Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Аналитический обзор 14
1.1 Обоснование выбора крови сельскохозяйственных животных как сырья для получения пищевых продуктов 14
1.2 Современные технологии первичной переработки крови 26
1.3 Направления использования вторичных сырьевых ресурсов в пищевой промышленности 51
1.4 Обоснование целей и задач исследований 72
ГЛАВА 2 Организация, оббекты и методы проведения исследований 75
2.1 Организация выполнения работы 75
2.2 Объекты исследований 78
2.3 Используемое оборудование 79
2.3 Методы исследований 81
ГЛАВА 3 Теоретическое и экспериментальное обоснование практического использования крови для расширения ассортимента пенообразователей и продуктов антианемической на правленности 103
3.1 Характеристика азотистых веществ 103
3.2 Исследование содержания углеводов, липидов и минеральных компонентов 121
3.3 Изучение теплофизических и физико-химических свойств 128
3.4 Заключение по третьей главе 131
ГЛАВА 4 Разработка способа стабилизации и фракционирования крови сельскохозяйственных животных 134
4.1 Изучение влияния стабилизатора-консерванта на физико-химические и микробиологические показатели крови 134
4.2 Исследование влияния параметров стабилизации на фракционный состав белков плазмы крови 142
4.3 Изучение технологических режимов фракционирования крови 149
4.4 Заключение по четвертой главе 161
ГЛАВА 5 Оптимизация параметров гидролиза белков эритроцитарной массы и изучение по казателей пенообразования плазмы свиной крови 163
5.1 Исследование закономерностей гидролиза белков эритроцитар ной массы лимонной и уксусной кислотами 163
5.2 Изучение показателей пенообразования плазмы свиной крови... 180
5.3 Изучение влияния технологических факторов на качественные показатели пенообразователя из плазмы свиной крови Q
5.4 Заключение по пятой главе 199
ГЛАВА 6 Разработка технологии сублимацион ной сушки крови и продуктов ее переработки 201
6.1 Оптимизация параметров обезвоживания плазмы крови 201
6.2 Обоснование применения жидкого азота в технологии сублимационной сушки 205
6.3 Замораживания крови жидким азотом 213
6.4 Изучение качественных показателей сухой крови, полученной методом сублимационной сушки с использованием жидкого азота... 218
6.5 Заключение по шестой главе 225
Глава 7 Исследование и разработка метода кон троля патогенных прионных инфекций вторичного сырья мясной промышленности 226
7.1 Определение образцов животного происхождения с наиболее высокой степенью потенциальной опасности в отношении патогенных форм прионного белка 227
7.2 Конструирование олигонуклеотидных праймеров для дифференциальной амплификации специфических последовательностей патогенного прионного белка 234
7.3 Выбор параметров и оптимизация процессов амплификации фрагментов гена PRNP патогенного прионного белка 242
7.4 Заключение по седьмой главе 256
ГЛАВА 8 Практическая релизация результатов исследований 259
8.1 Технология добавки для профилактики железодефицита (ТУ 9197-170-020683315-2013) 259
8.2 Технология пенообразователя из плазмы свиной крови (ТУ 9219-180-020683315-2013) 264
8. 3 Способ сублимационной сушки крови сельскохозяйственных животных (патент на изобретение № 2499210) 267
8.4 ПЦР-тест система для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота (Методические указания по использованию ПЦР-тест системы) 270
8.5 Устройство для переработки крови сельскохозяйственных животных и его применение (патент на изобретение № 2484639) 278
8.6 Заключение по восьмой главе 285
Заключение 286
Список литературы
- Современные технологии первичной переработки крови
- Используемое оборудование
- Изучение теплофизических и физико-химических свойств
- Исследование влияния параметров стабилизации на фракционный состав белков плазмы крови
Введение к работе
Актуальность темы исследований. Важным резервом повышения эффективности агропромышленного производства является комплексное использование вторичных сырьевых ресурсов и промышленных отходов переработки сельскохозяйственного и пищевого сырья. Вовлечение в производство вторичного сырья способствует решению экологических задач, расширению ассортимента продуктов питания и улучшению их качества.
Кровь сельскохозяйственных животных представляет собой ценное бело-ксодержащее сырье для производства пищевой, лечебной, кормовой и технической продукции. Количество и качество белков, входящих в состав крови, высокий уровень содержания железа в органически связанной форме предопределяет целесообразность более полного ее использования для производства продуктов питания.
Существующие технологии переработки крови сельскохозяйственных животных предусматривают ее дальнейшее применение в технических и пищевых отраслях промышленности. При этом часть технологий устарела и не всегда отвечает запросам современных потребностей соответствующих отраслей промышленности.
