Содержание к диссертации
Введение
Литературный обзор 12
1. Химический состав, свойства и области применения гуминовых кислот 12
1.1. Химический состав гуминовых кислот 12
1.2. Свойства и области применения гуминовых кислот
1.2.1. Природа физиологической активности гуминовых кислот 23
1.2.2. Применение гуминовых препаратов в медицине 2б
1.2.3. Применение углегуминовых препаратов в животноводстве и ветеринарии 28
1.2.4. Протекторные свойства буроугольных гуминовых кислот 30
1.2.5. Применение гуминовых кислот в сельском хозяйстве 32
1.2.6. Применение гуминовых кислотв промышленности зб
1.3. Химические свойства гуминовых кислот 38
1.3.1. Обработка гуминовых кислот азотной кислотой 39
1.3.2. Галоидирование гуминовых кислот 43
Выводы к елаве 1 47
2. Объекты исследования, методы анализа и аппаратура 53
2.1. Технический анализ углей 54
2.2. Элементный анализ 54
2.3. Определение молекулярной массы 54
2.4. Функциональный анализ 54
2.4.1. Определение фенольных гидроксилов 54
2.4.2. Определение алкоксильных групп
2.4.3. Определение гетероциклического кислорода 55
2.4.4. Определение йодного числа 56
2.4.5. Определение хиноидных групп 56
2.4.6. Определение кетонных групп 57
2.4.7. Определение карбоксильных групп \ 57
2.4.8. Определение сложноэфирных групп и лактонов 2.5. ИК-спектроскопия 58
2.6. Электронная спектроскопия 59
2.7. 1Я и 13С ЯМР-спектроскопия 60
2.8. Хромато-масс-спектроскопия 60
2.9. Эмиссионный спектральный анализ 61
2.10. Рентгено-флуоресцентный анализ 61
2.11. Дифференциально-термический анализ 61
2.12. Рентгеноструктурный анализ 62
2.13. Капиллярная газожидкостная хроматография (КГЖХ) 62
2.14. Структурно-групповой анализ 62
2.15. Выделение гуминовых кислот ?? 63
2.16. Тонкослойная хроматография (ТСХ) фульвокислот
2.16.1. ТСХ аминокислот 63
2.16.2. ТСХ углеводов 63
2.16.3. ТСХ водорастворимых карбоновых кислот 64
2.17. Химическая модификация гуминовых кислот L.Y1A. Обработка гуминовых кислот азотной кислотой 64
2.17.2. Галоидирование гуминовых кислот 65
2.17.2.1. Хлорирование гуминовых кислот 65
2.17.2.2. Бромирование гуминовых кислот 65
2.17.2.3. Иодирование гуминовых кислот 66
2.18. Определение галогенов 66
2.18.1. Поглощение хлораи брома 67 2.18.2. Поглощение йода 68
2.19. Определение биологической активности 68
2.20. Методика испытания на физиологическую активность д
2.21. Определение антибактериальной активности 70
3. Экспериментальная часть 71
3.1. Изучение химического состава гуминовых кислот бурых углей Подмосковного бассейна 71
3.2. Химический состав водорастворимой части гуминовых кислот- фульвокислот 74
3.3. Изучение химического состава гуминовых кислот методом адсорбционной жидкостной хроматографии 74
Выводы к главе 3 85
4. Химическая модификация гуминовых кислот и их биологическая активность 86
4.1. Модификация гуминовых кислот обработкой азотной кислотой 86
4.2. Модификация гуминовых кислот хлорированием 93
4.3. Модификация гуминовых кислот бромированием 98
4.4. Модификация гуминовых кислот йодированием ю2
4.5. Исследование биологической активности гуминовых кислот и продуктов их химической модификации по отношению к бактериям кишечной группы 106
4.6 Научные и практические рекомендации по использованию результатов работы
Выводы к главе 4 113
Общие выводы 114
Литература
- Применение гуминовых препаратов в медицине
- Определение гетероциклического кислорода
- Химическая модификация гуминовых кислот L.Y1A. Обработка гуминовых кислот азотной кислотой
- Модификация гуминовых кислот бромированием
Введение к работе
Актуальность исследования. Гуминовые кислоты(ГК) - важнейшая составная часть органической массы каустобиолитов, представляющая собой смесь достаточно высокомолекулярных веществ сложного строения, замещенных различными функциональными группами и алкильными цепями. Каждая из функциональных групп выполняет строго определенную роль. ГК являются эффективными комплексообразователями, мелиорантами, структураторами почвы, стимуляторами роста растений и животных, сорбентами тяжелых металлов и радионуклидов, остаточных количеств пестицидов и друга?! органических соединений, источником широкого набора биологически активных веществ. Они используются в медицине, технике, сельском хозяйстве, животноводстве, птицеводстве, ветеринарии, рыбоводстве. Однако, несмотря на столь большой перечень областей применения, дс настоящего времени отсутствуют общепризнанные теории, объясняющие механизм действия ГК, что обусловлено ограниченностью данных об их химическом составе. Обострение экологической обстановки, расширение набора различных заболеваний, необходимость производства экологически чистой сельскохозяйственной продукции также ставят задачу более широкого использования ГК. Поэтому актуальной становится проблема изучения их химического состава, повышения их биологической активности различными методами химической модификации, установления взаимосвязи состава с биологической активностью гуминовых препаратоп(ГП).
