Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор научно-технической литературы 9
1.1 Обзор рынка кормовых добавок, применяемых для профилактики и лечения заболеваний пищеварительной системы свиней 9
1.1.1 Статистический анализ рынка кормовых добавок России 9
1.1.2 Кормовые добавки для профилактики и терапии заболеваний желудочно-кишечного тракта молодняка свиней .15
1.2 Традиционная концепция выделения биологически активных веществ из сырья животного происхождения .22
1.3 Тканевая специфичность как перспектива совершенствования технологии биологически активных добавок 26
1.4 Заключение по обзору научно-технической литературы .31
Глава 2. Организация эксперимента, объекты и методы исследования .33
2.1 Объекты исследования 33
2.2 Организация и методы исследования 33
2.3 Методы исследований
2.3.1 Стандартные методы исследований 36
2.3.2 Протеомные методы 36
2.3.3 Методы извлечения целевых биологически активных веществ .37
2.3.4 Методы исследования биологической активности in vitro 38
2.3.5 Методы исследования эффективности in vivo 39
Глава 3 Результаты исследования сырьевых источников 44
3.1 Результаты исследования химического состава сырья 44
Глава 4 Обоснование режимов и результаты оптимизации технологии кормовой добавки 47
4.1 Научное обоснование параметров экстракции БАВ 47
4.1.1 Оптимизация скорости перемешивания и времени экстракции 53
4.1.2 Оптимизация соотношения экстрагент : сырье 57
4.2 Результаты сравнительного исследования полученных экстрактов 62
4.2.1 Результаты анализа аминокислотного состава .62
4.2.2 Результаты исследования белково-пептидного профиля полученных экстрактов 65
4.2.3 Результаты сравнительного анализа белково-пептидного профиля смешанных экстрактов 74
4.3 Комплексные исследования ультрафильтратов 77
4.3.1 Результаты анализа белково-пептидного состава ультрафильтратов 77
4.3.2 Результаты исследования биологической активности ультрафильтратов
in vitro .81
Глава 5 Оптимизированная технология кормовой добавки с использованием биотехнологических методов и исследование ее эффективности и безопасности методами in vitro и in vivo 83
5.1 Обоснование получения комплексной кормовой добавки 83
5.2 Результаты сравнительного исследования биологической активности кормовой добавки in vitro 86
5.3 Результаты исследования эффективности кормовой добавки in vivo .89
5.4 Результаты исследования безопасности кормовой добавки 93
Глава 6 Технологическая часть
6.1 Характеристика сырья и ингредиентов, используемых для производства кормовой добавки
6.2 Технология производства кормовой добавки 98
6.3 Методы испытаний безопасности, физико-химических свойств, аминокислотного и белково-пептидного составов кормовой добавки .101
6.4 Характеристика конечной продукции производства .103
6.5 Расчет экономической эффективности производства кормовой добавки 105
Заключение .107
Список литературы
- Кормовые добавки для профилактики и терапии заболеваний желудочно-кишечного тракта молодняка свиней
- Организация и методы исследования
- Результаты сравнительного исследования полученных экстрактов
- Результаты исследования эффективности кормовой добавки in vivo
Кормовые добавки для профилактики и терапии заболеваний желудочно-кишечного тракта молодняка свиней
Показано, что выращивание на рационах, сбалансированных по белку с учетом доступности лимитирующих аминокислот и состава «идеального» протеина, позволяет повысить продуктивность до 25 %, и снизить затраты корма на 15 % [58]. В настоящее время доказано, что некоторые аминокислоты являются активными регуляторами обмена веществ, специфично воздействуя на нейроэндокринную и иммунную системы, являясь медиаторными. Имеются убедительные данные, согласно которым аминокислоты (лизин, аргинин, лейцин) индуцируют секрецию инсулина и обладают гипогликемическим действием; аргинин, метионин, фенилаланин активизируют секрецию соматотропного гормона; аспаргиновая, глутаминовая кислоты, цистин, триптофан и глицин характеризуются иммунологической активностью и улучшают адаптивные способности животных при стрессах. Кроме того, показано, что для сохранности поголовья, обеспечения жизнедеятельности и продуктивности животных, оптимальными и сбалансированными рационами свиней, в том числе молодяка, считаются те, в состав которых входят не менее 80 питательных и биологически активных веществ (белки, незаменимые аминокислоты, клетчатка, крахмал, углеводы, жир, минеральные вещества, микроэлементы, витамины). Доказано, что недостаточное количество макро- и микроэлементов, витаминов и аминокислот может приводить к развитию различных патологических состояний, в том числе опосредованно связанных с заболеваниями ЖКТ [5, 29, 72, 75].