Одним из путей увеличения производства пищевой продукции из крови является внедрение безотходных и малоотходных технологических процессов, позволяющих осуществлять комплексную переработку данного вида белоксо-держащего сырья. При этом очень важным является выбор ключевого направления переработки крови сельскохозяйственных животных, одним из которых является получение противоанемических продуктов на основе гемового железа, выделенного из эритроцитарной массы крови. Плазма крови является источником высокомолекулярных белковых фракций и обладает значительным потенциалом пенообразования. Белки плазмы крови являются незаменимыми по аминокислотному составу, и их использование позволит повысить функциональную значимость продуктов.
Применение сублимации в технологии получения сухих продуктов из крови и продуктов ее переработки является неотъемлемой и важной технологической операцией. Подбор необходимых параметров сушки позволит получить качественный готовый продукт, способный долго храниться и обладающий хорошими технологическими показателями.
Таким образом, разработка высокоэффективных технологий комплексной переработки крови сельскохозяйственных животных для получения ингредиентов различной функциональной направленности является актуальной задачей.
При использовании мясного и вторичного сырья возможно обнаружение групп заболеваний, характеризующихся прогрессирующим поражением различных отделов нервной системы и имеющих необычный генетический механизм возникновения и развития, - так называемых прионных заболеваний. Контроль качества мясного сырья в этом аспекте является новой, быстро развивающейся областью биомедицинских исследований, которая в последние годы
приобрела важное научно-практическое значение. Профилактика прионных болезней основывается на контроле и недопущении в пищу инфицированных мясных продуктов или других продуктов убоя. Поэтому усовершенствование и разработка чувствительных, специфичных и экспрессных методов идентификации патогенной формы прионного белка являются актуальной проблемой.
Степень разработанности темы. Вопросам переработки вторичных сырьевых ресурсов мясной промышленности на пищевые и кормовые цели посвящены работы Л.В. Антиповой, Т.М. Гиро, В.М. Горбатова, Е.А. Евстафье-вой, А.И. Жаринова, Г.П. Казюлина, В.Б. Крыловой, М.Г. Курбановой, Л.С. Кудряшова, Т.Н. Лисиной, А.Б. Лисицына, А.Д. Неклюдова, В.В. Пальми-на, И.А. Рогова, Н.В. Тимошенко, В.А. Тутельяна, А.В. Устиновой, М.Л. Фай-вишевского, И.М. Чернухи, В.И. Шипулина и др.
Отдельные этапы работы выполнены в рамках:
федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме: «Исследование и разработка комплексной технологии переработки отходов сельского хозяйства, пищевой и зерноперерабатывающей промышленности в функциональные продукты питания», государственный контракт № 16.740.11.0058 от 01.09.2010 г.;
федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы» по теме «Разработка и применение молекулярно-генетических методов для идентификации и типирования возбудителей инфекционных болезней животных», государственный контракт № 16.512.11.2077 от 16.02.2011 г.;
федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» по теме «Разработка высокоэффективной технологии получения противоанемических продуктов на основе крови убойных животных», соглашение № 14.132.21.1763 от 1.10.2012 г.;
программы стратегического развития организации, где выполнялась настоящая работа.
Цель и задачи исследований. Целью работы является разработка и реализация комплексной технологии переработки крови сельскохозяйственных животных для получения ингредиентов и продуктов функционального назначения, а также разработка метода контроля прионных инфекций. Для достижения поставленной цели определены следующие задачи:
теоретически и экспериментально обосновать практическое использование плазмы и форменных элементов крови для расширения ассортимента пенообразователей и продуктов антианемической направленности;
разработать способ стабилизации и фракционирования крови с одновременным ее консервированием, направленный на сохранение нативности оболочек эритроцитов и высокомолекулярных белковых фракций, позволяющих использовать продукты фракционирования для выделения гемового железа и получения пенообразователя;
оптимизировать параметры гидролиза белков эритроцитарной массы с целью высвобождения гемового железа и образования аминопептидных ком-
плексов, изучить показатели пенообразования и влияние технологических факторов на свойства пенообразователя из плазмы свиной крови;
разработать технологию сублимационной сушки цельной крови и продуктов ее переработки;
создать высокочувствительный метод идентификации патогенной формы прионного белка, позволяющий значительно расширить количество объектов исследования и их характер, исключив при этом вероятность перекрестной контаминации;
использовать установленные закономерности для разработки технологических схем и рецептур комплексной переработки крови сельскохозяйственных животных, технических документов и внедрения результатов исследования в промышленность.
Научная новизна. Представлена концепция комплексной переработки крови сельскохозяйственных животных на базе рациональных режимов стабилизации, консервирования, фракционирования, гидролиза, применения сублимационной сушки для сохранения качественных характеристик вырабатываемых из крови продуктов, а также разработаны современные методы контроля возбудителей прионных инфекций крупного рогатого скота.
Разработан способ стабилизации крови и одновременного консервирования, предотвращающий ее свертывание, микробиологическую порчу, обеспечивающий сохранение нативности оболочек эритроцитов. Установлен состав стабилизатора, способствующий максимальному содержанию высокомолекулярных белковых фракций в плазме. Определены рациональные условия фракционирования крови с наименьшей длительностью процесса и с минимальными потерями железа из общего объема эритроцитов: фактор разделения, продолжительность процесса, температура.
