Содержание к диссертации
Введение
Глава I. СДВИГИ ЯМР И ИХ ФИЗИЧЕСКАЯ ПРИРОДА 12
1.1. Понятие сдвига ЯМР. Константа экранирования 12
1.2. Химический сдвиг 14
1.3. Межспиновое взаимодействие и сдвиг 17
1.4. Диполярный сдвиг 19
1.5. Контактный сдвиг 21
1.6. Контактные и псевдоконтактные сдвиги в структурных исследованиях. Шифт-зонды 1.7. Сдвиги при образовании водородной связи 24
1.8. Сдвиги ЯМР и химический обмен 27
Глава II. ПРЯМЫЕ И КОСВЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР И ПРОБЛЕМА ТОЧНОСТИ ИЗМЕРЕНИЯ СДВИГОВ 32
2.1. Диапазоны сдвигов и ширина линий при прямом изучении малых молекул 32
2.2. Внедрение ЯМР в молекулярную биологию. Принципиальные ограничения метода ЯМР при непосредственном изучении спектров макромолекул 38
2.3. Двумерная фурье-спектроскопия ЯМР 41
2.4. Непрямые исследования с помощью молекул-зондов 44
2.5. Измерение статической магнитной восприимчивости веществ в растворе. Метод Эванса 48
2.6. Метод детектирующих зондов ЯМР. Уравнения Соломона-Бломбергена 52
2.7. Неспецифические и специфические молекулярные зонды.
- з -
Краткий обзор 55
2.8. Оценка сдвигов ЖР при работе по методу молекул-сви
детелей и молекул-зондов. Проблема точности измере
ний 62
Глава III. ВОЗМОЖНОСТЬ ПРЕЦИЗИОННОГО ИЗМЕРЕНИЯ СДВИГОВ ... 66
3.1. Разрешающая способность и стабильность резонансных условий 66
3.2. Существуют ли разработанные методы прецизионных измерений сдвигов ЖР? Многочастотный резонанс в спин-связанных системах и метод биений в спиновых генераторах 69
3.3. Неприменимость приемов обзорной спектроскопии для точного измерения сдвигов 71
3.4. Влияние формы линии на измерение сдвига 73
3.5. Влияние фазового угла детектирования на измерение сдвига 80
3.6. Влияние частичного перекрывания линий на измерение сдвигов * 84
3.7. Влияние температуры образца. Требуемая термостабильность и возможности газовых термостатов 88
Глава IV. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ УСТАНОВКА И МЕТОДИКА ПРЕЦИ
ЗИОННОГО ИЗМЕРЕНИИ СДВИГОВ 94
4.1. Свип-спектрометр с модуляцией поля на звуковой частоте в качестве базы экспериментальной установки .. 94
4.2. Следящая система на основе развертывающего модуляционного генератора 97
4.3. Термостабилизация образца по сигналу ЇМР лабильных притонов 100
- 4 -
4.4. Стабильность формы линии в случае коаксиального образца. Устройство для автоматического квадратурного шиммирования поля 104
4.5. Функциональная схема установки для прецизионного измерения сдвигов ЯМР 108
4.6. Измерения с "внутренним термометром" 112
4.7. Измерение ширины линии с помощью калиброванного вращения фазы 115
Глава V. МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ И МОДЕЛЬНЫЕ ОПЫТЫ 118
5.1. Часовая стабильность отсчета резонансной частоты (коаксиальный образец) 118
5.2. Влияние сборки и разборки коаксиального образца на измерение сдвигов 119
5.3. Калибровка по раствору парамагнитной соли 121
5.4. Кинетика восстановления растворенного кислорода системой дыхательных коферментов 122
5.5. Температурная зависимость относительных химсдвигов и константы спин-спинового взаимодействия в молекуле этанола 126
5.6. Контактные сдвиги протонов воды в присутствии спиновой метки 128
Глава VI. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРЕЦИЗИОННОГО ИЗМЕРЕНИЯ СДВИГОВ
В БИОФИЗИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ 131
6.1. Тиолат-анионные комплексы железа и марганца 131
6.2. "Пурпурный комплекс" оксидазы д-аминокислот и его диамагнетизм 141
6.3. Связывание ионов марганца молекулой тРНК 142
6.4. Изучение конформационных состояний предшественников
- 5 -
спиновых меток 147
6.5. Изучение физико-химических свойств и топографии ак
тивного центра растительной пероксидазы 157
ВЫВОДЫ 177
СПИСОК ЛИТЕРАТТРЫ 180
- Понятие сдвига ЯМР. Константа экранирования
- Диапазоны сдвигов и ширина линий при прямом изучении малых молекул
- Разрешающая способность и стабильность резонансных условий
- Свип-спектрометр с модуляцией поля на звуковой частоте в качестве базы экспериментальной установки ..