В современных условиях ведения отраслей животноводства применение витаминов и аминокислот является одним из наиболее важных звеньев в цепочке ветеринарных и зоотехнических мероприятий, направленных на получение высокопродуктивного поголовья. Показано, что в периоды интенсивного роста и пика продуктивности резко увеличивается потребление витаминов. Большинство витаминов, как правило, не обладают эффектом кумуляции в организме при том, что потребность в витаминах в процессе выращивания свиней возрастает, что обуславливает необходимость постоянного их введения в организм. Применение кормовых добавок и витаминно-минеральных премиксов позволяет эффективно контролировать и поддерживать содержание витаминов на определенном уровне на протяжении всего цикла выращивания. Кроме того, наблюдающийся в последнее время в ряде регионов РФ дефицит микроэлементов, в особенности цинка, кобальта, йода, магния в рационах сельскохозяйственных животных и птиц, опосредованно снижает перевариваемость и усвояемость кормов. В связи с этим широкую популярность в свиноводстве получили минеральные и витаминные добавки, а также премиксы и престартеры, углеводно-витаминно-минеральные и белково-витаминно-минеральные концентраты, способствующие быстрому достижению высокой энергии роста и снижению затрат корма на единицу продукции.
Все большее применение в российском животноводстве находят органические кислоты и антибиотические средства для снижения патогенной микрофлоры в воде для поения и кормах в связи с тем, что позволяют обеспечить эффективную защиту сельскохозяйственных животных от инфекционных болезней [55]. Применение органических кислот в животноводстве условно разделяют на четыре категории: для консервации сырья и комбикормов; для контроля патогенных микроорганизмов; обеззараживание питьевой воды; положительного влияние на питательные свойства корма. Доказано, что корм, обработанный органическими кислотами, дольше сохраняется, лучше усваивается животными, создает оптимальные условия для работы пищеварительных ферментов, тем самым способствуя повышению продуктивности. Наиболее распространенными органическими кислотами, входящих в состав кормовых добавок, являются сорбиновая, муравьиная, уксусная, молочная, пропионовая, лимонная кислоты [26]. Показано, что корм и питьевая вода, обработанные органическими кислотами, дольше сохраняются и лучше усваиваются животными. Это связано с тем, что муравьиная кислота, повреждающая пептидогликан – основной белок клеточной стенки бактерий, особенно эффективна против бактерий и дрожжей, а пропионовая кислота, ингибирующая метаболизм и синтез клеточного ДНК (в т.ч. Salmonella) – против плесени. Кроме того, органические кислоты создают оптимальные условия для работы пищеварительных ферментов, тем самым способствуя повышению продуктивности животных [49].
Несмотря на то, что в структуре российского производства кормовых добавок, доля антибиотических средств незначительна — не более 0,01 %, доля импорта превышает 60 %, что связано с большим спросом на этот тип добавок и отсутствием запретов на их использование на территории РФ. Однако, использование кормовых антибиотиков в животноводстве считается серьезной проблемой, вопреки тому, что эти продукты, являются стимуляторами роста, позитивно влияя на рост сельскохозяйственных животных и улучшая усвояемость пищи – прирост веса увеличивается до 50 %, так как их применение негативно влияет на здоровье человека, посредством его употребления продуктов животноводства с остаточными количествами антибиотиков, тем самым снижая чувствительность организма к фармакологическим средствам [57]. В настоящий момент страны Евросоюза полностью отказались от кормовых антибиотиков в животноводстве, однако в США, Канаде и Китае данные кормовые добавки широко применяются (до 90% животноводческих хозяйств). В последние годы на территории РФ особое внимание уделяется безопасности продуктов питания и защите потребителя, а, следовательно, контролю качества и безопасности продуктов животноводства. В том числе проводится мониторинг микробиологических загрязняющих веществ, различных продовольственных добавок, а также антимикробных препаратов [53].