Исследования являлись составной частью НИР, проводимых е Тулгоспедуниверситете им. Л.Н. Толстого с 1972 г., Новомосковском институте Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева с 1997 г. в соответствии с заданиями АН СССР и корреспондировались с постановлением ГКНТ СССР от 27.02.89 г №101, о Государственной научно-технической программе «Экологически чистая энергетика», проект «Синтетическое жидкое тоапиво», а также с приказом ГК РСФСР по делам науки и высшей школы от 12.08.91 г № 716 о Республика некой научно-технической
программе «Наукоемкие химические технологии»; проірамм правительства РФ « Оздоровление экологической обстановки и охра) здоровья населения России» на 1993-2000 г. г Кроме того, выполнен данных работ включено в программы Российского фон, фундаментальных исследований «Университеты России».
Цели и задачи исследования. Основными задачами исследован являлись: выполнение детального изучения химического состаї буроугольных ПС с использованием широкого спектра современнь физико-химических методов анализа; разработка схемы разделен! буроугольных ПС с использованием растворителей различно полярности; разработка методов модификации буроугольных ІТС азотне кислотой и галогенами; проведение микробиологического тестировав препаратов ПС; установление взаимосвязи структурной организаци компонентов ГП с их биологической активностью; определение облаете эффективного использования модифицированных ПС.
Для решения поставленных задач было необходимо: обобщить критически проанализировать существующие сведения о химическої составе ГК различного происхождения; разработать схему и: комплексного исследования с привлечением современных физико химических методов анализа; подробно изучить исходные ПС и их узк» фракции, полученные адсорбционной жидкостной хроматографией выбрать оптимальные условия обработки ГК растворами азотної кислоты и галогенами; определить количественное содержание і динамику распределения различных функциональных групп отвечающих за биологическую активность ГК; провеет* микробиологическое тестирование ГП.
Научная новизна. Комплексом современных физико-химическим методов анализа, включая элементный, эмиссионный спектральный, количественный функциональный, структурно-груїтповой, криоскопию, ИК-, УФ- и 'Н ЯМР - спектроскопию, различные виды хроматографии, впервые детально изучен химический состав ПС бурого угля Кимовского разреза Подмосковного бассейна. Разработана эффективная схема адсорбционной жидкостной хроматографии, позволившая разделить буроугольные ГК на большое число узких субфракций, существенно
отлггчающихся значением молекулярной массы, природой и количественным содержанием функциональных групп, степенью ароматичности, нафтеновости и алкильной замещенности. В составе фульвокислот(ФК) методом препаративной тонкослойной хромтографией произведена идентификация колігчественного и качественного содержания аминокислот, Сахаров и водорастворимых карбонових кислот. В первые разработаны методы модификации ПС, включая обработку азотной кислотой, хлором, бромом и йодом. Выбраны оптимальные условия модификации ГК. Проведено биологическое тестирование ГП с использованием культур St. aureus и Е. coli. Установлено, что ГК, содержащие хлор, бром и йод и, особенно, обработанные азотной кислотой проявляют более высокую биологическую активность по сравнению с исходными. Выявлена взаимосвязь химического состава ГК и продуктов их химической модификации с уровнем биологической активности.
