Содержание к диссертации
Введение
Глава I Аутофлуоресценция, клеточное дыхание и современные возможности его неинвазивного исследования для оценки фунуционального состояния организма здоровых и больных людей (обзор литературы) 12
1.1. Возможности использования аутофлуоресценции тканей и клеток в медицине при патологии дыхательной системы 13
1.2. Значение изменений красного ростка крови в обеспечении функций внешнего и клеточного дыхания при заболеваниях дыхательной системы 21
1.3. Нарушения внешнего и клеточного дыхания при неспецифических заболеваниях дыхательной системы и способы и определения 27
1.4. Технологии оценки аутофлуоресценции и возможности спектрофотометрии в регистрации клеточного дыхания живых биообъектов
1.5. Значение эритроцитов в процессах биологического окисления 40
Глава II. Материалы и методы исследования 51
2.1. Характеристика экспериментальных и исследовательских наблюдений 51
2.2. Клинико-лабораторные наблюдения 55
2.3. Приборная база и методы исследования клеточного дыхания, ход измерений и обработки результатов 59
2.4. Методы статистической обработки 67
Глава III. Экспериментальные исследования по оценке чувствительности и воспроиз водимости спектров аутофлуоресценции живых биообъектов в зависимости от функционального состояния организма (собственные исследования) 68
3.1. Стандартизация работы УФ-биоспектрофотометра 68
3.2. Исследование спектров АФ различных биообъектов 71
3.3 Исследование чувствительности и воспроизводимости спектров аутофлуоресценции кожи человека при проведении
различных функциональных (нагрузочных) проб 73
Глава IV. Сопоставление изменений показате лей внешнего и клеточного дыхания у боль ных с бронхиальной обструкцией и у практи чески здоровых людей
Заключение 104
Выводы 111
Практические рекомендации 112
Список использованной литературы 113
Приложения 130
- Возможности использования аутофлуоресценции тканей и клеток в медицине при патологии дыхательной системы
- Нарушения внешнего и клеточного дыхания при неспецифических заболеваниях дыхательной системы и способы и определения
- Приборная база и методы исследования клеточного дыхания, ход измерений и обработки результатов
- Стандартизация работы УФ-биоспектрофотометра
Введение к работе
Актуальность исследования. Возросшие масштабы загрязнения окружающей среды различными отходами современных производств, техногенными электромагнитными излучениями и другими искусственно созданными человеком факторами среды способствуют возникновению существенных нарушений функций различных систем организма и состояния здоровья людей. Одной из ведущих причин смертности в промышленно развитых странах становится патология органов дыхания. Так, например, за последнее десятилетие смертность от хронических обструктивних заболеваний легких выросла на 28 % [2, 107]. Болезни, входящие в группу ХОБЛ с годами прогрессируют [87, 113]. При этом накапливаются изменения в иммунной системе, функциональном статусе эритроцитов, возникают признаки аутоинтоксикаций, дизэргозов, нарушений функций газообмена и биологического окисления (или клеточного дыхания) и гемореологические нарушения [37, 77, 122]. До сих пор, диагностика и наблюдение (мониторирование) за больными in situ и за изменениями дыхательных функций представляет во многом сложную проблему [91, 92]. Ряд исследователей отмечает тесную связь между изменениями общесоматических функциональных показателей с симптоматикой ХОБЛ и выраженностью морфологических изменений в различных органах и системах, включая систему крови [87, 88]. Последняя оказалась высоко чувствительной к воздействию различных стресс-факторов [126,136].
Установлено, что характер изменения функции дыхания при хронических заболеваниях зависит от реактивности организма конкретного человека. Важными компонентами такой реактивности являются ферментные системы, обеспечивающие клеточное дыхание, то есть процессы биологического окисления, сопряженные с обменом
7 энергии в покровных и внутренних тканях, а также клетках крови и, особенно, в ее самой многочисленной клеточной компоненте — эритроне [23, 26].
В последние годы определены зависимости основных функций эритроцитов и их движения по сосудам от электродинамических, механических и морфологических характеристик клеток. Установлено, что конфигурация эритроцитов в значительной степени влияет на кинетику крови в целом и имеет существенные связи с уровнем обмена веществ и энергии в тканях [43, 45].
