Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Компонентов нуклеиновых кислот 11
1. Структура и таутомерные формы оснований нуклеиновых кислот 12
2. Спектры поглощения мономерных компонентов нуклеиновых кислот,переходы . 20
3. Ионные формы, определение констант прото-литического равновесия в основном и первом возбужденном состояниях 21
4. Спектры люминесценции мономерных компонентов нуклеиновых кислот при низких температурах 28
5. Спектры возбуждения люминесценции мономерных компонентов нуклеиновых кислот. Сравнение со спектрами поглощения 40
6. Спектральные проявления стэкинг-взаимодействий между основаниями в динуклеотидах. 58
7. Люминесцентные свойства динуклеотидов принизких температурах 65
8. Спектральные проявления агрегации компонентов нуклеиновых кислот 72
Глава 2. Техника эксперимента 76
1. Описание экспериментальных установок 76
2. Приготовление образцов 91
Глава 3. Причины различия спектров поглощения и возбуждения шшесценции цитозина, цитидина и цитидинмоноїюсмта при 77 К 95
1. Люминесценция цитозина, цитидина и цитидинмонофосфата при 77 К. Влияние протежи рования 95
2. Люминесцирующие агрегаты цитидина и цитозина в водноэтиленгликолевых растворах при 77 К 110
3. Влияние образования водородной связи с растворителем на люминесцентные свойства цитозина и его производных 122
Глава 4. Спектральные проявления конформационнш гетерогенности динуклеотида в ЭГ:Н20(1:1, ) и цитидина в Н20 при 77 К 140
1. Изучение конформационной гетерогенности цитидинового динуклеотида при 77 К люминесцентным методом. Проявление сильного экси-тонного взаимодействия между основаниями 140
2. Спектральные проявления гетерогенности замороженных водных растворов цитидина при 77 К 170
Выводы 184
- Спектры поглощения мономерных компонентов нуклеиновых кислот,переходы
- Ионные формы, определение констант прото-литического равновесия в основном и первом возбужденном состояниях
- Люминесцирующие агрегаты цитидина и цитозина в водноэтиленгликолевых растворах при 77 К
- Спектральные проявления гетерогенности замороженных водных растворов цитидина при 77 К
Введение к работе
Молекулярная фотобиология клеток и микроорганизмов - это прежде всего фотохимия ДНК. Целый ряд биологических фактов говорит о том, что летальное и мутагенное действия ультрафиолетового облучения в основном обусловлены фотохимическими повреждениями в ДНК /I/. При изучении механизма фотохимических процессов большое значение имеет знание вероятностей различных электронных переходов в молекуле, поглощающей квант света, важно знать фотофизические свойства возбужденных состояний, пути миграции энергии после поглощения.
Одним из основных методов исследования возбужденных состояний является люминесцентный метод. Этот метод может также применяться и к изучению спектральных свойств молекул в основном состоянии, особенно в гетерогенных системах. Разная вероятность испускания у различных молекул дает возможность избирательно изучать в смеси те молекулы, которые имеют больший квантовый выход люминесценции.
Как известно, нуклеиновые кислоты (НК) - это сложные гете-рополимеры, содержащие пуриновые и пиримидиновые основания, связанные сахарофосфатной цепью. Т.к. сахара и фосфаты поглощают лишь в далекой ультрафиолевой области спектра, то первые Уф полосы поглощения НК обязаны поглощению азотистыми основаниями. Фотофизические свойства НК, кроме того, определяют и взаимодействия между близкорасположенными основаниями: стэкинг-взаимо-действия между основаниями, уложенными в стопку, и продольные (комплементационные) взаимодействия между основаниями, расположенными в одной плоскости, но в разных цепях и связанные водородными связями (Н-связями). .Эти взаимодействия весьма чув-
--ствительны как к природе оснований, так и к изменению их взаимного расположения. НК в растворе являются не однородной двойной спиралью, а образуют сложную пространственную структуру, поэтому взаимодействия между основаниями в разных участках спирали должны значительно отличаться, что может сказаться на спектральных свойствах НК. Именно поэтому исследование люминесценции НК может дать ценную информацию о конформационных изменениях в этих макромолекулах.
Взаимодействия между основаниями могут значительно измениться при возбуждении. В частности, могут возникнуть характерные для упорядоченных структур межмолекулярные взаимодействия, связанные с экситонным переносом энергии или образованием экси-меров. Эти явления очень важны для понимания механизма фотохимических процессов, происходящих в НК. Исследование люминесценции также помогает определить наличие и природу таких взаимодействий.
