Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Иммобилизация биокатализаторов 12
1.1. Микробная конверсия нитрилов карбоновых кислот 12
1.2. Преимущества иммобилизации 14
1.3. Классификация методов иммобилизации 15
1.4. Иммобилизация на поверхности материала носителя 16
1.5. Углеродные сорбенты как носители для иммобилизации микроорганизмов 23
1.6. Иммобилизация клеток в массе носителя 25
1.7. Иммобилизация клеток с использованием мембранной технологии 32
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 38
2.1. Бактериальные штаммы 38
2.2. Среды культивирования 39
2.3. Носители для адсорбционной иммобилизации 39
2.4. Условия культивирования бактерий и определение ростовых характеристик 42
2.5. Определение активности нитрилгидратазы 42
2.6. Определение сорбционной емкости носителей по отношению к субстрату и продукту нитрилгидратазной реакции 43
2.7. Определение операционной стабильности иммобилизованных клеток и клеток в суспензии 44
2.8. Адсорбционная иммобилизация клеток бактерий 45
2.9. Иммобилизация бактериальных клеток включением в гель 45
2.10. Ковалентная иммобилизация бактериальных клеток 46
2.11. Микроскопия 47
2.12. Статистическая обработка 47
ГЛАВА 3. Иммобилизация клеток актиновактерий рода rhodococcus на углеродных сорбентах 48
3.1. Морфология клеток родококков, выращенных на минимальной и полноценной средах 48
3.2. Сорбционная емкость углеродных сорбентов по отношению к клеткам бактерий 54
3.3. Сорбционная емкость углеродных сорбентов по отношению к субстрату и продукту нитрилгидратазной реакции 56
3.4. Электронно-микроскопическое изучение адсорбции клеток родококков на углеродных носителях 59
3.5. Нитрилгидратазная активность адсорбированных клеток родококков 64
3.6. Рост штамма R. ruber gtl на углеродных сорбентах и образование акриламида иммобилизованными клетками 66
3.7. Операционная стабильность биокатализатора, иммобилизованного на углеродных сорбентах 69
3.8. Влияние повышенной температуры на нитрилгидратазную активность клеток R. ruber gtl, иммобилизованных на БАУ 73
ГЛАВА 4. Иммобилизация клеток актинобактерий рода rhodococcus на новых углеродсодержащих носителях 78
4.1. Сорбционная емкость новых углеродсодержащих носителей по отношению к клеткам родококков и акриламиду 78
4.2. Нитрилгидратазная активность и операционная стабильность клеток родококков, адсорбированных на новых углеродсодержащих носителях 79
4.3. Рост клеток штамма R. ruber gtl на новых углеродсодержащих носителях 83
4.4. Электронно-микроскопическое изучение клеток родококков, адсорбированных на новых углеродсодержащих носителях 85
ГЛАВА 5. Иммобилизация клеток актинобактерии рода rhodococcus методами: включения в гель, металлохелатным и ковалентного связывания с носителем 88
5.1. Скорость нитрилгидратазной реакции и операционная стабильность клеток родококков, включенных в гели альгината бария и кальция 88
5.2. Сохранение нитрилгидратазной активности клеток родококков, иммобилизованных включением в гели к-каррагинана и агара 90
5.3. Иммобилизация клеток родококков включением в ковалентно сшитый ПААГ 91
5.4. Связывание клеток родококков с силикагелем, активированным хлоридом хрома 111) 92
5.5. Хелатирование клеток родококков гидрооксидом титана (IV) 94
5.6. Иммобилизация клеток родококков на полиамиде, активированном глутаральдегидом 95
Заключение 99
Выводы 107
Список литературы 109
- Иммобилизация на поверхности материала носителя
- Носители для адсорбционной иммобилизации
- Сорбционная емкость углеродных сорбентов по отношению к субстрату и продукту нитрилгидратазной реакции
- Нитрилгидратазная активность и операционная стабильность клеток родококков, адсорбированных на новых углеродсодержащих носителях
Введение к работе
Современное образование - это не только результат обучения, воспитания и развития личности, но и результат самообучения и саморазвития личности [69].