Изменение формы эритроцитов во многом определяет их структурно-функциональную полноценность, определяет реакцию эритроцитов в потоке крови при воздействии на организм внешних электромагнитных полей, других физических факторов и при развитии патологии [31, 35,130, 153]. Показано, что между участками макро- и микрососудистого русла (мест основного функционирования эритроцитов) в здоровом организме имеют место гармоничные причинно-следственные отношения, которым LW. Forrester дал название "петли обратных связей". В них, как в замкнутых цепочках взаимодействия, могут развиваться явления не только находящиеся в связи с предшествующими событиями, но (по его мнению) и не находящиеся в такой связи. Указанные связи могут оказаться мишенями патологических процессов или мишенями внешних воздействий, способных влиять на дыхательную и другие системы и вызывать разнонаправленные реакции эритрона, а также изменения функций внешнего дыхания и газообмена в тканях [47, 63]. Так, увеличение концентрации гемоглобина и количества эритроцитов в крови можно наблюдать в период адаптации человека к относительной гипоксии при нахождении в условиях Арктики, Антарктики или высокогорья, а также при длительном течении ХОБЛ
8 [17, 18, 30]. Выраженное изменение числа циркулирующих по сосудистой системе эритроцитов, хотя и вызывает включение компенсаторных реакций (транзиторное усиление пролиферации эритроцитов и гиперплазию красного костного мозга и др.), но нередко, сопровождается нарушениями капиллярного кровотока (спазмами и парезами артериол, полнокровием венул, расширением капилляров со сладжированием и стазированием кровотока в них). Подобные изменения микроциркуляции изменяют электрический заряд эритроцитов, активность характерных для них гликолитических процессов и ведут к изменениям их формы [3, 23]. В итоге, все это закономерно приводит к нарушению газообмена и клеточного дыхания различных тканей. Однако до сих пор конкретные характеристики нарушения этих процессов у больных исследованы недостаточно.
Ряд работ Б. Чанса и его последователей [94, 97, 108, 123]
обусловил возможность использования биоспектрофотометрии для
оценки функциональных изменений состояния клеточного дыхания
живых клеток и систем различного уровня организации с
использованием их ультрафиолетового зондирования с последующим
измерением их нативной флуоресценции (или аутофлуоресценции).
Однако в настоящее время лишь в небольшом числе исследований
даются конкретные рекомендации по использованию
аутофлуоресценции для оценки изменения клеточного дыхания. Такие
рекомендации практически отсутствуют для больных с
бронхолегочной патологией, хотя фундаментальными исследованиями установлено, что нарушения процессов внешнего дыхания и газообмена и у таких больных закономерно приводят к изменениям обмена веществ на тканевом и клеточном уровне [47, 79].
В работах, в которых исследовались изменения функции внешнего дыхания (ФВД) при ХОБЛ показано, что уменьшение ОФВь
9
нарушение вентиляционно-перфузионных отношений, транс
сосудистого обмена, дисбаланс кровотока между суженными и
расширенными легочными сосудами, нарушения гистоструктуры
воздухоносных путей, возникновение деформаций аэрогематического
барьера существенно осложняют^ насыщение крови кислородом, а
также тканевой обмен, включая процессы внутриклеточного
биологического окисления. [108, 121]. Вместе с тем, вне поля зрения
исследователей, как правило, оказываются возможности
использования для оценки изменений клеточного дыхания, анализа спектров флуоресценции живых клеток и тканей больного организма.
Это обусловливает необходимость изучения взаимосвязи между
характером хронических заболеваний дыхательной системы и
спектрофотометрическими показателями аутофлуоресценции,
сопряженными с клеточным дыханием для целей неинвазивного мониторинга за состоянием организма больных.
Цель исследования: оценить диагностическую значимость ряда характеристик спектра аутофлуоресценции клеток покровных тканей и крови практически здоровых, а также больных хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ).
Задачи исследования:
На основе экспериментально-клинических наблюдений оценить чувствительность и информативность спектрофотометрического метода исследования аутофлуоресценции, а также возможность его использования для мониторинга изменения состояния здоровья больных с хроническими обструктивними заболеваниями легких.
Исследовать взаимосвязь изменений спектров аутофлуоресценции клеток кожных покровов и эритроцитов
10 периферической крови при использовании функциональных нагрузочных проб, применяемых в клинике.