Организация и методы исследования
Подготовку сырья – поджелудочной железы, слизистую оболочку желудков и двенадцатиперстной кишки – проводили следующим образом: удаляли сопутствующую соединительную ткань, у желудков отделяли слизистую оболочку. Далее проводили замораживание при температуре минус 40 С (Haier, Китай) в течение 24 часов, после дефростации (температура в толще блока минус 5 С) сырье измельчали в мясорубке (Kenwood, Англия) с диаметром отверстий 2 4 мм и гомогенизировали (IKA, Германия).
Оптимизация режимов экстракции. Экстракцию подготовленного сырья проводили на лабораторной диспергирующей установке (Лаботекс, Россия) при температуре 4-5 С. В качестве экстрагента использовали 0,9 % раствор натрия хлорида. В ходе экспериментов проводили отбор проб экстрактов для определения концентрации белка. Порядок отбора проб был следующим: до начала экстракции, каждые 5 мин в течение первых 30 мин, далее каждый час в течение 8 часов, отобранные пробы центрифугировали на центрифуге СМ-6М (ELMI, Латвия) при 3500 об/мин в течение 5 мин, затем отбирали надосадочную жидкость и определяли белок. Исследования белково-пептидного профиля 2 образцов каждого экстракта (1 образец с максимальным содержанием белка; 2 – максимального времени экстракции), результаты которого были проанализированы в соответствии с базой данных UniProt Protein DataBase. По окончанию процесса экстракты тканей поджелудочной железы отделяли от взвеси фильтрованием через путч-фильтр, экстракты слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки – центрифугированием при 12 000 об/мин при температуре +4 С в течение 5 мин на центрифуге Sigma 3K30 (Sigma Laboratory Centrifuges, Германия).
Ультрафильтрация полученных экстрактов проводили на установке Vivaflow 200 (Sartorius, Германия) с использованием полиэфирсульфоновых мембран с диаметром пор 5 кДа и 50 кДа под давлением Р-2,5 бар. 2.3.4 Методы исследования биологической активности in vitro
Исследование биологической активности образцов проводили в соответствии с [35] на эксплантатах желудка и кишечника 10-дневных куриных эмбрионов [56]. Для получения органной культуры клеток из эмбриона куриные яйца инкубировали при 38,5 С в увлажненной атмосфере с пониженной концентрацией углекислого газа в течение 10 суток в СО2-инкубаторе (Lamsystems, Россия), ежедневно переворачивая яйца. По окончании инкубирования, извлекали эмбрионы и выделяли ткани рудиментарных органов (желудка и кишечника) размером 1х1 мм, фиксировали их на стеклах с коллагеновой подложкой или в чашки Петри (Thermo Fisher Scientific, США) и инкубировали в стерильных условиях двустороннего ламинарного шкафа (Lamsystems, Россия) в течение 10-15 мин при температуре 37С для прикрепления к коллагеновому покрытию. Далее стекла с эксплантатами помещали в стерильные чашки Петри (SPL Lifesciences, Корея) и заливали приготовленной питательной средой с добавлением исследуемых образцов (100 или 150 нг/мл) в объеме достаточном для полного покрытия стекол, и культивировали в условиях CO – инкубатора при температуре 37,8 ± 1 С, концентрация углекислого газа – 5% в течение 48 часов [41]. Параллельно проводили контрольный опыт, внося в чашку Петри с эксплантатами тканей желудка и кишечника питательную среду, без добавления образцов, в том же объеме и культивировали при тех же условиях.
Питательная среда для культивирования культур клеток состояла из 35 % раствора Игла, 25 % фетальной сыворотки теленка (Sigma, США), 35 % раствора Хенкса, 5 % куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6 %), инсулин (0,5 ед/мл) (БиолоТ, Россия), бензил - пенициллин (100 ед/мл), глютамин (2 мМ). Биологическую активность оценивали по влиянию образцов на рост монослоя клеток или выселяющихся энтероцитов в зоне роста в культурах тканей желудка и кишечника. Исследование проводили прижизненно с помощью инвертируемого микроскопа (Ломо, Россия). Интенсивность роста тканей желудка и кишечника оценивали по величине индекса площади (ИП), который рассчитывается как отношение площади всего эксплантата ткани желудка или кишечника, включая периферическую зону роста, к исходной площади эксплантата ткани. За условную единицу площади принимали квадрат окуляр-сетки инвертируемого микроскопа (сторона квадрата 3,5 х 10 равна 150 мкм). Значения ИП выражали в процентах, значение контрольных образцов принимали за 100% [65]. Исследуемую субстанцию считали биологически активной, если ИП тканей желудка и кишечника после культивирования с добавлением исследуемой субстанции в концентрации 100 или 150 нг/мл не менее чем на 40% превышает данный показатель в контроле.