С практической точки зрения исследования фотофизических и фотохимических процессов, происходящих в НК, тесно связано с решением проблемы направленных фотомутаций, получением мутантов в микробиологии и растениеводстве.
Проблематика и цель работы. Исследование люминесценции НК естественно начинать с исследования свойств возбужденных состояний простейших компонентов НК: гетероциклических оснований и их разных ионных и таутомерных форм (т.к. локальное окружение оснований в НК и их взаимодействие могут привести к реализации в НК таких форм этих молекул, которые в водных растворах при физиологических значениях рН находятся в незначительном количестве) , а также простейших модельных систем, в которых проявляются взаимодействия между основаниями - ди- и полинуклеотидов.
Люминесцентные исследования этих объектов широко ведутся с середины 60-х годов (см.обзоры /2-4/). И хотя в этой области были сделаны значительные успехи, необходимо отметить, что существует целый ряд люминесцентных особенностей этих объектов, которым до сих пор не дано удовлетворительного объяснения. Например, наблюдается значительное различие экспериментального и вычисленного из спектра поглощения и квантового выхода флуоресценции времени жизни синглетного состояния для Арх, Qp и Тр /3,5/, падение степени поляризации с уменьшением длины волны возбуждения ( Ar) Для Тhvj и LmI , зависимость спектров люминесценции от Хр, Для L»мt и его производных /6,7/. Не решен вопрос о наличии и величине экситонного взаимодействия между основаниями в ди- и полинуклеотидах. Твердо установлен тот факт, что как для самой ДНК, так и для многих ее компонентов (в меньшей степени) наблюдается различие спектров возбуждения люминесценции и спектров поглощения, что может являться следствием отклонения от закона Вавилова /2,7 и ссылки там/. Совокупность этих и некоторых других фактов не дает ясного представления о природе люминесценции компонентов НК.
Центральным вопросом в понимании этого является исследование природы различия спектров поглощения и возбуждения люминесценции. Выяснение природы этого явления позволит определить, какие молекулы ответственны за люминесценцию ДНК. Только имея сведения о том, в какой форме (таутомерной, ионной, конформаци-онной) компоненты НК поглощают и излучают квант света, можно говорить о его дальнейших путях миграции и о свойствах возбуж-
х - Аббревиатура и структурные формулы оснований, нуклеозидов и нуклеотидов НК приведены на Рис. I.
денных состояний поглощающих центров.
Данная диссертация, в основном, посвящена исследованию причин, вызывающих различия спектров возбуждения люминесценции и поглощения в цитозиновых компонентах НК ( C\jt, СмсІ , Ср и СрСр), а также исследованию зависимости люминесцентных характеристик этих объектов при изменении концентрации, значений рН среды и при наличии взаимодействий между основаниями в дину-клеотиде СрСр и агрегатах С\УСд при 77 К.
Изложение материала построено следующим образом. В Главе I дается литературный обзор исследований люминесценции оснований НК нуклеозидов, нуклеотидов, динуклеотидов и агрегатов мономерных компонентов НК при низких температурах. Основное внимание уделяется исследованию люминесценции Lvjt и его биологических производных.
В первых трех параграфах обзора описаны структура оснований, их возможные таутомерные и ионные формы, природа первых полос поглощения мономерных компонентов НК и влияние на них температуры и состава растворителя. Отмечается сложность этих объектов для спектроскопического исследования.
В 4 и 5 дается анализ исследований люминесценции мономерных компонентов НК в стеклующихся растворителях. Рассмотре-. ны свойства возбужденных состояний, информация о которых получена из этих исследований. Показано, что существует некоторая противоречивость имеющихся экспериментальных данных. Главной особенностью люминесценции компонентов НК является различие их спектров возбуждения и поглощения (отклонение от закона Вавилова о независимости квантового выхода люминесценции от длины волны возбуждения). Проанализированы случаи отклонения от закона Вавилова, наблюдавшиеся в растворах сложных органических мо-
лекул. Рассмотрены гипотезы, которые были выдвинуты для объяснения этого явления у компонентов НК. Показано, что большинство из них не согласуется с экспериментальными данными, поэтому необходимы дальнейшие исследования этого явления.