3. Выявить особенности аутофлуоресценции клеток покровных тканей и эритроцитов у больных с бронхолегочной патологией и определить диагностически значимые спектрофотометрические маркеры нарушения клеточного дыхания.
Научная новизна: вервые уточнены спектрофотометрические параметры КД, наиболее чувствительные к нарушениям ФВД у больных ХОБЛ,
На основе статистического анализа результатов установлена взаимосвязь изменений спектра АФ кожных покровов у больных ХОБЛ с показателями внешнего дыхания. !>ги связи могут быть использованы при диагностике и контроле за лечением больных с бронхиальной обструкцией. С помощью параметра С выявлена возможность верификации некоторых болезней органов дыхания.
Установлена зависимость спектральных характеристик АФ эритроцитов периферической крови от степени нарушения ФВД.
Научно-практическая значимость исследования:
Усовершенствована методика и определены условия
проведения спектрофотометрии клеток кожных покровов и крови
практически здоровых и больных лиц. Определены
информативные спектральные показатели АФ, использование которых, совместно с параметрами ФВД, позволило отделить больных с необратимой (или частично необратимой) бронхиальной обструкцией (ХОБЛ I - На) от больных с обратимой бронхиальной обструкцией (БА). При исследовании клеточного дыхания у практически здоровых людей и больных ХОБЛ
спектрофотометрическим методом целесообразно учитывать изменения параметра С. Для верификации необратимой (или частично обратимой) обструкции у больных ХОБЛ легкой и средней степени тяжести целесообразно дополнить исследование показателей функций внешнего дыхания (ОФВ! и др.) параметрами АФ, характеризующими клеточное дыхание.
Апробация работы: проблемы оценки и прогнозирования здоровья военнослужащих в условиях современной военной реформы. — Науч.- практ. конф. 16—17 февраля 1995 г. - СПб.: ВМедА.
Третий международный симпозиум по электромагнитной экологии (ЭМС - 97). - СПб. — 1997, Проблемы терапевтической и хирургической пульмонологии. - СП6У/МЗ РФ, ГНЦД РАМН. - 1997.
Пятая Российская научно-техническая конференция
«Электромагнитная совместимость технических средств и биологических объектов. - ЭМС-98. - СПб / РАН, РАЭлТН, РАМН, Воннно-инженерный технический университет и др. - 1998.
Научно-практический конгресс «Интегративная медицина - новая идеология здравоохранения России». — СПб.: ВМедА — 2002.
Проблемы гармонии, симметрии и золотого сечения в природе, науке и искусстве. Конференция Винницкого государственного аграрного университета. Винница. - 2003.
Международная научно-практическая конференция «Проблемы обеспечения безопасности при чрезвычайных ситуациях». - СПб.: ГПС, 27 - 28 октября 2004 г.
По теме диссертационного исследования опубликовано 14 научных работ.
Внедрение результатов исследования:
Результаты исследования и основные положения диссертации используются во ФГУЗ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины» МЧС России (г. Санкт-Петербург) и в ГУЛ НИИ новых медицинских технологий (г. Тула).
Положения, выносимые на защиту:
Определение в реальном масштабе времени параметра С и других параметров спектра АФ может бьпъ использовано для динамического наблюдения за работой «клеточного дыхательного конвейера» у больных ХОБЛ легкой и средней степени тяжести в процессе лечения.
Параметр С более информативен для определения нарушения функции клеточного дыхания у больных ХОБЛ по сравнению с параметром %,
Изменение аутофлуоресценции кожных покровов коррелирует с нарушением ФВД у больных ХОБЛ в отличие от аналогичных показателей, определяемых у больных БА.
Возможности использования аутофлуоресценции тканей и клеток в медицине при патологии дыхательной системы
Заболевания дыхательной системы могут быть не только одной из причин нарушения газообмена, но и одной из основных причин глубоких обменных расстройств на уровне различных клеток и тканей [19]. Хронические патологические процессы дыхательной системы закономерно приводят к нарушениям биологического окисления (клеточного дыхания), вследствие нарушения функционирования различных звеньев дыхательной цепи или «клеточного дыхательного конвейера». Конформационные и химические изменения аминокислот и белков при этом сопровождаются существенным изменением их флуоресценции при воздействии излучений различных частот и длин волн [76, 79,141].
