (3370-3300, 3450, 3450-3480, 1490, 1260-1360, 745) и тиофеновых гетероциклов (3040-3125, 1520, 1050, 680-755, 840, 865), первичных и вторичных амидов (1665-1617,1546-1520); валентных колебаний групп -ОН глинистых минералов (3710-3700, 3675-3670, 3640-3625, 3535-3525, 3520-3490) каолинита, галлуазита, мусковита, монтмориллонита, хлорита, гиббсита, гетита; диполей молекул НОН, групп -ОН, -NH, -СН в СН2 и СН3 - гумусовых веществ (3480-3470, 3425-3390, 3425-3405); НОН монтмориллонита, гипса, нонтронита, галлуазита (3425-3405); -O-Si-О кварца (1170-1150); S042 гипса, мирабилита (1200-1100); -Si-O каолинита, галлуазита, монтмориллонита, мусковита, микроклина (1050-1030); - деформационные колебания групп MeVI-OH...O, Si-O, С032\ НС03" (940-840); AlVI-0-H...O каолинита, бейделита; MgIV-0-H...O - хлорита (940-920); А1 -0-Н...0 каолинита, галлуазита, монтмориллонита (940-920); СОз" карбонатов (900-884); (Al, Mg)VI-0-H...O монтмориллонита, хлорита (865, 840); Si-O кристобалита, аморфного Si02, каолинита, монтмориллонита (810-884); Si-O - каолинита, мусковита, микроклина (770-755); Si-O кварца, талька, каолинита (700-680); Si-O кварца, микроклина, сапонита, талька, SO4 " гипса (680-660); Si-0-(Al, Mg)VI монтмориллонита, мусковита (550-525); Si-О - кварца, каолинита, хлорита, галлуазита, монтмориллонита, мусковита (477-465); -Si-O сапонита, талька (465,450).
УФ/ВИС- спектр ПС (рис. 3.1.5.4.1.1.4 - 3.1.5.4.1.1.6) характерен для присутствия в их составе ненасыщенных карбоновых кислот и их производных (200,220); нафталиновых колец (210,212,220,270, 240,310); л комплексов металлов с фенольными и хиноидными группировками (450-445); каротиноидов, производных витамина "А", дикетонов, ненасыщенных кетонов (450-455, 480-495, 415); сопряженных пиррольных циклов, типа порфиринов, хлорофиллов (450, 510, 545), порфиринов (408, 525, 760, 720); бензольных циклов (200, 260); хлорофилла "а" (420, 450-455, 340, 495, 645, 685, 700, 710-720), хлорофилла "Ь" (450-455, 580, 645), хлорофилла "с" (450-455, 645, 685); бактериохлорофилла "а" (475), А,- дикетонов (340-350, 280); ненасыщенных лактонов и сложных эфиров (200,220-230,240).
В НЯМР- спектре ГК (рис. 3.1.5.4.1.1.7) присутствует очень широкая п.п. ароматических протонов (от 8.5 до 6.3 м.д.), что указывает на наличие в ГК бензольных и нафталиновых колец, замещенных группами COOR, OR, Alk. Широкая полоса в области (5.0-4.0 м.д.) отвечает за сигналы групп СООСНг-, -ОСНз, -СН=СН-. В области высокого поля сигнал при 0.83 м.д. принадлежит протонам концевым СНз- групп; сигнал при 1.24 м.д. - СН2-протонам. Отношение интегральных интенсивностей данных полос поглощения позволяет приписать среднестатистическому алкильному радикалу структуру СН3(СН2)б-. Отношение числа ароматических и алифатических протонов - 13:16. Уширение всех сигналов указывает на присутствие в ГК парамагнитных частиц, вероятнее всего ионов Fe (II) и Со (III). Обобщение данных элементного, эмиссионного спектрального, рентгено-флуоресцентного, количественного функционального анализов, криоскопии, Фурье - ИК-, УФ/ВИС-, НЯМР- спектроскопии позволяет сделать вывод, что изученные ГК имеют весьма сложный, полифункциональный состав, включают, преимущественно, неконденсированные ароматические, фурановые, пиррольные и тиофеновые гетероциклы, с высоким вкладом алифатических заместителей, циклоалкановых фрагментов.