Последние три параграфа литературного обзора посвящены исследованию спектральных проявлений стэкинг-взаимодействия между основаниями в динуклеотидах и агрегатах мономеров НК. Из приведенных экспериментальных данных следует, что вопрос об описании оптических свойств взаимодействующих оснований является дискуссионным. Для его решения крайне важны исследования спектров возбуждения и поглощения этих объектов при низких температурах .
Спектры поглощения мономерных компонентов нуклеиновых кислот,переходы
Первые электронно-возбужденные состояния гетероциклических молекул, подобных основаниям НК, молено классифицировать как 1Г)\ или ПІЇ состояния, соответствующие возбуждению А или П электрона на Л уровень /30,31/. Т.к. первые полосы поглощения оснований НК ( AtriCXX= 250-280 нм) имеют коэффициент молярной экстинкции -/2 Ю , то они соответствуют Л-А переходам, хотя вероятность того, что h-Л полосы могут иметь немного меньшую энергию и поэтому играть важную роль в испускании, не может быть исключена, т.к. слабые П-Л полосы в спектре поглощения очень трудно выделить из общей суммарной полосы. В этом заключается одна из главных проблем спектроскопии компонентов НК. Основания НК являются замещенными пуринов и пиримидинов. В пурине и пиримидине были обнаружены как ", так и П-Л полосы поглощения, причем П-Л полосы более длинноволновые по сравнению с Д-7Г полосами. Так в спектре поглощения пиримидина в углеводородных растворителях наблюдалась слабая полоса с Агг\ Хх нм к0Т0Рая ПРИ переходе к Іі О сдвигалась в коротковолновую сторону ( А/яах= ш / 2/. По этому признаку она была отнесена к П-Л переходу /30,32/. Более сильная полоса с максимумом 245 нм при замене растворителя практически не сдвигалась. Полоса с таким же максимумом наблюдалась для бензола -углеводородного аналога пиримидина, не имеющего П -электронов. По этим признакам полоса с А/77ау= -45 нм была отнесена к типу /30,32/. Для пурина также наблюдалась длинноволновая щоло-са (А/77ак= 300 нм) в углеводородных растворителях, которая исчезала при переходе к растворителям с высокой диэлектрической постоянной /33/. Первая полоса пурина имеет Аріоу = 260 нм в НоО и состоит из двух /Г-/Г переходов /23,33/.
Существенное влияние на относительные энергии Л-Л и fWv переходов оказывают заместители в пуриновом и пиримидиновом ге-тероциклах /33-38/. Для пиримидина особенно сильное влияние оказывают заместители во втором и четвертом положениях, дающие биологические производные. Мейсон показал /38/,что замещение протона электроннодонорной группой (например, амино- или гид-роксигруппой) во втором положении не изменяет энергию Н-А перехода, но значительно понижает энергию А-Д перехода, тогда как подобное замещение в четвертом положении производит менее сильный красный сдвиг А-Д. полосы, но сдвигает П-А полосу к более коротким длинам волн. Сильное влияние на положение полос пурина оказывают заместители во втором и шестом положениях, также дающие биологические производные /23,33,35,36/. Но а этом отношении данные разных авторов противоречивы. Так в работе /39/ из измерения зависимости спектров поглощения от растворителя для ДоЬ была обнаружена П-А полоса в области 290 нм, а в работе /36/ в неполярных растворителях в спектре поглощения Acfe и AdO не наблюдалось никакого длинноволнового хвоста, который соответствует П-А переходу, хотя точность эксперимента позволяла выявить полосы с 30. Изучение степени поляризации спектров поглощения АоіЄ- также показывает /40/, что первым возбужденным состоянием АоІВ в неполярных растворителях является А-Д состояние. Таким образом, переход от пуринов и пиримидинов к основаниям НК резко меняет относительное расположение Л-)\ и ПтГ уровней, так что в полярных растворителях нижним становится Д-Д состояние. Но близкое расположение П- состоянии и зависимость их энергии от растворителя может оказать сильное влияние на люминесцентные свойства оснований.