- Часовая стабильность отсчета резонансной частоты (коаксиальный образец)
Понятие сдвига ЯМР. Константа экранирования
Спектр ядерного магнитного резонанса высокого разрешения вещества, содержащего магнитные ядра (//,/, Г и т.д.) представляет собой набор групп линий, разнесенных по частотной развертке спектра. Взаимное расположение линий спектра, расстояние между линиями и группами линий являются характерными для конкретного соединения. Стремление однозначно охарактеризовать спектры ЯМР привело к развитию понятия сдвига линий ЯМР /I/.
Под сдвигом в спектроскопии ЯМР понимают положение резонансной линии или группы линий относительно изолированной линии, выбранной за эталон. В протонном магнитном резонансе (ПМР) основным эталоном служит сигнал протонов тетраметилсилана, представляющий собой узкую линию, расположенную в области более низких резонансных частот (более сильного магнитного поля)/1,2/.
С целью стандартизации спектров ЯМР введены относительные единицы измерения сдвигов, так называемые миллионные доли (м.д.):
где f - резонансная частота исследуемого сигнала, j-BT - резонансная частота эталонного сигнала, f f;- усредненная по всевозможным химсдвигам частота, избранная в качестве рабочей. В шкале сдвигов IMP по Тирсу сигналу тетраметилсилана присваивают значение +10 м.д. /2/.
Для изолированного магнитного ядра справедливо условие резонансного перехода
где б і - гиромагнитное отношение для данного ядра, Не - поляризующее магнитное поле (напряженность). Реально в методе ЯМР имеют дело с ядрами в составе молекул, находящихся, как правило, в конденсированном состоянии, в составе образца с конкретной геометрией. Б этом случае на ядро действует поле Пэ рф,, отличное от Не . Отличия обусловлены диамагнитной экранировкой, осуществляемой ближайшими к ядру (по отношению ко всей молекуле) электронами, в том числе участвующими в образовании химической связи с соседними атомами; электронными токами в ароматических структурах, входящих в состав данной молекулы или других молекул, взаимодействующих с данной. Отлшшя могут быть также связаны с присутствием в образце парамагнитных центров (ПМЦ) и, наконец, с объемным диамагнитным экранированием, осуществляемым веществом образца в целом /3/. Внешнее и действующее поля связывают соотношением
Диапазоны сдвигов и ширина линий при прямом изучении малых молекул
При непосредственном изучении обзорных спектров ЯМР первая и основная задача - сопоставление групп линий ЯМР с конкретными химическими группами и отдельными атомами исследуемой молекулы (процедура "отнесения" сигналов). Основную роль в этой процедуре играет определение химсдвигов линий спектра и сравнение их с известными значениями химсдвигов тех или иных химических групп. Примером отнесения линий ЯМР по известным химсдвигам может служить спектр предшественника спиновой метки 2,2,6,6-тетрамвтил-4-V- (-1,2-диаминоэтан- /V,// -диацетил) пиперидина, изображенный на рис.3. Отнесение линий в этом случае облегчается благодаря большим относительным химсдвигам групп и очень слабому спин-спиновому взаимодействию.
В период расцвета обзорной спектроскопии (50-е - 60-е годы) накоплена огромная информация о химсдвигах, представленная ныне в виде атласов спектров и таблиц химсдвигов /2/. Вся эта информация получена при изучении малых молекул, с м.в. 500 Дальтон. Возможности метода ЯМР проявились здесь в полной мере. ЯМР высокого разрешения в принципе позволяет получить исчерпывающие сведения о структуре малой молекулы в растворе, начиная со структурной формулы, кончая тонкими деталями конформации.
Точность определения сдвига в случае малых молекул представляет собой особый интерес, поскольку позволяет оценить предельную точность таких измерений вообще. Абсолютная точность определения сдвига изолированной линии не может быть хуже, чем ширина этой линии (если пренебречь влиянием на сдвиг внешних факторов: температуры, состава растворов и т.д.). За показатель относительной точности определения сдвига в обзорной спектроскопии можно принять отношение средней шириш изолированной линии IMP к диапазону регистрируемых сдвигов.
Хотя IMP является самым доступным и распространенным видом ЯМР, предлагаемый показатель для него отнюдь не самый лучший по сравнению с ШР на других ядрах с J = 1/2. С ростом веса магнитных ядер сильно возрастает диапазон химсдвигов, что можно видеть на примере ШР С, 9Г, Р, а ширина линий, если и растет, то далеко не в том же отношении. Можно считать, что общая оценка относительной точности определения химсдвигов малых молекул по данным ШР не окажется завышенной по отношению к резонансу на других ядрах с J = 1/2.