В работах, посвященных аутофлуоресценции или естественной нативной флуоресценции под воздействием ультрафиолетового (УФ) или смешанного (УФ + видимый свет) излучения феномен свечения биообъектов уже более 50 лет увязывается с клеточным дыханием (КД) или биологическим окислением, сопряженным с фосфорилированием [38, 97, 99]. Этот процесс осуществляется активным потоком электронов и протонов, перемещающимися по ферментному конвейеру — "дыхательной цепи" (ДЦ). Перемещение этих частиц обусловлено активацией большого числа белковых и ферментных молекул, включая молекулы пиридиннуклеотидов (ПН) 14 NAD+, NADH2, флавопротеидов (ФП) - FAD, FMNH2, коэнзима Q
(CoQ+,CoQH2), групп цитохромов (b. с, а), железосодержащего FeS-белка и некоторых других веществ. Установлен принцип функционирования ДЦ: он состоит в получении энергии из питательных веществ в процессе их распада до несгораемых продуктов - СС 2 и Н2О. Функциональное состояние клеток может быть оценено по их аутофлуоресценции в УФ-лучах [99, 117, 138, 163], поскольку интенсивность свечения на длинах волн 455 нм - 470 нм и 520 нм -530 нм отражает "энергетичность" именно тех компонентов дыхательной цепи, где основную часть составляют флавопротеиды (ФП) и пиридиннуклеотиды (ПН) [74,108, 144].
Закономерно возникает вопрос - может ли указанная технология быть использована для решения вопросов, возникающих при исследовании изменений функций внешнего и клеточного дыхания у больных с обструктивной патологией легких.
Заболевания легких с явлениями хронической бронхиальной обструкции относятся к числу широко распространенных среди населения промышленно развитых стран. Такие больные нередко теряют способность использовать весь вдыхаемый кислород, что, несомненно, является следствием, в первую очередь, распространенности курения, а также усиливающегося загрязнения окружающей среды и аллергизации населения [110].
В наше время в загрязнении атмосферы превалируют три основных источника: промышленность, бытовые котельные и транспорт [8, 12]. Аэрозольные частицы загрязняющих атмосферу естественных и промышленных источников отличаются большим разнообразием химических компонентов. В их составе обнаруживаются соединения кремния, кальция и углерода, реже 15 оксиды металлов; железа, магния, марганца, цинка, меди, никеля и др., а также асбест, способный изменять естественный паттерн дыхательных процессов. Вместе с ними на организм человека продолжают действовать факторы Чернобыльской катастрофы [3, 26, 85]. Кроме того, городское население страдает от интенсивного загрязнения воды, изменения качества и структуры питания и гиповитаминозов [21].
В таких условиях ХОБЛ становятся одной из причин визитов к врачу, а также вызовов скорой помощи и госпитализации. Только в наше время в США с ХОБЛ связано более 8 млн. посещений врача, 1,5 млн. вызовов скорой помощи и более 726000 госпитализаций. В структуре заболеваемости (в США) по числу дней нетрудоспособности, причинам инвалидности ХОЗЛ занимает четвертое - пятое, а среди причин смерти - четвертое место [119]. В то время, как за последнее десятилетие в развитых странах смертность от всех заболеваний снизилась на 22%, а от сердечно-сосудистых заболеваний на 23%, смертность от хронических обструктивных заболеваний легких выросла (особенно у больных старше 45 лет). При этом прогнозируется увеличение показателя смертности в недалеком будущем [ПО, 118]. Заболеваемость более высока в крупных мегаполисах, что подчеркивает связь болезни и промышленных поллютантов [42, 148].
В России от ХОБЛ страдает более 16 миллионов взрослых и пожилых людей. Большинство из них курящие мужчины, выкуривающие не менее одной пачки сигарет в день. В связи с большим распространением курения у мужчин, темп роста случаев ХОБЛ среди мужчин весьма значительно превышает темп роста среди женщин. Однако табакокурение получает все большее распространение среди молодых женщин, поэтому можно ожидать рост ХОБЛ в женской популяции [107,110]. ХОБЛ по своей структуре достаточно гетерогенны, ибо в их состав входят различные формы, клинические синдромы, объединяющим фактором которых являются нарушения функции дыхания по обструктивному типу. Для ХОБЛ характерен своеобразный симптомокомплекс с признаками терминальной дыхательной недостаточности: ОФВ 1,5 л или 30% от должной величины (когда при прогрессировании болезни, возникает утрата обратимого компонента бронхиальной обструкции и возникает легочное сердце). ХОБЛ начинается со снижения скорости выдоха. На этой стадии нивелируется нозологическая принадлежность болезни.