В условиях реформирования системы образования особую актуальность приобретает проблема компьютеризации. Роль компьютера как средства обучения в образовательном процессе неуклонно растет, во-первых, из-за информационных, наглядных и других возможностей вычислительной техники и, во-вторых, из-за специфического воздействия на обучаемых. Построение процесса обучения с использованием программного обеспечения позволяет повысить внимание, степень усвояемости, индивидуализировать обучение, развить самостоятельность в овладении учебным материалом.
Лекционно-сессионная система обучения, господствующая на протяжении столетий в вузах, уже не вписывается в современную информационную цивилизацию [37]. Канал связи между лектором с мелом у доски и сотней студентов с рукописными конспектами слишком медленный, зашумленный, не обеспечивает передачу необходимого количества информации. Обучение с одинаковой для всех скоростью порождает привычку «жить весело от сессии до сессии», а преподаватели, ориентируясь на итоговый экзамен, вынуждены тщательно сокращать конспект лекций, с трудом покрывающий основные фрагменты программы. Лекционно-сессионная система обучения применяется и на заочном отделении в утрированной форме: те же еще более сокращенные лекции в период сессии и итоговый экзамен. Информатизация системы образования ведет к радикальному изменению сущности и организации процессов обучения и развития человека.
Характерной чертой открытого образования является свободный доступ к информационным ресурсам мира. Открытое обучение снимает пространственно-временные ограничения в работе с различными источниками информации, в реализации учебного плана, предоставляет обучающимся широкие возможности самоуправления и самоорганизации. В центре процесса обуче-
ния находится студент и его индивидуальная работа, то есть роль студента становится активной. Преподаватель, являющийся в системе директивного образования основным источником информации и единственным экспертом в системе открытого образования, становится советником и помощником студента в его самообразовании [30].
Применение в учебном процессе системы обучения позволяет систематически и оперативно оказывать обучаемому необходимую дидактическую помощь, выполнять непрерывный контроль за действиями обучаемого в процессе обучения, развивать познавательную активность и инициативу обучаемого, снизить долю непроизводительного труда преподавателя [63].
Основными целями разработки и внедрения новых методов обучения является увеличение эффективности труда преподавателей и повышение качества подготовки специалистов.
Особая актуальность создания в России системы дистанционного образования сегодня обусловлена целым рядом факторов. Среди них огромные территории и сосредоточие научно-технических центров в крупных городах, формирование новых потребностей населения по отношению к содержанию и технологиям образования, развитие рыночной экономики, усиление миграции населения и др.
Дистанционное образование - это универсальная форма обучения, базирующаяся на использовании широкого спектра как традиционных, так и новых информационных и телекоммуникационных технологий и технических средств [94]. При этом его необходимо рассматривать не как альтернативу очной форме получения образования, а как ее дополнение, позволяющее оптимизировать учебный процесс за счет предоставления разным категориям граждан различных образовательных услуг, наиболее полно удовлетворяющих их потребностям [90]. Развитие дистанционного образования в России позволит обеспечить населению нашей страны доступ к качественному образованию, а также даст возможность завоевать свое место на мировом рынке образовательных услуг.
В системе дистанционного образования в России нуждаются следующие группы населения: учащиеся средних школ в сельской местности, в поселках, маленьких городах; менеджеры различного уровня; руководители региональных органов управления; офицерский состав сокращающейся армии; уволенные и сокращенные лица, зарегистрированные в Федеральной службе занятости; лица, желающие повысить квалификацию в какой-либо области знаний; лица, желающие получить второе высшее образование или пройти переквалификацию; русскоязычное население в странах СНГ и дальнего зарубежья; лица с ограниченной свободой перемещения и инвалиды.
Развитие информационных телекоммуникационных сетей дает новый импульс системам дистанционного обучения (СДО), обеспечивает доступ к информации, хранящейся в различных уголках нашей планеты [95].