Систематизированы и определены условия гидролиза белков эритроци-тарной массы лимонной и уксусной кислотами. Установлена корреляционная зависимость концентрации применяемой кислоты и массовой доли аминного азота, гемового железа, степени гидролиза. Доказано, что применение гидролиза белков эритроцитарной массы пищевыми кислотами способствует образованию гемового железа и аминопептидных комплексов с небольшой молекулярной массой. Теоретически обосновано и экспериментально подтверждено применение плазмы свиной крови для получения пенообразователя.
Обоснован метод и технологические режимы сублимационной сушки для обезвоживания плазмы крови и получения сухого белкового продукта.
Экспериментально исследован и научно обоснован состав реакционной смеси ПЦР-тест-системы, позволяющей осуществлять идентификацию патогенного прионного белка у животных, контроль качества сырья животного происхождения при производстве препаратов медицинского назначения, оценку содержания патогенной формы прионного белка в продуктах питания, производимых мясной промышленностью.
Теоретическая и практическая значимость работы. На основе теоретических и экспериментальных исследований сформулированы требования к
технологическим процессам, связанным с получением функциональных продуктов из крови сельскохозяйственных животных: параметры и условия стабилизации и фракционирования цельной крови, технологические аспекты переработки продуктов фракционирования крови, режимы сублимационной сушки готовых продуктов, разработана тест-система для идентификации возбудителей прионных инфекций.
Техническая новизна разработанных технологических решений подтверждена патентами РФ № 2499210 «Способ сублимационной сушки крови сельскохозяйственных животных», № 2484639 «Устройство для переработки крови сельскохозяйственных животных и его применение», заявками на патенты № 2014141863 «Способ получения продукта для профилактики железо дефицита из крови свиней и крупного рогатого скота», № 2014141874 «Способ получения пенообразователя из плазмы свиной крови», № 2014141875 «Белковая кормовая добавка «Biolsow» для рациона питания сельскохозяйственных животных». Разработаны и утверждены технические условия и технологические инструкции на получение функциональных продуктов: «Продукт для профилактики железодефицита» (ТУ 9197-179-020683315-2013 и ТИ 9197-179-020683315-2013), «Протеиновый пенообразователь из крови сельскохозяйственных животных» (ТУ 9219-180-020683315-2013 и ТИ 9219-180-020683315-2013), «Сухой продукт из крови сельскохозяйственных животных» (ТУ 9197-189-020683315-2014 и ТИ 9197-189-020683315-2014). Проведены производственные испытания разработанных технологий, произведена промышленная выработка функциональных продуктов по представленным технологическим инструкциям. Разработана ПЦР-тест-система, позволяющая осуществлять оценку содержания патогенной формы прионного белка животного происхождения в продуктах питания, производимых пищевой промышленностью. По результатам исследований разработаны методические указания по использованию ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка, проведены испытания чувствительности и достоверных сроков пригодности ПЦР-тест-системы идентификации патогенного прионного белка. Результаты исследований используются в учебном процессе ФГБОУ ВО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)» при подготовке бакалавров, обучающихся по направлению 19.03.01 «Биотехнология», 19.03.03 «Продукты питания животного происхождения», 16.03.03 «Холодильная, криогенная техника и системы жизнеобеспечения», магистрантов, обучающихся по направлению 19.04.01 «Биотехнология», а также при организации научно-исследовательской работы аспирантов.
Методология и методы исследования. При проведении исследований применяли комплекс общепринятых, стандартных и модифицированных методов исследований физико-химических, микробиологических, реологических свойств сырья и готовой продукции, в том числе описательные, аналитические, индуктивные и дедуктивные методы обобщения отечественной и зарубежной литературы по оценке существующих технологий производства функциональных продуктов из вторичных сырьевых ресурсов пищевой промышленности.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Параметры стабилизации и фракционирования крови сельскохозяйственных животных.
-
Технологии получения продукта для профилактики железодефицита, содержащего гемовое железо, и пенообразователя из плазмы свиной крови.
-
Способ сублимационной сушки продуктов переработки крови сельскохозяйственных животных.
-
Методика контроля прионных инфекций во вторичном сырье мясной промышленности.
-
Технологические закономерности получения ингредиентов и функциональных продуктов из крови сельскохозяйственных животных.
Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты работы докладывались на всероссийских и международных конференциях, симпозиумах и семинарах (Владивосток, Воронеж, Кемерово, Магнитогорск, Минск, Могилев, Семей, Ставрополь, Углич, Улан-Удэ).
Результаты диссертационной работы прошли апробацию на предприятиях биотехнологической, пищевой и холодильной промышленности: ООО «Альфа», 000 «Технохолод», НПО «Здоровое питание», «Крестьянское хозяйство Волкова А.П.», внедрены в производство 000 «МКС» в рамках лицензионного договора № 1/14 от 02.04.2014 г.