Переход от оснований к нуклеозидам и нуклеотидам оказывает незначительный эффект на спектры поглощения. Введение Д-рибозы в первое положение пиримидиновых оснований и в девятое положение пуриновых оснований приводит только к небольшому (1-3 нм) батохромному сдвигу двух первых 1\- л полос поглощения. Добав- ление фосфатных групп (переход к нуклеотиду) практически не влияет на спектры поглощения /10/. Замена растворителя дает заметные спектральные сдвиги спектров поглощения компонентов НК. Это обычно связывают не со взаимным смещением Д-Д и П-7Г полос поглощения, а со сдвигом таутомерного равновесия /13,15,27,29/ или с проявлением специфического взаимодействия с молекулами растворителя (Н-связь) /16,19,41/. В этом отношении интересными объектами являются uyt и его биологические производные, спектры поглощения которых имеют большие спектральные сдвиги при переходе от НрО к неводным растворителям и при изменении температуры в водных растворах /11-13,15,16,19/. Это явление первоначально интерпретировалось как смещение амин-иминного равновесия /II--13,15/. В работе /15/ из данных по изменению спектров поглощения водных растворов L\/1 с температурой было рассчитано, что доля иминных таутомеров Lvft в воде при 30С составляет 3%. Эта величина противоречит многим другим теоретическим и экспериментальным данным, в соответствии с которыми доля иминных таутомеров в воде при комнатной температуре должна быть /v2«I0 /22,27/. Дконсон, Випонд и Гирод подвергли критике эту гипотезу и показали /16/, что смещение спектра поглощения при замене растворителя обусловлено образованием водородной связи молекул Lvt и LyCi с молекулами гидроксильных растворителей и отсутствием такого взаимодействия в апротонных растворителях. Доказательство было основано на следующих экспериментальных фактах. Авторы работы /16/ показали, что в апротонных растворителях также как и в воде Lvt и L\[d находятся, в основном, в аминоформе.
Ионные формы, определение констант прото-литического равновесия в основном и первом возбужденном состояниях
Спектры поглощения компонентов НК зависят от значений рН раствора. При изменении рН возмолшы переходы от нейтральных форм, характерных для нейтральных рН среды, к протонированным и депро-тонированным формам, что сказывается на распределении электронной плотности в гетероциклических ядрах, а это, в свою очередь, вызывает изменения в спектрах поглощения. Наиболее полное исследование спектров поглощения различных ионных форм оснований НК, их нуклеотидов и нуклеозидов в водных растворах при комнатной температуре дано в обзоре /10/. В этом обзоре приведены также данные о кислотно-основных равновесиях мономерных компонентов НК и величинах рК, полученные в результате машинной обработки спек-трофотометрической информации. На кислотно-основные свойства компонентов НК сильно влияют внешние факторы, такие как температура, растворитель, ионная сила, т.д. /10,48/. Одним из важнейших факторов, оказывающих влияние на константу протолитического равновесия является температура. Зависимость рК от температуры описывается уравнением: гДе » d G IA AS- изменение стандартных свободной энергии,энтальпии и энтропии, соответственно /49/. Для влияния растворителя на рК нет единого и простого описания, но эффекты иногда могут быть весьма значительны /49,50/. Таким образом, замена водного раствора на смешанный и переход к низким температурам, т.е. переход к условиям, характерным для люминесцентных исследований компонентов НК /2,3/, может сильно изменить соотношение концентраций ионных форм компонентов при нейтральных рН (рН 7.0), измеренных при комнатной температуре. Эти эффекты до сих пор не учитывались в люминесцентных исследованиях и обычно считали, что молекулы компонентов НК находятся в этих условиях, также как и при комнатной температуре в НпО, только в нейтральной форме. Нам также не известны литературные данные по рК для низких температур и смешанных растворителей, полученные из спектрофотометрического титрования. Это, скорее всего, связано с трудностями измерения спектров поглощения при низких температурах. Значение рК при низких температурах можно определить из измерений интенсивности люминесценции на одной длине волны в зависимости от рН раствора /51,52/. Если протолитическое равновесие не устанавливается в возбужденном состоянии до испускания, то на кривых люминесцентного титрования будет проявляться только одна точка перегиба, соответствующая рК основного состояния.
Если протолитическое равновесие устанавливается, по крайней мере частично, в возбужденном состоянии до испускания, то в общем случае на кривых люминесцентного титрования будет два перегиба, отражающие переход между двумя формами молекул в основном и первом возбужденном состояниях. Так как возбужденные состояния молекул имеют отличное от основного распределение электронной плотности, то константы про-толитического равновесия в основном и первом возбужденных состояниях (рК и рК/) могут значительно отличаться друг от друга.Раз- ность между ними можно определить из величины смещения спектров поглощения или люминесценции при протонировании. Впервые этот вопрос исследовал Зорстер /53/.
