Введение к работе
1 1.1 Актуальность работы
Африканская чума свиней (АЧС) - вирусная болезнь, характеризующаяся контагиозностью и летальностью, получила в настоящее время широкое распространение на европейской территории Российской Федерации.
Одним из основных белков вируса АЧС является структурный белок vp30 входящий в состав внутренней мембраны вириона. vp30 имеет важное диагностическое значение, поскольку синтезируется на ранних и поздних стадиях инфицирования и является высококонсервативным белком, присущим большинству известных изолятов вируса АЧС. Данные факты объясняют перспективность получения и изучения моноклональных антител, специфичных к указанному белку.
В доступной литературе имеется ограниченное количество работ посвященных использованию ДНК-иммунизации для получения МкАт [14].
Обычно при получении МкАт в качестве иммуногена используют очищенные и концентрированные вирусные антигены. Однако даже при высокой степени их очистки не удаётся избавиться от примеси балластных контаминирующих антигенов, часто имеющих высокую иммуногенность [4].
Использование рекомбинантных конструкций для иммунизации мышей с целью получения МкАт заданной специфичности позволяет исключить недостатки использования вирусных антигенов, так как устраняет наличие контаминирующих антигенов, тем самым достигается стандартизация и чистота иммуногена.
ДНК-иммунизация как метод доставки генетического материала имеет ряд преимуществ перед иммунизацией белками. Наиболее важным является запуск обоих ветвей иммунного ответа, что обеспечивает высокое качество В-лимфоцитов для слияния, а так же увеличивает долю антител, специфичных к конформационным эпитопам заданного белка.
S. Mazumder et al. (2011) при изучении индукции и длительности иммунного ответа у мышей линии BALB/c при различных комбинациях ДНК/белок показали преимущество иммунизации с праймированием ДНК-плазмидой и последующим введением белка в растворимой форме [9].
Использование рекомбинантных антигенов и моноклональных антител, полученных на их основе, также позволяет совершенствовать иммунодиагностику, причем, эти подходы фактически позволяют исключить использование высокопатогенных инфекционных агентов при производстве диагностических тест-систем.
1.2 Степень разработанности проблемы
Т.С. Whyard [11], A. Sanz [12] и рядом других зарубежных исследователей получены МкАт к вирусу АЧС.
Во ВНИИВВиМ Н.И. Митиным с соавт. получены гибридомы секретирующие МкАт к вирусу АЧС и разработаны диагностические иммуноферментные тест-системы на основе МкАт к мажорному вирионному белку р72 [3].
Т.Р. Кирюхиной отработан сэндвич вариант ТФ ИФА на основе МкАт к vp72 для тестирования антигена вируса АЧС в культуральных и органных материалах [2].
А.А. Пиря с соавт. получили 8 гибридных линий, продуцирующих МкАт к вирусным полипептидам, пять из которых специфичны к полипептиду с м.м. 31 кДа [4]. Однако их конформационные особенности не позволили использовать полученные МкАт в таких реакциях как иммуноцитохимия и иммунофлуоресценция.
Для получения моноклональных антител в данных исследованиях использовали классические подходы иммунизации хроматографически очищенными вирусными белками, без применения методов иммунизации рекомбинантными конструкциями и скринирования в реакции латекс-агглютинации.
1.3 Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлось совершенствование методологии получения МкАт заданной специфичности, изучение их иммунохимических свойств и возможности использования в различных серологических реакциях.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1) подобрать оптимальные условия изготовления препаратов антигена
белка vp30 вируса АЧС;
2) отработать оптимальную схему иммунизации мышей линии BALB/c
доноров спленоцитов, используя комбинированное введение
ДНК/рекомбинантный белок;
-
получить стабильные линии гибридом, продуцирующие МкАт заданной специфичности;
-
отработать методы скрининга позволяющие тестировать клоны гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к vp30 вируса АЧС;
5) изучить иммунохимические свойства полученных МкАт.
1.4 Научная новизна результатов исследования
Впервые в Российской Федерации разработана схема иммунизации мышей линии BALB/c с использованием комбинированного введения плазмидной ДНК и рекомбинантного белка.