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в более чем 50 печатных работах, включая монографию, статьи в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации основных материалов диссертационных исследований: «Известия высших учебных заведений. Пищевая технология», «Фундаментальные исследования», «Вестник НГАУ», «Техника и технология пищевых производств», «Достижения науки и техники АПК», «Хранение и переработка сельхозсырья», «Вестник КрасГАУ», «Современные проблемы науки и образования», «Вестник Бурятской ГСХА им. В.Р. Филиппова», а также в журналах из баз цитирования Agris, Ebscohost (Food Science Source), Scopus, отчетах НИОКР, патентах РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, восьми глав, заключения, списка использованной литературы (406 наименований) и приложений. Основной текст изложен на 290 страницах, содержит 64 таблицы, 94 рисунка.
Современные технологии первичной переработки крови
Предотвращение свертывания крови упрощает технологический процесс, дает возможность сократить и механизировать весь цикл выработки кровепродуктов, сохраняет в составе крови все содержащиеся в ней белки, уменьшает вероятность гемолиза и микробиального загрязнения крови. Применение стабилизации позволяет сохранить в крови, используемой для пищевых и медицинских целей, полноценный белок фибриноген и увеличивает выход продукции за счет сохранения величины сухого остатка исходной крови.
При выборе стабилизаторов должна быть учтена продолжительность стабилизирующего действия, его влияние на гемолиз (в случае получения продуктов из плазмы) и на зольность готового продукта, расход стабилизатора, его стоимость и дефицитность, а при стабилизации пищевой крови -отсутствие токсического действия применяемых доз стабилизатора. Наиболее подходящими стабилизаторами являются те, которые подавляют ферментную систему свертывания крови. Стабилизаторы, действующие на другие звенья, не предотвращают возможного свертывания собираемой крови при ее соприкосновении со сгустками крови или с остатками дефиб-ринированной крови, содержащими активный тромбин.
Кровь, стабилизированная синантрином 130 и фибризолом, не свертывается в течение 3-4 суток. Хлорид натрия задерживает свертывание крови до 24 часов. При применении указанных стабилизаторов заметный гемолиз обнаруживается через 2 суток в случае хранения крови при комнатной температуре. При низких положительных температурах длительность безгемолизного хранения возрастает в 4 - 5 раз.
Задержать свертывание крови можно также действием низких температур, например если отделенную кровь немедленно заморозить, то при оттаивании она будет иметь жидкую консистенцию и лишь затем свернется. Наоборот, высокие и повышенные температуры ускоряют процесс свертывания крови.
Белок фибрин из крови удаляют дефибринированием, в результате чего она не свертывается. Дефибринирование крови - освобождение крови in vitro от белка фибрина. Дефибринированная кровь не свёртывается, эритроциты остаются в сыворотке во взвешенном состоянии.
Фибрин, образующийся в процессе свертывания крови, удаляют двумя способами. Кровь, используемую на пищевые и медицинские цели, дефибринируют немедленно после ее изъятия в ходе образования фибрина. Интервал времени между сбором крови и ее дефибринированием не должен превышать 1 минуты. К такому способу прибегают и при использовании в дальнейшем сепарирования крови.
По другому способу кровь, направляемую для производства технической продукции, дефибринируют после образования сгустка, разрывая нити фибрин-полимера. Выход сгустка фибрина в первом случае ЗОАЗОользовет 5-8 %, во втором — 20-25 %.
Пищевую кровь дефибринируют в дефибринаторах при помощи механических мешалок. Продолжительность процесса 4-5 мин. Дефибрини-рованную кровь сливают в приемную емкость через металлический сетчатый фильтр (диаметр отверстий в котором составляет 0,75 - 1 мм).
Техническую кровь дефибринируют путем измельчения сгустков крови и последующего отделения фибрина. Разбивание сгустков крови и измельчение нитей фибрина производят в аппаратах Ц-41-1 или МИК-1. Измельченный фибрин отделяют от жидкой крови процеживанием через металлическую сетку с диаметром отверстий 2-3 мм или отстаиванием в течение 30 мин. Выделяемые сгустки фибрина содержат значительное количество крови, которую вместе с фибрином используют для выработки кровяной муки. Потери крови можно уменьшить повторной обработкой сгустка в аппарате П-41-1 или отжатием из них крови на центрифуге.
Для предотвращения развития микробиологических процессов де-фибринированную или стабилизированную кровь, сыворотку, плазму и форменные элементы направляют на дальнейшую переработку сразу же после получения. Продолжительность хранения после сбора при 15С не должна превышать 4 ч для дефибринированной и стабилизированной крови и 2 ч для сыворотки, плазмы и форменных элементов.
Сроки хранения крови или сыворотки можно увеличить добавлением 10 %-ного насыщенного раствора хлорида натрия. В таком виде их можно хранить при температуре не выше 4С в течение 2 суток.