Исследования проводили на клинически здоровых конвенциональных крысах-самцах стока Wistar массой 240 ± 10 г (n = 45), полученных из филиала «Андреевка» ФГБНУ «НЦБМТ» ФМБА России (Московская область, Солнечногорский район, п. Андреевка), которых предварительно содержали в условиях карантина 5 суток. В течение всего эксперимента крысы содержались в клетках TECNIPLAST тип IV S в стандартных условиях вивария (температура 22±2 С, влажность 48±2%, освещения 12/12 (с 6.00 до 18.00 световой день)) при свободном доступе к воде и пище.
Результаты сравнительного исследования полученных экстрактов
Экстракция представляет собой процесс разделения смеси жидких или твёрдых веществ с помощью избирательного (селективного) растворителя (экстрагента). Традиционно, технологическая схема выделения биологически активных веществ (БАВ) из животных органов и тканей включает измельчение сырья, экстракцию, в ходе которой происходит выделение биологически активных веществ, центрифугирование для удаления нерастворимого осадка и сушку для удаления избыточной влаги.
Технология кормовой добавки «Колимак», представленная в рисунке 7, включает в себя экстракцию водно-солевым раствором, при гидромодуле 1:7, с использованием магнитной мешалки (150 об/мин) при температуре (5-10) С на протяжении 24 ч. Для оптимизации технологии извлечения БАВ далее рассмотрены гидродинамические факторы, такие как степень измельченности сырья, экстрагент, температурный режим и время экстракции, скорость перемешивания, соотношения сырье:экстрагент, влияющие на растворимость и биологическую активность белково-пептидных веществ.
Показано, что степень измельчения сырья коррелирует с выходом веществ в экстрагент. Однако необходимо отметить, что размер частиц сырья регламентируется во избежание загрязнения балластными веществами и механическими примесями [71]. Температура экстракции является одним из основных факторов, влияющих на выход целевых веществ в процессе экстракции. Повышение температуры с одной стороны способствует увеличению скорости диффузии за счет повышения скорости движения частиц и уменьшению вязкости растворителя, с другой стороны, повышение температуры может приводить к деструкции извлекаемых веществ.
В связи с высокой чувствительностью белковых и пептидных веществ извлечение и измельчение животных тканей необходимо проводить при низкой температуре (не более 4С), замораживание и дефростация сырья влечет за собой перемещение растворимых белков из клеток во внешнюю среду, вследствие механического повреждения кристаллами льда клеточных оболочек [97].
На полноту экстрагирования белково-пептидных соединений из животного сырья существенно влияет выбор экстрагента, определяемый степенью гидрофильности извлекаемых веществ: для извлечения полярных веществ с высоким значением диэлектрической постоянной используют полярные экстрагенты: воду, глицерин, метанол; для неполярных - уксусную кислоту, хлороформ, этиловый эфир, ацетон, растительные масла [71]. Для растворимых белков в основном используют буферные растворы с определенным значением рН, например, ацетатно-аммиачный, фосфатный, боратный, формиатный и др., в то время как для экстракции мембранных белков используют детергенты, взаимодействующие с гидрофобными поверхностями белка. В частности, для освобождения ферментов, прочно связанных с биомембранами митохондрий или других субклеточных структур. Из детергентов наиболее широко применяются дезоксихолат, додецилсульфат натрия (анионный детергент), тритон Х-100 и др., которые способствуют расщеплению белково-липидных комплексов и разрыву белково-белковых связей, разрушая четвертичную структуру белков, что может, в конечном итоге, повлечь потерю биологической активности [36].
В связи с этим, рационально рассматривать в качестве экстрагента солевой или слабокислый раствор. При этом стоит отметить, что слабокислая экстракция приводит к снижению рН в сторону изоэлектрической точки. Кроме того, при отклонении рН в кислую сторону может происходить активация протеолитических ферментов, приводящая к деструкции целевых белков [64]. Этот эффект можно нивелировать внесением в раствор солей, например, хлорида цинка, но такая операция, в свою очередь, может приводить к обогащению конечного экстракта нежелательными ионами.