Выполненное исследование вносит вклад в решение одной из фундаментальных проблем современной медицины, а именно разработать метод получения биологически активных соединений га природного растительного и животного сырья, как средства повышения неспецифической резистентности организма.
Основные положения, выносящиеся на защиту: получены подробные сведения о химическом составе ПС, выделенных из бурого угля Кимовского разреза Подмосковного бассейна; схема адсорбционной жидкостной хроматографии ГК; результаты исследования их узких фракций комплексом современных физико-химических методов анализа; впервые полученные данные по химической модификации азотной кислотой и галогенами; результаты : биологического тестирования ГП.
Научные и практические рекомендации 1. Разработана схема разделения ПС, выделенных из бурого угля Кимовского разреза Подмосковного бассейна, на узкие фракции, которые изучены комплексом физико-химических методов анализа. Данная методика может быть полезна для исследования химического
состава продуктов различных способов переработки ископаемых топлив, природных битумов, тяжелых нефтяных остатков, экстрактов из растительного и животного материала.
-
Полученные сведения о химическом составе ГК дополняют и расширяют наши познания о структуре органической массы угля, строении ее отдельных фрагментов, генетической связи с исходным биологическим материалом; могут явиться научной основой для нового объяснения путей образования ГК. ..
-
Впервые разработаные методы модификации, включая обработку азотной кислотой, хлором, бромом и йодом, позволяют целенаправленно изменять структуру макромолекулы ПС и могут быть рекомендованы для получения препаратов с более высокой биологической активностью.
-
Данные по влиянию ПС и продуктов их химической модификации на рост и деление дрожжей, на всхожесть семян могут быть использованы при применении ГП в сельском хозяйстве, с целью получения высоких урожаев экологически чистой продукции.
-
Проведеное биологическое тестирование с использованием культур St aureus и Е. coli. позволяют рекомендовать ГП для применения в лечебных целях, в частности для лечения кишечных заболеваний.
-
Результаты работы могут быть введены в курсы Высшей школы по нефте- и углехимии, геоорганической, органической и аналитической химии, биохимии, палеоботанике, палеозоологии, геологии, палеогеографии, технологии переработки каустобиолитов. Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на
научно-технических конференциях молодых ученых и аспирантов (г.Новомосковск, НИ РХТУ им. Д.й. Менделеева); Международной научно-технической конференции по проблемам экологии и безопасности жизнедеятельности (г. Тула, ТГУ); ХШ Международной научно-технической конференции "Реактив - 2000" (г Тула, ТГПУ им. Л.Н. Толстого); Международном экологическом конгрессе "Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности" (Санкт-Петербург).
Публикации. По материаламдиссерташш опубликована 1 статья и тезисы 6 докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, іетьірех глав, изложенных на 156 страницах, включая \6рисунков и Ц таблиц, а также перечня используемой литературы из 275 наименовашгії та 25 страницах.
Применение гуминовых препаратов в медицине
Способность ГК оказывать благоприятное влияние на рост и развитие растений была обнаружена К.Нефедовым [88] и неоднократно подтверждалась И.Тюриным, С.Ваксманом и др. [1, 12]. Весьма детально вопрос физиологической активности (ФА) ГК был исследован Л.Христевой с соавторами [89 -91], которые показали, что ГК влияют на общий ход обмена веществ в растениях и, в особенности, на процессы дыхания и роста растений.
В [92, 93] показано, что под действием ГК у растений активизируется корнеобразование, за счет изменения селективности протоплазма-тических мембран, усиливается поступление воды и элементов питания. Исследованиями А.Горовой [94, 95] доказано, что ГК положительно влияют на все фазы митотического цикла клеток и вызывают увеличе-ние значений митотического индекса в 1,5 раза. Авторы [96, 97] показали, что ГК влияют на усиление поглощения кислорода, активизацию ферментных систем (каталазы, пероксиды, амилазы, инвертазы, альдо-лазы и др.) и углеводного обмена, усиление образования хлорофилла, увеличение содержания Сахаров и белка в сельскохозяйственной продукции. ГК снимают отрицательное воздействие высоких доз минераль-ных удобрений [98], ослабляют вредное воздействие на растения поч-воутомляющих веществ и радионуклидов, повышают устойчивость растений к токсическому действию тяжелых металлов [95], помогают снятию токсикозов у растений [95].