В качестве консервантов используют также аммиак, диоксид углерода, смесь цитрата натрия с бензойной кислотой и хлоридом натрия, пиро-сульфит натрия, молочную кислоту и другие вещества. Кровь, используемую для технической продукции, можно консервировать антисептиками: крезолом или фенолом в количестве 2,5 кг на 1 т крови, аммиаком в количестве 20 % и другими химическими веществами. При использовании крови и ее фракции на пищевые цели их консервируют холодом. Сроки хранения охлажденной крови весьма ограничены: плазму можно хранить при 0—2С не более 4—5 сут, при 4С —8 ч.
Кровь, плазму и сыворотку, помещенные в тару, можно замораживать в морозильных камерах и морозильных аппаратах. Для замораживания целесообразно использовать морозильные барабанные установки для выработки чешуйчатого льда. В этом случае исключается необходимость размораживания крови или ее фракции перед их использованием при производстве мясопродуктов. Продолжительность хранения крови при минус 10С составляет 6 мес.
Оттаивание крови сопровождается гемолизом. В настоящее время разработаны специальные установки для закрытого сбора крови, ее стабилизации, сепарирования, охлаждения и консервирования с помощью ЗІАЗІолческих реагентов. Их применение обеспечивает высокую производительность, хороший санитарный режим, возможность дистанционного контроля и регулирования процессов.
Используемое оборудование
Для осуществления процесса газонасыщения использовалась взби-вальная машина МВ-60 (диспергатор-взбиватель) (рисунок 2.4.4). Машина монтируется на фундаменте. На чугунной плите ее крепится пустотелая станина, имеющая направляющие для перемещения кронштейна, на кото-ром установлена рабочая камера (неподвижный бачок емкостью 60дм ).
В верхней части станины расположен электродвигатель, крепящийся фланцем к коробке скоростей. На вал электродвигателя насажено зубчатое колесо, приводящее во вращение сателлиты планетарной передачи, оси которых закреплены в корпусе водила. Сателлиты, вращаясь внутри неподвижного (солнечного) колеса, приводят к вращению водило, передающее в свою очередь вращение через коробку скоростей, зубчатую коническую пару и планетарный механизм взбивателю.
В корпусе коробки скоростей установлены два вала: верхний с жестко закрепленными тремя цилиндрическими колесами разного диаметра и с разным количеством зубьев и нижний (шлицевой) с подвижным блоком трех шестерен также разного диаметра и с разным количеством зубьев.
Принцип действия машины: вращение от вала электродвигателя передается сателлитам планетарной передачи коробки скоростей, водилу и верхнему валу коробки скоростей. Далее от одной из трех пар зубчатых цилиндрических и пары зубчатых конических колес вращение получает водило планетарной передачи исполнительного механизма. В результате взбиватель, находящийся в бачке, получает вращение вокруг двух параллельных осей. Продукт, находящийся в бачке, подвергается интенсивному перемешиванию (взбиванию) и насыщается воздухом. Приводным устройством механизма подъема и опускания бачка служат маховик, червячный редуктор и реечная пара. При работе с машиной МВ-60 на порожний бачок надевают надставку, а внутрь бачка опускают взбиватель. Собранный бачок устанавливают на кронштейне, надевают взбиватель и поднимают бачок до упора. После опробования машины на холостом ходу устанавливают нужную скорость и загружают в бачок продукты. При переключении скоростей следует учитывать, что машина имеет конечный выключатель, который в момент переключения отключает электродвигатель. По окончании процесса взбивания электродвигатель выключают и снимают взбиватель. Затем снимают бачок и выгружают продукт.
Микробиологические показатели оценивали путем подсчета колоний, выросших на чашках Петри с питательными средами. В качестве питательных сред использовали мясо-пептонный агар, картофельный и солодовый агары. Для определения общей обсемененности готового продукта готовили его водный раствор в соотношении 1:100, 1:1000 и 1:10000. Из каждого приготовленного раствора делали высевы на шести чашках Петри. Для этого стерильной пипеткой у пламени горелки отбирали 0,3 мл ферментного раствора и переносили на поверхность агара. После этого засеянные чашки Петри инкубировали в течение 48 ч. При температуре 37±2С. Общую бактериальную обсемененность исследуемых образцов рассчитывали как среднее арифметическое число колоний микроорганизмов на 1 г препарата для всех разведений. Определение общего количества дрожжей и плесневых грибов проводили в соответствии с ГОСТ 10444.12-88 путем посева в чашки Петри на сусло-агар. Для определения бактерий группы кишечной палочки использовали метод накопления путем посева на среде Кесслера с последующей идентификацией на среде Эндо согласно ГОСТ 9225-84. Определение сальмонелл проводили по ГОСТ Р 50480-93 путем посева на накопительную среду Кауфмана с последующим посевом на среде Эндо.