Для выделения активных фракций БАВ традиционного применяют методы ультрафильтрации. Однако при разделении фракций необходимо учитывать свойства используемых мембран, так как высокая адгезия к поверхности мембран может приводить к существенным потерям целевых веществ белковой и пептидной природы [96]. В связи с чем, были выбраны нейтральные мембраны из полиэфирсульфона, обладающие низким адгезионными свойствами.
Одним из главных факторов экстракции является соотношение объемов экстрагента к экстрагируемым веществам (гидромодуль), обуславливающий выход целевых веществ в экстрагент за счет разности концентраций экстрактивных веществ в сырье и экстрагенте.
Скорость и продолжительность экстрагирования также влияет на процесс выделения БАВ. Интенсификация экстракции обеспечивается использованием динамического способа перемешивания, являющегося наиболее эффективным за счет конвективной диффузии в результате перемещения экстрагента относительно сырья. Интенсифицировать процесс экстрагирования возможно за счет использования туброэкстракции (вихревой), представляющей собой интенсивное перемешивание и одновременное измельчение сырья с помощью быстроходных мешалок с острыми лопастями. Высокая скорость перемешивания обеспечивает мгновенную конвективную экстракцию, за счет отсутствия неподвижного слоя экстрагента в частицах сырья, при этом время экстракции сокращается до нескольких часов [28].
Схема оптимизации технологии БАВ представлена на рисунке 8. Оптимизация технологии биологически активных веществ из органов желудочно-кишечного тракта свиней. Технологическое и экономическое обоснование технологии включало варьирование частных факторов – продолжительности экстракции (, мин), скорости перемешивания (, об/мин) и соотношения сырье:экстрагент (гидромодуль). В качестве экстрагента выбран изотонический водно-солевой раствор, температурный режим экстракции во всех экспериментах составил (4 - 5) С. Параметром оптимизации технологии выбраны концентрация выхода белка в экстрагент (г/л) для определения оптимального времени и скорости экстракции, а также белково-пептидный состав.
Продолжительность экстрагирования влияет на качественные показатели БАВ и экономическую составляющую. Предварительные исследования показали, что при экстракции органов и тканей желудочно-кишечного тракта продуктивных животных с размером частиц до 0,4 мм практически полное извлечение экстрактивных веществ достигается через 8 часов (480 мин), в связи, с чем продолжительность экстракции изменяли в интервале от 10 до 480 мин.
Скорость перемешивания варьировали в пределах 400 об/мин, 600 об/мин и 800 об/мин с учетом предварительных исследований. Экстракцию поджелудочной железы и слизистой оболочки желудка проводили при постоянном перемешивании с применением пропеллерной мешалки, чтобы создать осевой поток внутри емкости с раствором и сырьем и увеличить поверхность контакта твердой фазы с жидкой. Для слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки использовали якорную мешалку ввиду высокой вязкости сырья, для избежания локального перегрева экстракта и образования осадка на дне и стенках экстрактора.
Жидкостный модуль оказывает существенное влияние на выход экстрактивных веществ, соотношение экстрагента и сырья должно обеспечивать высокую скорость процесса экстрагирования, при этом необходимо учитывать экономическую целесообразность этой величины. Исходя из этого соотношение экстрагируемого сырья и экстрагента варьировалось: 1:3; 1:5 и 1:7.