По вопросу природы ФА ГК, влияния на нее структуры и некоторых других параметров молекул последних, в литературе встречаются немногочисленные и достаточно противоречивые данные. Многие ученые указывают на прямую зависимость биологической активности ГК от степени их окисленности, которая определяется количеством карбоксильных и хиноидных групп в молекуле. [99 -106]
Авторы [99] показали, что гуминовые препараты, усвоенные растениями и достигшие хлорофильных зерен в пластинках листьев, способствуют интенсификации известной реакции фотосинтеза, протекающей между СО2 и Н20, в результате которой образуются клетчатка, сахар, крахмал - словом, вся растительная масса надземной поверхности. С помощью меченых атомов установлено, что наибольшей биологической активностью обладают ГК, подвергнутые глубокому окислению и особенно в случае, когда они содержат хиноидные группы.
У.Флайг [97, 100] также придерживается мнения, что физиологически активным началом в молекулах ГК являются производные о-хинонов, выполняющих роль дегидраз в окислительных процессах клетки и участвующих в формировании ауксиноподобных ростовых стимуляторов.
По мнению Л.Пивоварова [101], ведущая роль в ФА принадлежит ядерной части молекул ГК. В то же время показано [102], что в составе почвенного гумуса ГК обладают наиболее высокой ФА. Авторы [103, 104] полагают, что ФА ГК зависит от содержания карбоксильных и гид-роксильных функциональных групп в структуре молекул ГК. В.Цыпленков, С.Чуков [105, 106] сделали вывод, что наиболее объек-тйвным показателем общего уровня биохимической активности и соответственно биотермодинамической устойчивости ГК, является их парамагнитная активность, под которой понимается концентрация свободных радикалов (СР) органической природы.
Данный вывод находит подтверждение в работах И.Комиссарова [107, 108] и С.Алиева [109, ПО], которые установили, что ФА ГК связана с их парамагнитной активностью, однако не приводят каких-либо ка 25 чественных параметров этой зависимости. С.Чуков, В. Талашкина, М.Надпорожская [111] вывели уравнение регрессии зависимости ФА ГК чернозема и серых лесных почв от их парамагнитной активности, имеющее следующий вид: ФА = 0,31 +0,0014 КПМЦ (КПМЦ—концентрация парамагнитных центров). На КПМЦ и ФА ГК значительное влияние оказывают биогидро-термические условия гумусообразования. Низкая парамагнитная и ФА ГК могут быть в частности обусловлены относительным преобладанием в молекулах ГК алифатической части, что подтверждается данными 1JC ЯМР: соотношение "ароматического" углерода к "алифатическому".
В.Круглов, Е.Маякова, В.Раковский [112] считают, что ФА ГК определяется наличием в них полифенольных и хиноидных групп, а карбоксильных—обусловливает растворимость ГК в водных растворах щелочей. Установлено, что ФА различных ГК зависит от строения соединений, определяющих их состав, и физико-химических свойств.
Основополагающим в оценке ФА ГК является положение, что ГК как оксихинонкарбоновые структуры, находясь в ионодисперсном состоянии, могут проникать в растение и принимать участие в окислительно-восстановительных процессах клетки, положительно влияя на биоэнергетику растительного организма, ускоряя синтез белков, что в конечном итоге повышает урожайность и улучшает качество сельскохозяйственных культур. Кроме того, благодаря особенностям своего строения, ГК способствуют поступлению минеральных веществ в растение, структурообразованию, а также стимулируют рост и жизнедеятельность микроорганизмов [113]. Для повышения ФА ГК используют окисление, а также введение в молекулу ГК атомов галогенов и нитро-групп, что позволяет резко сократить их расход [114]. Окисление является одним из методов снижения молекулярной массы ГК. Низкомоле 26 кулярные фракции ГК легко проникают в клетку и обладают в плазме достаточной подвижностью. ГК позволяют интенсифицировать рост дрожжей, в которых активизируются процессы дыхания, размножения клеток, накопления биомассы, возрастает интенсивность потребления питательных компонентов среды, успешнее потребляются другие источники углерода (органические кислоты, углеводороды и т. д.), в биомассе дрожжей более интенсивно накапливаются ценные фосфорные и белковые компоненты [115, 116]. В первую очередь возрастает количество фосфора нуклеиновых кислот (29-30%, в контрольном 16-18%). Бурые угли являются ценным органическим комплексом для производства различных препаратов, обладающих физиологическим действием.