Новые аппаратные и программные средства, постоянно наращивающие возможности компьютера, переход в разряд анахронизма понимания его роли как вычислителя постепенно привели к вытеснению термина «компьютерные технологии» термином «информационные технологии». Под этим термином понимают процессы накопления, обработки, представления и использования информации с помощью электронных средств. Так, суть информатизации образования определяют как создание условий учащимся для свободного доступа к большим объемам активной информации в базах данных, базах знаний, электронных архивах, справочниках, энциклопедиях [100].
Следуя этой терминологии, можно определить информационные технологии обучения (НТО) как совокупность электронных средств и способов их функционирования, используемых для реализации обучающей деятельности. В состав электронных средств входят аппаратные, программные и информационные компоненты.
Несмотря на очевидную эффективность использования дистанционного обучения (ДО), не наблюдается массового применения курсов ДО. Этому способствуют несколько основных причин. Курсы ДО часто недоступны из-за своей дороговизны. Нет централизованной базы данных всех курсов дис-
танционного обучения и виртуальных библиотек, их приобретение требует определенной денежной суммы, не имеющейся в учреждениях образования.
В качестве основных факторов, мешающих использовать компьютеры в образовании, выделяются следующие: во-первых, дефицит компьютеров, удовлетворяющих современным требованиям, и обучающего программного обеспечения, отсутствие подготовленных преподавателей; во-вторых, то, что современные компьютерные и коммуникационные технологии внедряются в образовательные системы часто без необходимого педагогического осмысления и теоретической поддержки; в-третьих, нерешенность проблемы создания хороших приложений учебного и образовательного назначения, так как это очень трудоемкий процесс, требующий участия многих специалистов из разных отраслей (программистов, преподавателей, методистов, инженеров и др.), а установка их в сетях влечет за собой дополнительные проблемы, связанные с условиями их распространения.
Многие проблемы в компьютерном и дистанционном обучении не решены. И отечественные, и зарубежные специалисты по сей день утверждают, что применение компьютеров в образовательной сфере породило больше проблем, чем решило (Е.С. Полат, О.П. Околелов, В.В. Семенов, В. Адольф, J.R. Fredriksen, A. Collins, G.A. Hutchings, W. Hall и др.). Например, основными проблемами, возникающими при создании обучающих курсов и организации компьютерного и дистанционного процесса обучения с их использованием [13,28, 36, 92], являются:
проведение системного анализа процесса компьютерного и дистанционного обучения, включая его моделирование и предложения по усовершенствованию;
построение учебного процесса с применением средств ВТ;
переработка курса с целью его использования при компьютерном обучении;
выбор информационных технологий для реализации поставленных педагогических и дидактических задач;
проектирование и реализация обучающего курса на основе современных информационных технологий;
осуществление контроля знаний, оценивание уровня закрепления умений и навыков при дистанционном (интерактивном) обучении и др.
Разработка мультимедийных обучающих курсов - довольно трудоемкая задача. В своем большинстве имеющиеся курсы представляют собой модель энциклопедии и не содержат обязательные разделы обучающего курса, такие как: общие сведения, предварительное тестирование, блок заданий и контроль усвоения разных уровней, словарь, справка. Курсы методически немо-дифицируемы, поэтому их использование затруднено для аналогичных дисциплин с разным объемом изучения.
Одним из способов решения данной проблемы является разработка программной оболочки для создания курсов ДО, которая должна содержать следующие компоненты: мультимедиа, средства контроля знаний (создание тестов, анализ результатов тестирования), справочно-поисковую систему, конструктор курсов.
На основании анализа специальной литературы выявлены нерешенные проблемы и определена тема работы: «Модель обучающего курса и реализация программной оболочки дистанционного обучения: системный и объектный подходы».
Актуальность работы обусловлена необходимостью постоянного повышения эффективности процесса обучения и контроля знаний, а также необходимостью разработки и апробации методов и средств, которые позволят существенным образом улучшить подготовку специалистов, в том числе и удаленно от места обучения.