Наиболее часто причиной ХОБЛ является ХОБ, но симптомокомплекс объединяет гетерогенную по своей природе группу хронических болезней дыхательной системы: хронический обструктивный бронхит (ХОБ, около 90%), эмфизема легких (ЭЛ, около 1%), бронхиальная астма (БА) тяжелого течения (около 10%). В США и Великобритании в понятие "хронические обструктивные болезни легких" включает также муковисцидоз (MB), облитерирующий бронхиолит (ОБ) и бронхоэктатическую болезнь (БЭ) [107].
Нарушения внешнего и клеточного дыхания при неспецифических заболеваниях дыхательной системы и способы и определения
Характер нарушений внешнего и клеточного дыхания при заболеваниях органов дыхания во многом определяется используемыми для диагностики биологическими маркерами.
Биомаркером может считаться «количественно определяемый биологический параметр, который может быть использован для характеристики здоровья, физиологических процессов, факторов риска болезни, диагностических критериев болезни, метаболических процессов с целью проведения эпидемиологических исследований и т. д. [107]. Простейшими функциональными биомаркерами болезней легких считается медленно прогрессирующее (как правило, в течение 10-20 лет) снижение ОФВ1 и нарушения оксигенации тканей [110].
В эпидемиологических исследованиях учитывают, что выраженность клеточных дисфункций может зависеть от возраста. Пожилой возраст человека значительно отягощает течение болезней из-за возрастных структурных и функциональных изменений клеток [88, 110]. Важное диагностическое значение при заболеваниях с бронхиальной обструкцией имеют признаки дефекта или несовершенства иммунологических механизмов: значительное снижение образования интерферона в верхних дыхательных путях, сывороточного и секреторного иммуноглобулина А, снижение функциональной активности Т-системы иммунитета [47, 53].
Для определения характера изменений внешнего дыхания у больных ХОБЛ используют бронходилатационные пробы при спирометрии на обратимость обструкции. Прирост ОФВ более чем на 15% от исходных показателей условно принято характеризовать, как обратимую обструкцию.
Для исследования обратимости обструкции показательны пробы с ингаляционными бронходилататорами: оценивается их влияние на показатели кривой поток - объём, главным образом, на ОФВь Параметры МОС 75 - 25» обозначающие уровень форсированных экспираторных потоков при различных уровнях ФЖЕЛ, не могут сравниваться, т. к. сама ФЖЕЛ, по отношению к которой рассчитываются эти потоки, изменяется при повторных тестах. Важным считается мониторирование ОФВі (многолетнее повторное измерение), позволяющее подтвердить диагноз ХОБЛ. В зрелом возрасте в норме отмечается ежегодное снижение ОФВі в пределах 30 мл в год [105,125].
Развитие ХОБЛ сопровождается внешним и внутренним десинхронозом показателей ФВД и бронхиальной проходимости, а также нарушениями диффузионной способности легких (ДСЛ). При эмфиземе ДСЛ и ее отношение к альвеолярному объему (ДСЛ/Va) снижены в основном вследствие деструкции альвеолярно-капиллярной мембраны, уменьшающей эффективную площадь газообмена. У злостных курильщиков и пациентов контактирующих с окисью углерода на рабочем месте, биомаркером может быть остаточное напряжение СО в смешанной венозной крови. Это, в случае наличия ХОБЛ, может привести к ложно заниженным значениям ДСЛ [40].
Проведенные в разных странах крупные эпидемиологические исследования позволили установить, что для больных ХОБЛ характерно ежегодное снижение показателя ОФВі более чем на 50 мл в год. Другие показатели кривой поток - объём (за исключением ОФВі) являются, в основном, производными и расчетными от ФЖЕЛ [119].
Установлено, что бронходилатационный ответ зависит от фармакологической группы бронхолитика, путей его введения и техники ингаляции [65].
Как видно из анализируемых источников в них практически не идет речи о второй важной части дыхательного процесса — клеточном дыхании и его биомаркерах .