Определение гетероциклического кислорода
По вопросу природы ФА ГК, влияния на нее структуры и некоторых других параметров молекул последних, имеются немногочисленные и достаточно противоречивые данные. Способность ГК оказывать благоприятное влияние на рост и развитие растений была обнаружена К.Нефедовым и неоднократно подтверждалась И.Тюриным, С.Ваксманом и др. Весьма детально вопрос ФА ГК был исследован Л.Христевой с соавторами, которые показали, что ГК влияют на общий ход обмена веществ в растениях и, в особенности, на процессы дыхания и роста растений. Многие ученые указывают на прямую зависимость биологической активности ГК от степени их окисленности, которая определяется количеством карбоксильных и хиноидных групп в молекуле (У.Флайг, Л.Пивоварова, Л.Сторчай, А.Сумина, В.Цыпленков, С.Чуков, И.Комиссаров, С.Алиев, В.Талашкина, Н.Надпорожская, В.Круглов, Е.Маякова, В.Раковский, П.Глобин и др.). Так У.Флайг считает, что физиологически активным началом ГК являются производные о-хинонов; Л.Пивоварова - ядерная часть молекул ГК; В.Цыпленков, С.Чуков - парамагнитная активность, характеризуемая наличием в ГК свободных радикалов органической природы, И.Комиссаров, С.Алиев, В.Талашкина и Н.Надпорожская. В.Круглов, Е.Маякова и В.Раковский считают, что физиологическая активность ГК определяется присутствием в их структуре полифенольных и хиноидных групп.
Благодаря особенностям строения и физико-химическим свойствам действие ГК весьма разнообразно. Они имеют довольно широкое применение: медицина, животноводство и ветеринария, птицеводство, рыболовство, сельское хозяйство, техника. ГК способствуют поступлению минеральных веществ в растение, структурообразованию, а также стимулируют рост и жизнедеятельность микроорганизмов; позволяют интенсифицировать рост дрожжей, в которых активизируются процессы дыхания, размножения клеток, накопления биомассы, возрастает интенсивность потребления питательных компонентов среды, успешнее потребляются другие источники углерода (органические кислоты, углеводороды и т. д.), в биомассе дрожжей более интенсивно накапливаются ценные фосфорные и белковые компоненты. ГК, выделенные из растительных природных объектов, практически безвредны для крови, сердечно-сосудистой и эндокринной систем, жизненно важных органов на уровне патогистологических и гистохимических исследований. Они не вызывают аллергии и анафилаксии, патологической сенсибилизации к лекарственным веществам, апирогенны, не обладают тератогенными, эмбриотоксическими и канцерогенными свойствами. ГВ защищают или сохраняют почвенную биоту и растительный покров, лучше противостоят засухе или переувлажнению, меньше подвержены эрозии и дефляции, дольше сохраняют свойства при орошении, в том числе и при поливе повышенными дозами минерализованных вод. Кроме того, ГВ довольно прочно связывают многие радионуклиды, детергенты, пестициды, тяжелые металлы. ГК экологически совместимы с почвой и другими компонентами экосистем и активно способствуют стабилизации нарушенных биогеоценозов и нивелированию экстремальных погодных условий. Благодаря этому уменьшаются генетические и функциональные нарушения клеточного давления, восстанавливается нормальный клеточный цикл, ГК участвуют в регенерации однонитиевых разрывов ДНК. Многообразие химических реакций, в которые могут вовлекаться ГК, открывают широкие перспективы их использования в технике: улучшение электрических свойств аккумуляторов и качества глинистых растворов, применяемых при добыче нефти; получение железорудных окатышей, коксующих агентов, коагулянтов, дубителей, красителей, эффективных сорбентов широкого спектра металлов.