В связи с развитием в нашей стране информационных технологий и Интернет возрастает роль дистанционного образования в общей системе вузовского образования. Это вызывает необходимость привлечения новых методов и технологий для организации обучения в условиях, когда обучаемый удален от места получения знаний. Последнее вызвано удорожанием проезда для
лиц, получающих заочное образование, и невозможностью надолго покидать рабочие места.
В связи с этим необходимо разрабатывать математические модели и информационные технологии для развития общего подхода к построению обучающего курса. Такой общий подход позволит, настраивая его на конкретные задачи, получать наиболее удобные и полезные для обучаемого формы представления знаний без значительных затрат на разработку каждого отдельного курса.
Объектно-ориентированный подход, как наиболее современный, находит свое отражение и в разработке приложений, и в организации баз данных, необходимых для хранения информации наиболее эффективно и наименее избыточно.
Целью настоящего исследования является построение модели обучающего курса для повышения эффективности дистанционного (интерактивного) обучения за счет применения системного и объектного подходов на всех этапах проектирования, реализации и сопровождения обучающей системы и обучающего курса с возможностью накопления статистики обучения.
Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:
Рассмотрение обучения и обучающего курса с позиций системного анализа и подхода.
Усовершенствование математической модели обучающего курса.
Разработка объектной модели обучающего курса и обучающей системы.
Создание информационной модели обучающего курса и ее реализация на основе объектно-ориентированной СУБД Cache.
Описание методики моделирования процесса обучения с использованием сетей Петри и цепей Маркова, сбора и обработки статистических данных, полученных в ходе обучения.
Применение полученных моделей для реализации программного комплекса системы.
- Апробация программного комплекса на примере обучающего курса «Информатика и программирование».
Степень разработанности проблемы. Общие вопросы дистанционного обучения рассматриваются в работах многих отечественных авторов: О.П. Околелов, В.В. Семенов, В. Адольф, А.А. Андреев, В.И. Солдаткин, А.Г. Молибог, В.П. Тихомиров, В.Г. Леонов, А.И. Башмаков, В.Н. Барсуков, Т.П. Воронина, В.П. Кашицин, О.П. Молчанова и др.
Специализированным вопросам построения курса и управления процессом обучения уделено внимание в работах следующих авторов: В.В. Соловов (проектирование компьютерных систем), Е.С. Полат (модели дистанционного обучения), В.П. Беспалько (дидактические основы программированного обучения), А.И. Башмаков и И.А. Башмаков И.А. (разработка компьютерных учебников и обучающих систем), А.Ю. Потюпкин (моделирование процесса обучения на основе теории нечетких множеств), Г.С. Курганская (структура учебного курса, модели оценивания сложных структур знаний), А.П. Свиридов (математическое описание процесса обучения и контроля знаний), И.М. Горбаченко (моделирование процесса обучения), Н.Ф. Талызина (теоретические проблемы программированного обучения, управление процессом усвоения знаний) и др.
Зарубежный опыт по проблемам процесса обучения представлен в исследованиях таких авторов, как Holtmerg В, Kiyama М., Brusilovsky P., Miller P., Lumsdaine А.А., Glaser R., Moore M.G., Kearsley G., Steven Ritter, Fredriksen J., Skinnerv B.F., Crowder N.A., Green E.J., Atkinson R.C., Bower G.H., Crothers E.J.h др.
Впечатляющий прогресс в развитии аппаратных и инструментальных программных средств ИТО предоставляет технические возможности для реализации различных дидактических идей. Однако, как показывает анализ литературы, отечественных и зарубежных компьютерных систем учебного назначения, ряд из них по своим дидактическим характеристикам нельзя назвать даже удовлетворительными [17, 46, 54], так как уровень качества про-
дукта учебного назначения закладывается на этапе его проектирования при подготовке учебного материала для наполнения баз данных электронных учебников, при создании сценариев учебной работы с компьютерными системами моделирующего типа, при разработке задач и упражнений и т.п.