Он рассмотрел схему энергетических уровней для систем, в которых существует равновесие как в основном, так и возбужденном состоянияхх (рис.21 Из рисунка 2 видно, что где Zj и iZ-n - энергии 0-0 переходов для кислой и основной форм, соответственно. д/-/ Дп- молярные энтальпии в основном и возбужденном состояниях. Это выражение верно при любом соотношении Дп ж А 7 . Если предположить, что энтропия реакции одинакова в основном и возбужденном состояниях и принять во внимание, что: то легко получить: х - шорстер рассматривал поглощение в рамках двухуровневой схемы, тогда как известно, что поглощение и люминесценцию в любой конденсированной системе нужно описывать четырехуровневой схемой (см., напр., /54/). Рассмотрение метода Форстера с использованием четырехуровневой схемы дано в работах /52,55/. Неучет релаксации среды в некоторых случаях может привести к погрешности в определении изменения энтальпии на 15-20% /56/.
Люминесцирующие агрегаты цитидина и цитозина в водноэтиленгликолевых растворах при 77 К
Чистую воду нельзя использовать в качестве растворителя при изучении свойств возбужденных состояний мономерных молекул при низких температурах из-за образования в ней при замораживаний агрегатов растворенных молекул (см. 8 Гл. I). Поэтому исследование люминесценции мономерных компонентов НК проводилось в стеклообразных некристаллизующихся растворителях, в которых наблюдается мономерная люминесценция оснований, нуклеозидов и нуклеотидов НК. Чаще всего исследователи в качестве такого растворителя использовали смесь ЭГ с НрО в разных пропорциях (1:1, 6:4, 7:3, V).
Хотя ранее Уонг предположил /163,164/, что молекулы органического растворителя вместе с растворенными молекулами компонентов НК выталкиваются из чисто водной матрицы и образуют агрегаты растворенных молекул в чистом органическом растворителе, многие авторы, исследовавшие люминесценцию мономерных компонентов НК, утверждали, что агрегаты полностью разрушаются при добавлении органического растворителя к воде и наблюдается люминесценция только мономерных молекул /143,148,157,160/. Но так ли это? Например, для ряда красителей добавление органических растворителей к воде, наоборот, создает при замораживании раствора благоприятные условия для образования люминесцирующих агрегатов /178, 179/.
Дробник и Аугенштейн /35/ из исследования спектров возбуждения и испускания люминесценции замороженных водноэтиленглико-левых растворов дезоксигуанозина показали, что в этих условиях, кроме мономеров, существуют также агрегаты дезоксигуанозина, которые образуются только при медленном охлаждении растворов до 140 К. Доля этих агрегатов очень мала, и они не проявляются в поглощении. Однако, эти агрегаты имеют большой (D/ и поэтому хорошо проявляются в люминесценции. Максимум спектров возбуждения и флуоресценции этих агрегатов гораздо более длинноволновый, чем у мономеров: X Q - 300 нм, л сцг 415 нм по сравнению с
Наши исследования люминесценции Lyt , Сус/ и Ср в ЗГгіу) (1:1, V) при 77 К,описанные ниже, также показывают, что в данном растворителе при нейтральных значениях рН присутствует, кроме мономеров, малая доля люминесцирующих агрегатов этих молекул, имеющих более длинноволновые спектры поглощения и испускания и больший (Dd » чем у мономеров. Наличие таких агрегатов является одной из причин различия спектров поглощения и спектров возбуждения люминесценции для нейтральных водноЭГ растворов Lyt, Іуд и Ср при 77 К. Мы исследовали спектры поглощения, испускания и возбуждения люминесценции водноэтиленгликолевых растворов (ЭГ:Нг 0, 1:1, у ) Lycf и Lyt при 77 К рН 7.0 и Ср при рН 9.0 и разных концентрациях растворенных молекул. На Рис. 26 представлены спектры люминесценции Сус/ для трех концентраций: 4-Ю"5 М, 4«10 4 М, 4-Ю"3 М и разных Л& . Из этого рисунка видно, что для каждой концентрации спектры люминесценции зависят от Хв Спектр люминесценции при возбуждении в районе максимума первой полосы поглощения ( Д » - 265 нм) одинаков для всех трех концентраций, тогда как максимум спектров люминесценции при возбуждении на длинноволновом краю первой полосы поглощения ( / » - 293 нм) значительно смещается в коротковолновую сторону с ростом концентрации. Спектры возбуждения флуоресценции lyo/ , зарегистрированные при одной Арег- 340 нм, не совпадают со спектрами поглощения и также зависят от концентрации (Рис. 27).