Отдельные нозологические формы патологии легких с хронической обструкцией имеют много характерных именно для них биомаркеров. Так, биомаркерами бронхита являются нейтрофильная инфильтрация, повышенная активность миелопероксидазы и нейтрофильной эластазы, от которой зависит степень дисбаланса в системе протеолиз-антипротеолиз, повышенная активность ИЛ-8 и фактора некроза опухолей (ФНО), повышение концентрации перекисей водорода в выдыхаемом воздухе [53, 67]. Биомаркерами бронхиальной астмы считаются эозинофилы и другие клетки воспаления, дегрануляция эозинофилов и выход ряда пептидов (эозинофильный катионныи белок и др.), повышенная продукция иммуноглобулина Е, повышенная активность организаторов воспалительного процесса - интерлейкинов (ИЛ-4 и ИЛ-5), а также высокие концентрации оксида азота (N0) в выдыхаемой фракции альвеолярного воздуха, что не характерно для обструктивного бронхита.
Однако в проводимых исследованиях по отдельным нозологическим формам патологии дыхательной системы с наличием (или возможным наличием) обструктивного компонента до сих пор мало внимания обращается на энергетическую стоимость дыхания, в том числе клеточного, несмотря на то, что у таких больных учет результатов исследования метаболизма играет исключительно важную роль в комплексной оценке состояния и выборе необходимой терапии [107].
Одним из важных элементов патогенеза многих заболеваний респираторной системы является неравномерность вентиляционно-перфузионных отношений. Маркерами развивающейся при этих заболеваниях хронической гипоксии является компенсаторный эритроцитоз - вторичная полицитемия и нарушения микроциркуляци [87, 105]. При ряде стрессорных и предболезненных состояний повышается агрегация эритроцитов, и по мере развития и прогрессирования болезни ухудшаются реологические свойства крови [39].
Адаптивные реакции, направленные на обеспечение кислородтранспортной функции крови, вызывают глубокие изменения в функциональном статусе эритроцитов в условиях хронической гипоксемии [101, 105]. Биомаркерами изменений в эритроне при ХОБЛ могут быть: увеличение агрегации эритроцитов за счет изменения поверхностного заряда, неспецифического влияния высоко молекулярных коллоидов плазмы и их взаимодействие с рецепторами эритроцитарных мембран; снижение деформируемости эритроцитов вследствие повышения жесткости мембран при гипоксии, как следствие увеличения уровня иммуноглобулинов всех классов [38, 113].
Приборная база и методы исследования клеточного дыхания, ход измерений и обработки результатов
В нашей работе применялись два основных измерительных комплекса: Комплекс 1 - предназначен для измерения аутофлуоресценции клеток кожных покровов и в биологически активных точках (БАТ).
Для измерения ультрафиолетовой биоспектрофотометрии в работе использовался волоконно-оптический спектрофотометр, основанный на разработках группы сотрудников Государственного оптического института им. С.ИЛЗавилова (Рис. 3) [10, 11].
Принцип его работы состоял в следующем: УФ излучение от ртутной лампы, с соответствующим блоком питания (4) пройдя через теплозащитный и возбуждающий светофильтры, поступало по волоконно-оптическому световоду 2 на щуп и через контактный объектив на объект, возбуждая его флуоресценцию.
Свет флуоресценции также через контактный объектив по второму волоконно-оптическому световоду 3 через запирающий светофильтр (ЖС) попадал на монохроматор (6), состоявший из дихроичного зеркала (дифракционной решетки) с системой развертки спектра и фотоэлектронного умножителя.
Электронный блок (5) содержал усилитель фототока, фильтр низкой частоты и буферный каскад сопряжения с персональным компьютером. Это позволило графически или в цифровом выражении регистрировать изменения флуоресценции в относительных единицах.
Дополнительные технические характеристики прибора:
длина оптоволоконных жгутов - 1600 мм, наружный диаметр дистального конца щупа - 12 мм, диаметр измеряемого участка объекта 3 мм, напряжение питания - 220В (переменное).
Источник возбуждающего излучения ртутная лампа ультрафиолетового излучения типа ДРШ-250-3, приемник излучения -специальный ФЭУ, длина волны возбуждения 365нм., спектральный диапазон флуоресценции 400 - 800 нм. Время измерения - 0,5 сек, аналоговый сигнал вывода информации на внешние регистрирующие устройства - от 0 до +8В, аппаратная погрешность - 2%, методическая погрешность (воспроизводимость измерений) - 2,5%.