Результаты исследования эффективности кормовой добавки in vivo
Электрофореграмма экстрактов слизистой оболочки желудка свидетельствует о присутствии структурных и функциональных высокомолекулярных и низкомолекулярных белков и пептидов в диапазоне молекулярных масс от 33 до 11 кДа, стимулирующих секрецию собственных ферментов поджелудочной железы (гастрин) [59], секрецию желудочного сока (секретин, потенциалзависимые калиевые KCNQ-каналы) [60, 80], обладающие антибактериальной активностью (лизоцимы С-1, С-2, С-3) [100], участвующие в регуляции клеточной пролиферации (гастрокин-3) [89], метаболизме глюкозы (глюкагон) [25], трансмембранном транспорте белков (селенопротеин С) [12, 101], являющиеся компонентами мембран органелл клетки (трансмембранный и биспиральный домены протеина 1) [102], участвующие в водно-солевом (аквапорин-3) [88] и ионном транспорте (бета-субъединица калий-АТФ-азы) [78] и окислительно-восстановительных процессах организма (дегидрогеназа семейства SDR) [93]; в диапазоне от 72 до 40 кДа, предположительно содержится нейропептид, ответственный за чувство боли (рецептор-ноцицептин) [83], участвующие в процессах апоптоза и формировании иммунитета (белок стимулятор интерферона) [98], транспорте кобаламина, ионов кобальта (транскобаламин - 1) [39] и углекислого газа, поддерживающие кислотно щелочное равновесие (анионообменный белок), а также ответственные за трансмембранный транспорт (АТФ-связанный кассетный транспортер подсемейства G); в дипазоне молекулярных масс от 175 до 83 кДа предположительно присутствуют белково-пептидные соединения, участвующие в окислении жирных кислот (альфа-субъединица митохондриального трехфункционального протеина (МТП)) [4], в регуляции работы ферментов, в том числе биосинтезе холестерина (3-гидрокси-3-метилглютарил-коэнзим А редуктазы) [82], а также в полимеризации нитей актина (домен LIM и актин-связывающий белок) [31], внутриклеточном транспорте (бета-белок оболочки) [90], в поддержании клеточного гомеостаза ионов натрия, калия (альфа-цепь К-АТФ-азы) [78] и ионов кальция (Са-АТФ-аза саркоплазматического ретикулума, кальций-транспортная АТФ-аза 1 плазматических мембран) [3, 22], участвующие в окислительно-восстановительных процессах организма (двойная оксидаза-2) [34].
В экстрактах двенадцатиперстной кишки выявлено наличие минорных белковых фракций в области 16 - 8 кДа, предположительно участвующих в процессах гликогенолиза (ВИП-пептид) [77], транспорте железа, образующегося при естественном разрушении эритроцитов (транспортер двухвалентных металлов) [8], в процессах гуморального иммунитета (фосфолипаза 2) [54] и 114– 20 кДа, предположительно участвующих в активации ингибиторов пептидаз (Ингибитор Na+/K+ -ATФазы) [2], в регуляции клеточной пролиферации (гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста) [48], реакциях врожденного иммунитета (белок 88-миелоидной дифференцировки первичного генного ответа) [43] и процессах пищеварения (глутамат карбоксипептидаза 2) [9], а также в активации панкреатических проферментов (энтеропептидаза) [47] (Таблица 8).
Анализ тканевой специфичности пептидного профиля исследуемых экстрактов в сравнении в мышечной тканью свиньи, проведенное с использованием системы ВЭЖХ, показал наличие соединений с отношением массы к заряду (m/z) в экстрактах поджелудочной железы в диапазонах молекулярных масс от 50 до 180 Да, а также небольшое количество пиков в диапазоне от 250 до 440 Да. При исследовании экстрактов слизистой оболочки желудка обнаружено 4 области пиков в диапазоне от 50 до 200 Да и от 390 до 420 Да с высокими значениями заряда ионов, значительное количество пиков в диапазоне от 700 до 900 и от 1300 до 1500 Да, однако, с пониженным значением заряда ионов. Анализ пептидного профиля экстрактов двенадцатиперстной кишки показал также наличие 4 областей с пиками в диапазоне от 50 до 200 Да и от 390 до 420 Да с высокими значениями заряда ионов, а также значительное количество пиков в диапазонах от 700 до 900 Да, от 1300 до 1420 Да с пониженными значением заряда ионов (Рисунок 15).
Анализ пептидного профиля показал, что в экстракте поджелудочной железы содержится незначительное количество пептидов с молекулярной массой менее 2000 Да – обнаружено 16 тканеспецифичных пептидов до 400 Да (Рисунок 15, А). Выявлено 33 тканеспецифичных пептида (до 1600 Да) в экстрактах слизистой оболочки желудка (рисунок 15, Б) и 35 пептидов (до 1000 Да) – в экстрактах двенадцатиперстной кишки (рисунок 15, В). Во всех экстрактах обнаружено 13 сходных пептидов, в экстрактах слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки - 9 сходных пептидов (Таблица 9).