Средняя точность определения химсдвигов IMP по Тирсу /2/ -0,01 миллионной доли, диапазон химсдвигов ШР - 20 м.д., без учета аномальных сдвигов под действием СТВ /1,2,5,12/. Следовательно, точность определения сдвигов в обзорной спектроскопии малых молекул - не хуже 10 . Этой точности болев чем достаточ - 35 но для безошибочного отнесения линий.
Данные, послужившие для оценки, получены на спектрометрах с рабочими полями Н0 - 20 КЭ, с рабочими частотами j ш 100 МГц /І/. В настоящее время очевидна тенденция к максимальному увеличению налряженности рабочих полей, вплоть до 80 - 100 КЭ. Кроме общего повышения чувствительности метода ЯМР, связанного с увеличением разности заселенностей ядерных магнитных уровней /1,5/, это позволяет лучше разрешать спектры, устраняя вторичные расщепления линий, наблюдающиеся при сравнимости констант спин-спинового взаимодействия и относительных сдвигов линий /I/. Эффект увеличения рабочего поля иллюстрируется рис.4.
Разрешающая способность и стабильность резонансных условий
Современные спектрометры ЯМР снабжены системой стабилизации резонансных условий, которая с высокой точностью поддерживает отношение поле/частота для сигнала ШР эталонного вещества. Система стабилизации работает следующим образом. Сигнал ЯМР эталонного вещества выделяется в виде линии дисперсии и подается на вход следящего устройства, регулирующего силу тока в специальных подмагничивающих катушках магнита. При соблюдении резонансных условий, соответствующих центру линии дисперсии ШР, сигнал на входе следящего устройства равен нулю (рис.10, а). Отклонение от резонансных условий соответствует смещению линии дисперсии по частоте. При этом на вход следящего устройства поступает напряжение той или иной полярности, в соответствии с направлением отклонения от резонансных условий. Следящее устройство изменяет ток подмагничивающих катушек до уровня, обеспечивающего соблюдение резонансных условий.
Ясно, что точность стабилизации резонансных условий в значительной степени определяет точность измерения сдвигов ШР относительно эталонного сигнала.
Стабильность резонансных условий характеризуется параметром "гарантированная часовая стабильность", измеряемом в единицах частоты. В паспортных данных современных спектрометров этот параметр, как правило, совпадает по величине с гарантированной разрешающей способностью. Поскольку стабильность можно определить, лишь измеряя стандартные сдвиги, возникает вопрос: является ли эта паспортная величина корректной или она загрубляется из-за неумения (и кажущегося отсутствия необходимости) измерять сдвиг с точностью, превышающей разрешающую способность? Мы провели соответствующий эксперимент. После суточного прогрева серийного спектрометра ЯМР модуляционного типа BS-WC о faf. = = 80 МГц, паспортной разрешающей способностью f = З Ю"9 (0,24 Гц) и стабильностью 0,2 Гц/час в датчик прибора была помещена ампула с образцом, содержавшими 1% метанола и 1% третично-бути-лового спирта в тяжелой воде. В первой фазе опыта сигнал метиль-ных протонов третично-бутилового спирта использовался как эталонный в системе стабилизации резонансных условий. Линия метиль-ных протонов метанола была записана на растянутой развертке (0,04 Гц/см) планшета в условиях медленного прохождения и в отсутствие насыщения. Была определена ширина этой линии: 0,20 Гц. Во второй фазе опыта спектрометр работал с разомкнутой петлей обратной связи с системе стабилизации. С помощью медленной девиации поля (0,01 Гц/сек в единицах частоты) через детектор системы стабилизации (блок 5 на рис.10, а) регистрировалось прохождение линии дисперсии ПМР метанола. Был определен размах сигнала дисперсии на входе следящего устройства 6 системы стабилизации: Ли = 0,89 вольт. В третьей фазе опыта была вновь включена система стабилизации резонансных условий, в которой на этот раз использовался сигнал дисперсии ПМР метанола. В течение часа каждые 2 минуты измерялся уровень сигнала на входе следящего устройства системы стабилизации. Результаты представлены на рис. 10, б) Как видим, в течение часа уровень сигнала колебался в пределах 1,5 2,2 милливольт. Следовательно, если за время опыта форма линии и фазовая настройка детектора, сохранялись неизменными, система стабилизации обеспечивала дрейф резонансного сигнала, не превышающий if -/ /AU\ І 8 ІСГ5 Гц, что примерно в 2 3 10 лучше паспортной разрешающей способности и часовой стабильности спектрометра! Результаты опыта позволяют сделать вывод, что потенциально в методе ЯМР высокого разрешения можно измерять относительные сдвиги узких синглетных сигналов с точностью, на два-три порядка превышающей разрешающую способность спектрометров.
class4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ УСТАНОВКА И МЕТОДИКА ПРЕЦИ
ЗИОННОГО ИЗМЕРЕНИИ СДВИГОВ class4
Свип-спектрометр с модуляцией поля на звуковой частоте в качестве базы экспериментальной установки
В гл.Ш были рассмотрены некоторые детали устройства и работы т.н. свип-спектрометра ЯМР. Было продемонстрировано высокое качество системы стабилизации резонансных условий по сигналу дисперсии ЯМР эталона и обоснован предполагаемый способ прецизионного измерения сдвигов, имеющий аналогию с работой этой системы.