Определение содержания токсичных элементов, пестицидов, антибиотиков и радионуклидов: - свинца - по ГОСТ Р 51301 «Продукты пищевые и продовольствен ное сырье. Инверсионно-вольтамперометрические методы определения содержания токсичных элементов (кадмия, свинца, меди и цинка)», ГОСТ 26932 «Сырье и продукты пищевые. Методы определения свинца», ГОСТ 30178 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов», ГОСТ 30538 «Продукты пищевые. Методика определения токсичных элементов атомно-эмиссионным методом» и МУК 4.1.986 «Методика выполнения измерений массовой доли свинца и кадмия в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом электротермической атомно-абсорбционной спектрометрии. Методические указания»; - мышьяка - по ГОСТ Р 51766 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения мышьяка»; - кадмия - по ГОСТ Р 51301 «Продукты пищевые и продовольственное сырье. Инверсионно-вольтамперометрические методы определения содержания токсичных элементов (кадмия, свинца, меди и цинка)», ГОСТ 26933 «Сырье и продукты пищевые. Методы определения кадмия», ГОСТ 30178 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов», ГОСТ 30538 «Продукты пищевые. Методика определения токсичных элементов атомно-эмиссионным методом» и МУК 4.1.986 «Методика выполнения измерений массовой доли свинца и кадмия в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом электротермической атомно-абсорбционной спектрометрии. Методические указания»; - ртути - по ГОСТ 26927 «Сырье и продукты пищевые. Методы определения ртути» и МУ 5178 «Методические указания по определению ртути в пищевых продуктах».
Экспериментальные данные обрабатывали методом математической статистики на ЭВМ. Для дальнейшей обработки применяли пакет программ WinStat или Statistica 5.0.
Исследования с использованием метода ПЦР были осуществлены в соответствии с требованиями нормативно-технической документацией относительно определения патогенных микроорганизмов в продуктах переработки крупного рогатого скота. Общее расположение лаборатории, а также ее инфраструктура соот-ветствовует требованиям Методических указаний МУ 1.3.1888-04. «Организация работы лабораторий, проводящих исследования с патогенными биологическими агентами III-IV групп патогенности методом полимераз-ной цепной реакции».
Перед проведением исследований, вне зависимости от выбранного метода, осуществляли первичную обработку проб исследуемого материла. При анализе мягких материалов, легко поддающихся измельчению (мясо, сыр и пр.), отбирали усредненную пробу продукта массой 1г, измельчали при помощи стерильных скальпеля, ножниц и одноразового шпателя и гомогенизировали фарфоровым пестиком в керамической ступке, тщательно перемешивая содержимое. Пробы сухих сыпучих материалов (желатин) и жидких или полужидких материалов (молоко, кровь и пр.), не требующих измельчения и однородных по составу, при помощи одноразового шпателя или пипетированием вносили в чистую пробирку типа «Эппендорф» в количестве 100-150 мкл по насыпному объему (5-7 мм от дна пробирки). Для предотвращения возникновения перекрестной контаминации инструменты для измельчения материала использовали однократно, тщательно мыли и стерилизовали после использования или при переходе от пробы к пробе.
При выделении различных фракций белков животного происхождения проводили предварительную подготовку образцов: мышцы различных животных тщательно освобождали от жира и соединительной ткани, навеску массой 3-4 г тщательно измельчали ножом на часовом стекле. К навеске измельченного сырья приливали дистиллированную воду в соотношении 1:6 (по массе) и проводили экстракцию на холоде при 0С в течение 30 мин. Затем центрифугированием при частоте вращения 83 с"1 в течение 5 мин отделяли осадок. Надосадочную жидкость осторожно декантировали и использовали для количественного определения белков.
Изучение теплофизических и физико-химических свойств
При температуре 30С (рисунок 5.1.2 а) для крови КРС характерна наибольшая степень гидролиза при использовании кислоты У 10% и находится на уровне 30,3%, для кислот Л 10% и У5% величина степени гидролиза не превысила 28,0 % при этой температуре. Для всех кислот максимальное значение степени гидролиза достигается при 10 часах и имеет относительную стабильность в течение последующих двух часов.
При температуре 30С (рисунок 5.1.2 б) для свиной крови наибольшая степень гидролиза достигнута при использовании кислоты У 10% и находится на уровне 29%, для кислот Л 10% и У 5% величина степени гидролиза не превысила величины 26,5 % при этой температуре. Для всех кислот максимальное значение степени гидролиза достигается в течение 10 часов и имеет относительную стабильность в течение последующих двух часов процесса.
Для крови КРС степень гидролиза при температуре 35С (рисунок 5.1.3 а) имеет общий характер, что и при 30С. Имеется 2 периода: первый период - постоянное увеличение и второй период - относительно стабильный уровень степени гидролиза. Для кислоты У 5% первый период длится в течение 9 часов, второй период в течение последующих трех часов, максимальное значение степени гидролиза находится на уровне 29,8%.