Спектральные проявления гетерогенности замороженных водных растворов цитидина при 77 К
Разными методами было показано, что основания в водных растворах образуют агрегаты типа стопки /4,48,153,156/. Такие агрегаты, также как и динуклеотиды могут являться моделью для изучения стэкинг-взаимодействия между основаниями. Исследование формирования агрегатов важно для выяснения природы сил, стабилизирующих комплементарные пары оснований, т.к. образование таких пар и формирование гомоассоциатов являются в водных растворах оснований НК конкурирующими процессами. Сравнение стэкинг-взаимодействия в этих ассоциатах и в динуклеотидах может помочь выяснению влияния фосфодиэфирной связи на величину стэкинг-взаимодействия. Исследование люминесцентных характеристик таких комплексов затруднено из-за очень низких (Dig оснований НК в воде при комнатной температуре. Увеличение Фг можно достичь понижением температуры растворов, но ниже 0С вода превращается в лед. При образовании кристаллов льда растворенные в воде основания НК также образуют микрокристаллические структуры (см. 3, Гл. I). Однако, их структура неизвестна. В этих структурах могут проявляться как стэкинг-взаимодействия, так и взаимодействия между основаниями с образованием Н-связи. Выяснению природы сил взаимодействия между основаниями НК в таких агрегатах посвящен этот параграф. Спектр поглощения нейтрального (рН 7.0х) водного раствора - Из кривой люминесцентного титрования іш в НгэО при 77 К,предпри 77 К и концентрации 4.5 Ю"3 М значительно смещен в длин- новолновую сторону (по максимуму на 7 нм) относительно спектра поглощения ь\\(л при 93 К (Рис. 46). Эти изменения подобны наблюдавшимся ранее изменениям спектра поглощения Thy в 1 0 при понижении температуры от комнатной до 77 К, которые были интерпретированы как проявление наличия агрегатов TnV во льду /165/. Уонг предположил, что образование таких агрегатов происходит за счет эффекта высаливания молекул компонентов НК из чистой кристаллизующейся воды и что добавление органических растворителей разрушает такие агрегаты /163,164/.
Действительно, при добавлении незначительного количества дТ (0.15 м.д.) к чистой воде до замораживания спектр поглощения Ьш сдвигается в коротковолновую сторону и становится близким к спектру поглощения Ш в Н20 при 293 К (Рис. 46, кривые 2,3). К сожалению, из-за сильного рассеяния света не удалось измерить спектры поглощения Lvc/ в HgO при 77 К в более низких концентрациях, чтобы оценить, как меняется вклад агрегатов в общий спектр поглощения. Однако, изменение вклада агрегатов проявляется в концентрационных измерениях люминесценции Lvof в Н?0 при 77 К. Спектры возбуждения флуоресценции при трех концентрациях приведены на Рис. 47а. Как видно из рисунка, спектры возбуждения ставленной в работе /155/ следует, что рК Lye/ в Н О не смещается при понижении температуры от комнатной до 77 К, и область рН при 77 К, где люминесцирует только нейтральная форма молекул Шц , такая же, как и при комнатной температуре (рН 6.5). зависят от концентрации. При уменьшении концентрации они смещаются в коротковолновую сторону и приближаются к спектру поглощения мономерных молекул L JGi в НпО при 293 К. Такое смещение говорит об уменьшении вклада агрегатов в спектр возбуждения при понижении концентрации. Спектры люминесценции для двух концентраций приведены на Рис. 48,49. Из этих рисунков видно, что спектры люминесценции при обеих концентрациях зависят от Ag , что говорит о гетерогенности этих растворов.
Спектры флуоресценции значительно отличаются от спектров флуоресценции нейтральных водноетиленгли-колевых растворов l\id (см. Рис. 26). Эти спектры имеют гораздо большую полуширину и их максимумы смещены в длинноволновую сторону. Такие изменения обычно интерпретируются как проявление эк-симерной флуоресценции (см. 7, Гл. I). При понижении концентрации спектры флуоресценции смещаются в длинноволновую сторону и увеличивается полуширина этих спектров. Учитывая это, а также тот факт, что спектры возбуждения при понижении концентрации приближаются к спектрам поглощения мономерных молекул LyCf » можно сделать вывод, что понижение концентрации приводит к увеличению вклада эксимерной флуоресценции. Применение метода Аленцева-$ока(/188,189/, см. также 3, Гл. 3) к спектрам испускания и возбуждения флуоресценции служит подтверждением этого вывода.