Впервые в Российской Федерации получены линии гибридом, секретирующие специфические моноклональные антитела к рекомбинантному белку рЗО вируса АЧС, специфически взаимодействующие как с рекомбинантным вирусспецифическим белком рЗО, так и с натуральным.
Определены изотип, конформационная и эпитопная специфичность полученных моноклональных антител клонов 7F7, 2В7, 1С12, 5D11.
С помощью полученных МкАт установлено наличие на консервативном конформационном участке молекулы белка рЗО трех не
перекрывающихся антигенных сайтов. Один из них является конформационно зависимым.
С использованием полученных моноклональных антител показана динамика накопления фосфопротеина рЗО в чувствительной линии клеток CV-1, инфицированных вирусом АЧС штамм 691/88.
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы
Усовершенствованная технология получения и скрининга МкАт на основе плазмидной ДНК, несущей ген белка рЗО вируса АЧС и рекомбинантного белка рЗО использована для получения МкАт заданной специфичности.
Разработаны «Методические положения по получению моноспецифической сыворотки к рекомбинантному белку рЗО вируса африканской чумы свиней (АЧС)», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 10.11.2011г.
Разработаны «Методические положения по получению моноклональных антител к структурному белку рЗО вируса африканской чумы свиней с использованием метода «прайм-бустерной» иммунизации рекомбинантными конструкциями», которые рассмотрены на учёном совете и утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии Д.В. Колбасовым 12.03.2013 г.
Получены, охарактеризованы, паспортизированы и заложены на длительное хранение в музей гибридом ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии четыре клона гибридом - 7F7, 2В7, 1С12, 5D11, продуцирующие моноклональные антитела к белку рЗО вируса африканской чумы свиней взаимодействующие как с рекомбинантным белком рЗО, так и с вирусным антигеном.
Разработаны условия постановки ДАС ТФ ИФА, РНИФ, ИЦХ на основе МкАт к белку рЗО, предназначенные для обнаружения специфических антигенов вируса АЧС в инфицированном материале.
1.6 Степень достоверности и апробация работы
Степень достоверности результатов приведённых исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Научные положения и выводы диссертационной работы аргументировано отражают содержание работы.
Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании секции «Инфекционной патологии животных» отделения ветеринарной медицины РАСХН (27 апреля 2011 г), на 2й Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине» (Покров, 30 мая 2012г), Международной научно-практической конференции «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» ВНИИЗЖ (Владимир, 18 октября 2012г), на заседаниях Ученого Совета ВНИИВВиМ (2011-2013 гг.), совещаниях научных сотрудников лаборатории «Биотехнологии» ВНИИВВиМ (2011-2013 гг.).
1.7 Публикации
По результатам исследований, выполненных по теме диссертации, опубликовано 4 научные работы, в том числе 3 в журналах, входящих в перечень ВАК.
1.8 Структура диссертации
Диссертация изложена на 119 листах машинописного текста по общепринятой схеме и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (229 источников, в том числе 26 - отечественных авторов). Работа иллюстрирована 10 таблицами, 17 рисунками и дополнена приложениями.
1.9 Основные положения диссертации, выносимые на защиту
- использование комплекса методов сочетанной ДНК иммунизации и введения рекомбинантного белка позволяет получить более 70% гибридом заданной специфичности;
полученные моноклональные антитела к рекомбинантному белку рЗО взаимодействуют в различных серологических реакциях только с антигенными детерминантами vp30 вируса африканской чумы свиней и Rec рЗО;
полученные моноклональные антитела позволяют установить наличие на консервативном конформационном участке молекулы белка vp30 по крайней мере, трех не перекрывающихся антигенных сайтов;
полученные моноклональные антитела к рекомбинантному белку рЗО выявляют локализацию вирусспецифического антигена в инфицированных культурах клеток в иммуноцитохимической реакции.
1.10 Личный вклад автора в выполнение работы
Основной объём исследований проведён автором самостоятельно. Отдельные этапы исследований выполнены при консультативной помощи сотрудников лабораторий Биохимии, Биофизики, Диагностики и Биотехнологии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.
Исследования проведены в лабораториях Биотехнологии и Биохимии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.