Степень гидролиза при температуре 35С (рисунок 5.1.3 б) для свиной крови характеризуется схожей картиной, что и при 30С. Имеется 2 периода: первый период - постоянное увеличение и второй период - относительно стабильный уровень степени гидролиза. Для кислоты У 5% первый период длится в течение первых 9 часов, второй период в течение последующих 3 часов, максимальное значение степени гидролиза находится на уровне 29,8%. Для кислоты Л 10% первый период длится в течение 10 часов, второй период в течение последующих двух часов, максимальное значение степени гидролиза находится на уровне 27,0%.
При температуре 40С (рисунок 5.1.4 а) для крови КРС характерна похожая картина, что и для свиной крови при этой же температуре. Для кислоты У 5% первый период длится в течение 9 часов, второй период в течение последующих 3 часов, максимальное значение степени гидролиза находится на уровне 30,2%. Для кислоты Л 10% первый период длится в течение 10 часов, второй период в течение последующих двух часов, максимальное значение степени гидролиза находится на уровне 27,5%. Для кислоты У 10% первый период длится в течение 9 часов, второй период в течение последующих трех часов, максимальное значение степени гидролиза находится на уровне 31,0%.
Для свиной крови при температуре 40С (рисунок 5.1.4 б) отличия в значениях степени гидролиза от температуры 35С незначительны. Для кислоты У 5% первый период длится в течение 9 часов, второй период в течение последующих трех часов, максимальное значение степени гидролиза находится на уровне 30,2%.
Для кислоты Л 10% первый период длится в течение десяти часов, второй период в течение оставшихся двух часов, максимальное значение степени гидролиза находится на уровне 27,9%. Для кислоты У 10% первый период длится в течение девяти часов, второй период в течение последующих трех часов, максимальное значение степени гидролиза находится на уровне 32,3%.
В следствие того, что величина степени гидролиза зависит от значения температуры, при этом, разница при использовании температуры 35С и 40С отличается не более чем на 2% можно считать, более оптимальным использование температуры 35С при гидролизе эритроцитарной массы крови крупного рогатого скота и свиней.
В таблицах 5.1.3 и 5.1.4 сведены оптимальные параметры получения продукта для профилактики железодефицита, необходимые для максимального накопления аминного азота, максимального выхода гемового железа и степени гидролиза, а также физико-химические показатели готового гидролизата.
Подводя итоги исследований влияния параметров гидролиза на выход аминного азота, содержание свободного гемового железа, а также степень гидролиза, можно сделать следующие заключения. Для ведения гидролиза эритроцитарной массы крови свиньи и КРС можно использовать следующие варианты кислот: уксусная кислота концентрацией 5%, лимонная кислота концентрацией 10%, и уксусная кислота концентрацией 10%. Все варианты имеют положительный эффект гидролиза.
Конечный продукт гидролиза ЭМ крови свиньи имеет определенные различия по физико-химическим показателям с конечным продуктом гидролиза ЭМ крови КРС. Различия по содержанию аминного азота, свободного гемового железа, а также степени гидролиза были описаны выше. Количественные показатели сухих веществ гидролизата ЭМ крови КРС находятся в пределах 24-К26%, а для гидролизата ЭМ крови свиньи они несколько выше и находятся на уровне 26-К28%.
Что касается водородного показателя рН, как для гидролизата ЭМ крови КРС, так и для гидролизата ЭМ крови свиньи, он находится на уровне 5,1; 5,2 и 5,6. Значения массовой доли влаги имеют различия: для гидролизата ЭМ крови КРС это величины 75 -80%, для гидролизата ЭМ крови свиньи это величины 72 -75%.
Исследование влияния параметров стабилизации на фракционный состав белков плазмы крови
15ВЗ-1 и 15ВЗ-2 связаны с Р-листами, которые накапливаются в PrPSc и 15ВЗ-3 распознает аминокислотные остатки вблизи С-конца. 15ВЗ является антителом, которое специфически распознает в аберрантно сложенном виде белок PrPsc, а не нормальные молекулы РгР (РгРс). Компанией «Prionics» экспериментально было установлено, что 15ВЗ реагирует с патогенными РгР прионами человека, крупного рогатого скота, овцы, оленя, мыши и хомяка, но не реагирует с нормальными РгР прионами. Поэтому 15ВЗ может использоваться в качестве детектирующего антитела для дальнейшего анализа.
В качестве связующего звена между антителом и ДНК репортером был выбран стрептавидин-биотиновый комплекс.
Одна молекула стрептавидина состоит из четырех идентичных субъединиц, способна взаимодействовать с четырьмя молекулами биотина, что позволяет использовать его как связующую молекулу между двумя био-тинсодержащими соединениями. В этом случае ДНК- хвост тоже биотини-лируют, а стрептавидин выполняет функцию мостика, соединяя две молекулы, содержащие остатки биотина. Получение конъюгатов (антител и ДНК с биотином) сопровождается минимальными изменениями их иммунологической активности.