Ход измерения и обработки результатов.
При снятии спектрофотометрических показателей ультрафиолетовые лучи с X = 365 нм через волоконно-оптический жгут направлялись на облучаемую зону кожи или на исследуемый биообъект. Этими лучами возбуждалась флуоресценция. По стекловолоконному световоду флуоресцентное излучение проводилось к фотоприемному устройству, где подвергалось автоматической компьютерной обработке по программе, выделявшей из всего спектра флуоресценции интенсивность излучения на длинах волн 455 - 470 нм и 520 - 530 нм (на этих длинах волн излучают, участвующие в биоокислении пиридиннуклеотиды и флавопротеиды). В правой части получаемого спектра находилась зона свечения преимущественно окисленных форм флавопротеидов (ФП): флавиномононуклеотида — ФМН и флавинадениндинуклеотида - ФАД. Оба этих вещества обладают ферментативной активностью сукцинатдегидрогеназы и НАДН дегидрогеназы. Считается, что окисленным ФП свойственна собственная флуоресценция, обусловленная рибофлавином на длине волны 530 нм. Если ФП восстанавливаются, то собственная флуоресценция утрачивается. происходит сдвиг полосы поглощения от 450 нм к 455 — 465 нм, в результате чего может усилиться флуоресценция на длинах волн 540 нм и далее, то есть: либо появляется второе плечо в спектре, либо максимум флуоресценции смещался в длинноволновую сторону. В левой части спектра выделялся участок 455 - 470 нм, основной вклад в аутофлуоресценцию которого принадлежит восстановленным пиридиннуклеотидам [9, 10]. С учетом этого для количественной оценки биоокисления анализу подвергались следующие «точечные» интенсивности аутофлуоресценции (I) светового излучения клеток кожи:
Imax -максимальная интенсивность аутофлуоресценции в спектре; 1_455 - интенсивность АФ на длине волны 455 нм.1_5зо - интенсивность АФ на длине волны 530 нм. - параметр (кси) равный отношению I530 к It55 ТО ЄСТЬ = I ОКФП530 н! Д воссг. ШІ455 нм (Этот параметр позволял косвенно отражать интенсивность клеточного дыхания в исследуемом участке тела или ткани); С - параметр, вычисляемый по формуле: (I_max - 1_5зо) / (I_max -L.455)" Этот коэффициент характеризовал интегральные изменения спектра АФ по изменениям интенсивности свечения на разных длинах волн спектрау в диапазоне 455 - 530 нм;
AI - параметр равный разности 15зо и I455 (прироста или уменьшения абсолютной величины максимальной флуоресценции после тестируемого воздействия).
Для работы с микрообъектами использовался телевизионно-микроскопический комплекс 2 в виде многоканальной светооптической микроспектрофотометрической установки (Рис.4.), снабженной источниками видимого и ультрафиолетового света, возбуждающими аутофлуоресценцию.
Прибор представлял собой бинокулярный микроскоп ЛЮМАМ-Р1 (1) с контактным эпиобъективом 10 х 0,30 ДТ 190 (ГОИ), освещаемым ртутной лампой ДРШ-250-3 с соответствующим блоком питания производства ЛОМО. В комплексе установлены: две ПЗС телекамеры ТК-1 - черно-белая и ТК-2 - Panasonic NV-R 100 (цветная), видеомагнитофон Panasonic Р5 и телемонитор (3), компьютер (4) фирмы IBM с видеоплатой (framegrabber), а также блоки питания и управления (5). Для определения спектрально-энергетических характеристик световых потоков использовалась спектро фотометрическая насадка (2) с фотоэлектронным умножителем (ФЭУ). С помощью программного обеспечения для анализа изображений при работе с эритроцитами осуществлялась запись и обработка изображений исследуемых биообъектов. С помощью комплекса исследовалось функциональное состояние объектов на нескольких светооптических каналах. Контролировались основные оптические характеристики (поток проходящего света, поток отраженного света, поток света флюоресценции, монохроматический поток проходящего света, монохроматический поток отраженного света, монохроматический поток флюоресценции) и спектрально-энергетические характеристики этих потоков, определяемые с помощью ФЭУ. Одновременно анализировалась форма клеток.