Положительный эффект применения биологически активных соединений растительного и животного происхождения при лечении различных видов онкологии и других видов заболеваний общеизвестен. Однако в настоящее время существует проблема повышения эффективности ГК, создания гуминовых препаратов с заданными свойствами, что может быть достигнуто в частности методами их химической обработки различными окислителями, а также введением в макромолекулу ГК атомов галогенов.
Методы модификация ГК изучены мало, причем обычно обработке подвергают исходный уголь. Так, окисление угля проводят с целью увеличения выхода ГК, для получения продуктов с большим количеством кислородсодержащих групп. В результате химическому воздействию подвергается и минеральная часть углей, что сказывается на биологической активности полученных соединений. Концентрированная азотная кислота также используется для окисления и нитрования твердого топлива с целью выяснения молекулярного строения его составных частей (Р.Смирнов, С.Гроскинский и др.). ГК, входящие в состав макромолекулы угольного вещества, мало подвержены окислению, в то же время для них характерна некоторая степень нитрования. Чжу-Чжи-пэй, Л.Рахамадран, И.Тоехару, С.Ютака, Х.Козо, Н.Гироасова, Н.Назарова и др. проводили исследования с целью получения нитрогу-миновых кислот. Химический состав нитрогуминовых кислот, полученных из бурого угля, изучали элементным и функциональным анализа-ми, криоскопией, ИК-, УФ/ВИС-, Н и IJC ЯМР спектроскопией. На основании исследований предложена эмпирическая формула нитрогуминовых кислот. Показано, что реакции нитрования могут быть перспективными для получения новых угольных продуктов, например нитрогуминовых кислот и азотсодержащих сорбентов, также наблюдается новый маршрут введения нитрогруппы в каркас макромолекулы ГК и угля.
Химическая модификация гуминовых кислот L.Y1A. Обработка гуминовых кислот азотной кислотой
ИК-, УФ-спектроскопией в составе отдельных элюатов ГК были идентифицированы следующие фрагменты.
Этанольно-уксуснокислотный (5.1) элюат: - интенсивные п.п. ароматических колец (3000-3100, дублет 1500-1580), причем интенсивность более высокочастотной ттолосы выше, что свидетельствует о повышенной степени конденсации; - малоинтенсивные п.п. насыщенных циклов (1470, 1270, 970, 560) и интенсивные п.п. алифатических -СН, -СН2 и -СНз групп (2975-2970, 2850, 2890, 1380, 1460, 1260). Интенсивность алифатических полос в элюате (4.6) весьма незначительна; - валентные С-0 колебания и плоские деформационные колебания комбинаций С-0 и О-Н групп фенолов (1140-1225, 1310-1410, 1080, 1010,1260-1350,1030-1125); - валентные колебания С=0 групп хиноидных циклов (1645, 1675); - валентные О-Н и С-0 колебания карбоксильных групп (2500-3300, 3500-3550, 880-950, 1690-1725, 1390-1450); -фурановые гетероциклы (1570-1605, 1475-1510, 1400, 825-880, 740-800); - непредельные С=С связи (675-680, 705, 910, 1415-1420, 1640 1650,1805-1830,3050-3080); - основная полоса кетонных карбонилов (1715-1720).
Бензольные (5.1-7.1) элюаты: - интенсивные п.п. ароматических колец (3000-3100, дублет 1500-1580), причем интенсивность более высокочастотной полосы выше, что указывает на повышенную степень конденсации, которая выше для соединений элюата (7.1); - малоинтенсивные п.п. циклоалканов (1470, 1270, 970, 560), которые более интенсивны для элюата (5.1); - интенсивные валентные и деформационные колебания -СН, -СН2 и -СН3 алифатических групп (2975-2970, 2850, 2890, 1380, 1460, 1260), особенно для элюата (6.1); - валентные С=0 колебания хинонов (1645, 1675); - валентные О-Н колебания спиртов и фенолбЪ (3400-3550), связанных внутри- и межмолекулярными связями (3405-3590); - валентные С-0 колебания и плоские деформационные О-Н колебания фенолов и спиртов (1140-1225, 1310-1410,1075,1005,1260,1350, 1025-1125), которые преобладают в ИК-спектре элюата (5.1).