Непосредственно проектированию праймеров предшествует предварительный этап построения подробной модели гена-мишени или иной по 239 следовательности нуклеиновой кислоты, которую планируется амплифи-цировать. Для проведения иммуно-ПЦР анализа была необходима ДНК-матрица (ДНК-хвост).
Для того, чтобы снизить риск ложных срабатываний за счет экзогенных загрязнений ДНК, был разработан ДНК-хвост, которого не существует в природе. Была построена синтетическая последовательность, длиной 194 п.н. (учитывая, что наиболее оптимальной длиной считают фрагменты в диапазоне 150-300 пар оснований), полученная случайным образом (рисунок 7.2.4).
Созданная последовательность была проанализирована в GenBank с помощью программы «BLAST». Используя данную программу, сравнили имеющуюся последовательность с последовательностями из базы данных и определили наличие гомологов. Анализ показал, что созданные нуклео-тидные последовательности гомологов не имеют.
Одними из ключевых компонентов реакции являются «праймеры» -синтетические олигонуклеотиды длиной 20-30 нуклеотидных пар. Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы 3 -концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. Длина амплифицируемого фрагмента определяется расстоянием между праймерами [64].
При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклео-тидных праймера. Праймеры подбираются таким образом, чтобы синтез с помощью полимеразы протекал только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента.
Конструирование праймеров, возможно, наиболее критический параметр для успешного проведения ПЦР. Последовательность праймера определяет целый ряд показателей, таких как позиция и длина продукта, его температура плавления и выход продукта. Плохо сконструированный праймер может привести к малому количеству продукта, или его отсутствию, вследствие неспецифической амплификации и/или образования ди-мера праймера, который может стать конкурентным настолько, что будет подавлять образование продукта [89].
Для правого праймера температура плавления равна: tm =59,80С, для левого - tm=60,25C. Температуру отжига принимают на 4-5 градусов ниже, чем температура плавления. Следовательно, оптимальная температура соответствующего режима в программе амплификации (температура отжига) - ta будет составлять: для левого праймера: ta =56С; для правого праймера: ta=55,80C. В таблице 7.2.2 представлены основные характеристики конструирования праймеров.
Вторичная структура праймера Праймер не должен укладываться во вторичную структуру, температура плавления которой была бы эквивалентна или выше tm праймера Удовлетворяет (проверено с помощью программного пакетаMfold 3.2)
Вторичнаяструктурасайта-мишени Сайт-мишень не должен укладываться во вторичную структуру, температура плавления которой была бы эквивалентна или выше tm праймера Удовлетворяет(проверенос помощью программногопакетаMfold 3.2)
Гомо- и гетеро-димеризацияпраймеров Исключается, особенно по 3 -концу Удовлетворяет(проверенос помощью программногопакета Hybrid)
Специфичность праймера Комплементарность по отношению к сайту-мишени, близкая к 100%; менее 70% гомологии с другими нук-леотидными последовательностями Удовлетворяет(проверено с помощьюпрограммы BLAST)
Таким образом, на данном этапе исследования была построена синтетическая последовательность, длиной 194 п.н., полученная случайным образом (ДНК-хвост). Анализ в GenBank с помощью программы «BLAST» показал, что созданная последовательность и последовательности базы данных гомологов не имеют.
К синтезированному ДНК-хвосту подобраны 2 праймера размерами 20 п.н. С помощью программы «РгітегЗ» подобраны параметры для соответствующих праймеров. Для обеспечения максимального выхода и специфичности продукта необходимо оптимизировать 3 стадии процесса амплификации - денатурация, отжиг, элонгация. Для обеспечения полной денатурации матрицы ДНК, инактивации посторонних белков, присутствующих в пробе, достижения всей системы единой температуры и лучшего перемешивания компонентов проводили предварительный нагрев. Первоначальный прогрев реакционной смеси обычно проводят при температуре 90-95С в течении 1-3 мин. В данном исследовании предварительный нагрев проводили при температуре 95С в течении 1 мин.
Первый этап амплификации - денатурация проводится при температуре 92-95С на протяжении 30-120 сек. Температура и время денатурации выбираются исходя из оптимального временного периода для наиболее полного денатурирования и сохранения матрицы и Taq ДНК-полимеразы, которая добавляется в реакционную смесь только после этапа предварительного нагрева (во избежание ее инактивации).
По расчетным данным длина амплифицируемого участка должна составлять 153 п.н. Эффективность амплификации при разных температурах отжига праймеров оценивали в диапазоне от 93 до 95С, время проведения денатурации - 30 сек. Анализ полученных электрофореграмм показал, что при температуре денатурации 93 С и 94С продуктов реакции амплификации не обнаружено (рисунок 7.3.1). Следовательно, процесс денатурации целесообразнее проводить при температуре 95С.