Стандартизация работы УФ-биоспектрофотометра
При эксплуатации УФ-биоспектрофотометра с кварцевым и стекловолоконным световодами на практике потребовалось учесть ряд обстоятельств, влияющих на воспроизводимость измерения спектров флуоресценции живых биообъектов.
Как известно, за основу прибора был взят прототип фотонного счетчика Вавилова - Черенкова, в который конструкторы [12, 18] внесли ряд существенных изменений и дополнений. В результате биоспектрофотометр получил возможность регистрировать спектр флуоресценции живых биообъектов в видимом диапазоне длин волн. При использовании варианта, в котором прибор применялся для оценки зоны поражения опухолевым процессом тканей молочной железы его спектр представлял описанный выше [85] типичный асимметричный «колокол» с более пологой правой половиной (см. также рис. 25 - 27). Для достижения эффективной «скрещенности» спектров флуоресценции и возбуждения в оптическую схему обычно помещался фильтр ЖС, который частично срезал свечение аутофлуоресценции биообъектов в синей и фиолетовой области, чем существенно снижал чувствительности регистрирующего устройства в синей области спектра (на участке, где интенсивность флуоресценции зависит от окислительно-восстановительных реакций пиридин-нуклеотидов). Это ухудшало возможность получения информации при обработке свечения кожи и слизистых из-за снижения чувствительности параметра «». При этом система давала переизлучения как входящего в прибор ультрафиолетового излучения, так и потока лучей возвращающегося света флуоресценции.
Для уменьшения паразитных излучений в оптической схеме прибора была предпринята попытка установки специальных интерференционных фильтров. Это позволяло уменьшить «вклад» паразитного света в анализируемый спектр. Однако характер результирующего спектра, естественно изменялся в зависимости от характеристик интерференционных фильтров. Обычно он принимал вид двугорбой или даже трехгорбой кривой с появлением максимумов в той или иной области спектра. Учитывая данное обстоятельство, в своих последующих исследованиях аутофлуоресценции комплекс использовался с одним фильтром ЖС или совсем без светофильтра, что существенно повысило чувствительность регистрирующего устройства в синей области спектра. Для уменьшения уровня помех была проведена ревизия всех оптических компонентов комплекса. Хорошей «скрещенности» удалось добиться соответствующей доработкой оптической схемы возбуждающей и регистрирующей части прибора. В частности, в блоке монохроматора были установлены дополнительные светопоглощающие панели, что свело к минимуму помехи, возникавшие за счет отражения и переизлучения света.
Для получения воспроизводимых результатов была проведена оценка эффекта выгорания.
Как известно [109], при поглощении сложной биомолекулой кванта энергии некоторое количество электронов, находящихся на внешних орбитах, переходят с основного на возбужденный уровень. Электрон, переходя с последнего возбужденного уровня на основной, излучает квант энергии (это и есть люминесценция). Но в биомолекулах много электронов и уровней, поэтому интенсивность люминесценции (флуоресценции) зависит от интенсивности возбуждающего воздействия. Чем больше, тем вроде бы лучше? Но за определенным пределом УФ-излучение может повреждать биомолекулы, и их свойства существенно изменятся. Такой эффект носит название «эффект выгорания». Схематически он представлен на рис. 6.
А - исходное свечение биообъекта, Б - через 40 с. экспозиции (объект сдвинут вверх на половину диаметра полевой диафрагмы).
Из рисунка следует, что через 40 секунд экспозиции интенсивность флуоресценции облученной части объекта уменьшилась более чем на 1/3 по сравнению с частью, не подвергшейся облучению. Такой биообъект уже нельзя считать интактным и проводить на нем эксперименты с воздействием каких-либо малоинтенсивных факторов. Все вышесказанное в полной мере относится и к регистрации аутофлуоресценции (АФ) на кожных покровах человека. На рис.7 показано, что АФ клеток кожи за 30 с. облучения уменьшается более чем на 40%. Из этого же графика следует еще один важный вывод: процедура регистрации АФ клеток кожи не должна превышать 5 с.
Для реализации вышеизложенного положения была изменена схема управления комплексом. Она заключалась как в установке кнопки «Пуск», запускающей регистрацию спектра, непосредственно на щупе (рис 2.2, поз. 8) (ранее запуск осуществлялся клавишей F1 на клавиатуре компьютера), так и в установке специального оптического затвора для возбуждающего излучения, пропускавшего УФ-излучение только на время регистрации спектра.