Количество сложноэфирных групп и лактонных циклов незначительно (3450, 1745, 1775, 1210-1310, 1000-1150).
В качестве примеси присутствуют сульфиды (619, 680-700, 610), тиофеновые циклы (1050-1200, 1225-1260, 842). Хлороформные (5.2-7.2) элюаты: - интенсивные п.п. ароматических циклов (3050-3100, дублет 1500-1600), причем интенсивность более высокочастотной полосы не сколько выше, что свидетельствует о доминировании конденсированных ароматических колец, хотя присутствуют и неконденсированные (700-900), в частности, преобладают бициклические (750) и, вероятно, трицикл ические; - интенсивные п.п. насыщенных циклов, особенно в ИК-спектре элюата (5.2) (2915, 2950, 1470, 1270, 970) и алкильных цепей, с преобладанием для элюата (6.2); - возможно присутствие гидроароматических структур; -очень интенсивные п.п. пиррольных (3444-3400, 1565, 1500), пиримидиновых и пуриновых циклов (3060-3010, 1000-960, 825-775, 1580-1520), ароматических аминов (1250-1340, 1280-1350), сложных эфиров и лактонов (1785, 1775, 1745), карбоксильных (3300-3500, 2500-3000,1700-1725, 955-890, 1408-1280), кетонных (алифатических и ароматических) (1100, 1300, 1665, 1695, 1715) и хиноидных групп (1675), причем, как правило, хиноидные групп расположены в одном цикле (1,2- и 1,4-хиноны); - возможно присутствие кетонов терпенового типа, а также ме токсильных групп (2835-2850, 1210-1310, 1010-1050), кислород-и се росодержащих структур. Ацетоновые (5.3-7.3) элюаты высокой степени ароматичности состоят преимущественно из полициклических ароматических циклов (3030-3060, дублет 1500-1600, причем интенсивность более высокочастотной полосы немного выше, серия п.п. 1800-2000, 800-900).
В значительном количестве представлены насыщенные связи (1620-1680, 995-985, 905-915, 900-960,620-680,3020-3080, 1636, 1468, 1400-1430, 910, 990, 790-840), возможно со значительным вкладом терпеновых структур, доминирующих в элюатах (5.3) и (7.3).
Интенсивная широкая п.п. (3300-3500), а также (2500-3300, 1720, 1280, 980-995) указывает на достаточно высокий вклад карбоксильных групп; существенно содержание сложных эфиров (1745, 1250-1300, 1100-1050), с небольшой примесью пяти- и шестичленных лактонов (1770), доминирующих в элюате (7.3), который также обогащен спиртовыми гидроксилами (3630-3600, 1230-1140, 1150-1000) частично стероидных спиртов, особенно в элюате (5.3), фенольными (3600, 1140-1230, 1310-14140) и кетонными (1100, 1300, 1665,1695, 1715) группами. Во всех элюатах присутствуют пиррольные (3440-3400, 1565, 1500), пиримидиновые и пуриновые циклы (3060-3010, 1000-960, 825-775, 1580-1520), ароматические амины (1250-1340, 1280-1350), производные дибензофурана и тиофена (1050-1200, 1225-1260, 842, 3165-3125, 1570-1500, 1030-1015, 885-870, 600-740). Элюат(7.3) отличается высоким содержанием хиноидных групп (1,2- и1,4-хиноны) - (1675). Этанольные (5.4-7.4) элюаты характеризуются интенсивными п.п. ароматических колец (3010-3030, 1510-1605, 820-850). Повышенная интенсивность более высокочастотной полосы указывает на наличие конденсированных ароматических циклов (фенан-треновых, пиреновых);
Модификация гуминовых кислот бромированием
В то время как бромирование и хлорирование были проведены примерно в одинаковых условиях, ввести в этих условиях йод в ГК не удалось, что, очевидно, связано с его слабой электрофильностью. Для повышения активности йода были использованы различные окислители, такие как H2SO4, Н2О2, К2&2О7. Лучшим окислителем в нашем случае оказался пероксид водорода. Было исследовано влияние времени йодирования при 30 и 50С. Результаты анализа продуктов йодирования представлены в табл. 4.4.1, 4.4.2 и на рис. 4.4.1, 4.4.2.