В настоящее время свип-спектрометры повсеместно заменяются импульсными спектрометрами с фурье-преобразованием сигнала свободной прецессии /67/. Одним из важнейших преимуществ этих приборов является одновременное получение всех линий спектра. К сожалению, в случае прецизионного измерения сдвигов это достоинство превращается в недостаток. Прецизионные измерения сдвигов с помощью отслеживания резонансной частоты сигнала дисперсии подразумевает своего рода регистрацию весьма малой (в идеале - бесконечно малой) части резонансной линии. При этом сигналы остальной части спектра, вообще говоря, отсутствуют (если не используется многочастотный резонанс). В случае импульсной спектроскопии информация о данной резонансной линии содержится во всей интерферограмме спектра, и выделение из нее индивидуальной резонансной частоты представляется затруднительным. То, что метод импульсной спектроскопии ЯМР не позволяет измерить сдвиги с точностью,существенно превосходящей разрешающую способность, видно из работ Неронова и Барзаха /35,36/. Отметим, что в этом случае исследователи имели дело лишь с синглетными сиг - 95 -налами, а не со сложным спектром. Тем не менее точность измерения составила
В свип-спектрометрах ЯМР используется модуляция магнитного поля на звуковых частотах. В согласии с теорией, развитой Гутовски /НО/, ЯМР в таких спектрометрах наблюдается при значениях основного поля Но = yifo- » VI ОД »2 ... , У-частота модуляции. Обычно Jf порядка нескольких килогерц. Амплитуды резонансных сигналов, соответствующих указанным значениям поля, относятся как вторые степени функций Бесселя поряд )ґ Liка 0,1,2 ... с аргументом К = JJ v, Нм- амплитуда модулирующего поля. С помощью последовательного гетеродинирования в при-емно-усилительном тракте спектрометра выделяется первый боковой сигнал на частоте модуляции У. В блоке УВД с помощью синхронного детектирования на частоте модуляции У в качестве опорной выделяют огибающую спектра. Фаза сигнала, соответствующая поглощению или дисперсии (см. (3.1)) устанавливается фазовращателями в блоках УВЧ и УВД. Функциональная схема модуляционного спектрометра изображена на рис.18. Модуляция магнитного поля осуществляется одновременно двумя модуляционными генераторами 15 и 16.
Часовая стабильность отсчета резонансной частоты (коаксиальный образец)
В этом опыте проверялась пригодность методики прецизионных измерений сдвигов ЯМР для длительных измерений магнитной восприимчивости растворов. Одновременно проводилась оценка общей надежности измерения сдвигов.
Внутренняя капиллярная ампула коаксиального образца содержала 30$ диметилсульфоксида (эталонное вещество), 70$ тяжелой воды. Внешний объем коаксиальной ампулы был заполнен раствором, содержавшим 1% третично-бутилового спирта (вещество-свидетель), 97% тяжелой воды, 2% обычной воды (в качестве источника лабильных протонов). С целью химического поглощения кислорода в раст-вор добавили следующие реактивы: 10 М цистеина (мягкий воссстановитель), ЮМ сернокислой меди (катализатор восстановления кислорода).
В данном образце вещество-свидетель имело более высоко-польный сдвиг, чем эталонное. Соответственно система стабилизации резонаснных условий и система коррекции однородности поля работали от модуляционного генератора с изменяемой частотой (16 на рис.24), в то время как следящая система - от кварцован-ного генератора.
Измерения резонансной (модуляционной) частоты вещества-свидетеля проводились каждые 30-40 сек. в течение часа. Все - 119 измеренных значений не вышли из интервала шириной 0,01 Гц. Среднеквадратичное отклонение 0,0024 Гц. Гистограмма отклонений от среднего колоколообразна и относительно симметрична (рис.26, а,б). Хотя частичную корреляцию измеренных значений исключить нельзя, часовую стабильность можно считать не хуже ± 0,005 Гц.
Похожие диссертации на Применение метода прецизионного измерения сдвигов ЯМР для изучения координационных соединений и ферментов