Содержание йода в образцах не превышало 0,9 мас.%, что значительно меньше, чем содержание хлора и брома при тех же условиях. Причем в диапазоне времени от 6 до 8 часов произошли неожиданные изменения содержания йода и йодного числа: содержание йода резко упало, а значение йодного числа при этом увеличилось. (Такая зависимость наблюдалась как при 30, так и при 50С.) Вероятно, это можно объяснить обратимостью реакции йодирования в результате чего образуется йодистый водород, который не удается удалить из зоны реакции в виду того, что пероксид водорода, добавляемый в начале реакции (из-за малости введенного количества) успевает израсходоваться или разложиться (в зависимости от температуры процесса). Это также можно объяснить отщеплением йодистого водорода на последней стадии процесса, протеканием дегидрогалоидирования, в результате чего и образуются двойные связи в макромолекуле ГК. Йодитсый водород вызывает разрушение кислородсодержащих гетероциклов с образованием фе-нольных групп, которые затем отвечают за накопление хиноидных групп (табл. 4.4.1).
С целью получения более подробной информации о зависимости биологической активности ГК от их строения, о влиянии ГП на рост микроорганизмов были изучены антибактериальные свойства ГП, согласно методике, описанной в (2.22).
В качестве тест-культур были взяты стандартные грамположи-тельные и грамотрицательные бактерии Staphylococcus aureus (St. aureus) и Escherichia coll (E. coli), дрожжеподобные грибы рода Candida. Исследование проводилось методом стандартных дисков которые пропитывались растворами гумата натрия. Кроме этого был изучен эффект непосредственного воздействия ГК и продуктов их химической модификации на бактериальный «газон» (проба наносилась дозатором, объем пробы 20 мкл). Время инкубации 24 часа.
Результаты исследования иллюстрируют фотографии (рис.4.5.1 и рис. 4.5.2) и табл. 4.5.1. Видно, что по отношению к Е. coli препараты ГП 3, ГП 4, ГП 5 и ГП 6 обладают выраженным бактерицидным действием в концентрациях 5,56; 4,17; 3,33 и 4,0 г/л, соответственно, а растворы ГК в исследуемой концентрации таким действием не обладают. При воздействии гуматов натрия на патогенный стафилококк отмечено их бактериостатическое действие, что выражалось в торможении роста бактерий: в месте воздействия испытываемых препаратов на St. aureus бактерицидное действие не проявлялось. Следует подчеркнуть, что во всех случаях эффект ГП носит локальный характер.
Поскольку гуминовые материалы представляют собой сложные высокомолекулярные органические соединения, возможно затруднение и неравномерность диффузии ГП со стандартных дисков в агар. При непосредственном воздействии препаратов на бактериальный «газон» наблюдался лизис Е. coli в зоне капель ГП 3, 4, 5 и 6. Наиболее выражен антибиотический эффект в зоне капли ГП 6, что может быть связано с оптимальной концентрацией действующего вещества на бактерии кишечной группы. По отношению к St. aureus получены аналогичные по сравнению с методом стандартных дисков результаты.
Наиболее выраженный бактерицидный эффект ГП 3, 4, 5, 6 может быть связан как с высокой концентрацией в данной пробе хиноидных (особенно в ГП 6) и других кислородсодержащих групп, способных образовывать свободные радикалы (типа семихинон-радикалов).
Вероятность возникновения биологических эффектов определяется проницаемостью плазматической мембраны для молекул ГК, которая увеличивается с уменьшением молекулярной массы гуминовых препаратов. Относительно небольшие размеры молекулы ГП 6 способствуют ее диффузии во внутренний объем плазмалеммы, что делает принципиально возможным перенос макромолекулы внутрь бактериальных клеток и воздействие на их метаболизм.
По отношению к грибам рода Candida препараты ГП оказались неактивны, что, вероятно, связано, со сложностью диффузии гуминовых веществ через жесткую клеточную стенку грибов.