Разработка средств ИТО для поддержки профессионального образования осложняется еще и необходимостью хорошо знать содержание предметной области и учитывать присущую ей специфику обучения. Именно отставание в разработке методологических проблем, «нетехнологичность» имеющихся методик являются одними из основных причин разрыва между потенциальными и реальными возможностями ИТО [86].
Объектом исследования является учебный процесс в условиях современных информационных технологий, дистанционного (интерактивного) обучения.
Предметом исследования является объектно-ориентированная модель обучающего курса и обучающая система с ее использованием.
Научная новизна работы заключается в разработке математической и информационной моделей обучающего курса, основанных на объектно-ориентированном и системном подходах; методики эффективного создания многоуровневого обучающего курса. Рассмотренные в работе положения являются развитием одного из направлений в теории обучения - моделирования процесса обучения. Предложенный объектно-ориентированный подход к моделированию обучающего курса и процесса обучения, а также реализация таких моделей расширяют возможности при разработке методологической основы применения информационных технологий в процессе обучения. Научную новизну диссертации представляют следующие результаты, выносимые на защиту:
1) сквозной подход к проектированию и разработке обучающей системы на основе общесистемных принципов;
моделирование процесса обучения курсу «Информатика и программирование» с использованием сетей Петри и цепей Маркова для расчета вероятностных характеристик процесса обучения;
объектно-ориентированный подход к построению модели обучающего курса, позволяющий эффективно хранить и использовать такие объекты, как: курс, частично представляемый сетью Петри; трек обучения (траектория обучаемого по сети Петри); тезаурус обучаемого и модель текущих знаний; профиль курса, строящийся на основе данных, хранящихся в треках, и позволяющий анализировать спроектированный курс с применением теории цепей Маркова и корректировать его с целью повышения эффективности процесса обучения;
программная реализация оболочки для построения обучающего курса и проведения процесса обучения на базе СУБД Cache, поддерживающая объектно-ориентированный подход, с использованием CSP-технологии, позволяющей создавать быстродействующие, хорошо масштабируемые и легко сопровождаемые Web-приложения;
программный комплекс для расчета и наглядного представления вероятностей достижения различных этапов процесса обучения с целью оценки эффективности обучающего курса и его дальнейшей модификации.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая разработка данной темы позволила, используя известный математический аппарат сетей Петри и цепей Маркова, применить их для моделирования и анализа процесса обучения курсу: модель курса представляется сетью Петри, процесс обучения отдельных обучаемых хранится в треках обучения, на основе которых строится профиль курса, показывающий, как курс воспринимается обучаемыми, и позволяющий получать с использованием теории цепей Маркова вероятностные характеристики процесса обучения и среднюю трудоемкость, необходимые для эффективной модификации курсов; а практическая реализация на базе современной СУБД Cache дала инструмент для построения обучающих курсов и эффективной организации дистанционного (интерак-
тивного) обучения с возможностью его индивидуализации. Разработанный программный комплекс прошел опытную эксплуатацию и внедрен в Институте экономики ИрГТУ и может быть использован для создания обучающих курсов и проведения обучения с их использованием (акт - в Приложении 3).
Основные методы и средства исследования поставленной задачи: системный анализ, современные CASE-средства, математический аппарат теории сетей Петри, цепей Маркова, теории вероятностей и математической статистики, объектно-ориентированный подход к проектированию и программированию.
Апробация работы. Работа выполнялась на кафедре вычислительной техники и кафедре технологии машиностроения. Основные положения проведенных исследований докладывались на Всероссийской конференции «Роль информационных технологий при обучении на программе МВА» (2003, Москва, МЭСИ), на международной конференции «Информационные технологии в образовании» (2003, Москва, МИФИ); молодежной научно-практической конференции «Современные информационные технологии в науке и образовании» (2004 г., Иркутск, БГУЭП); на международной научно-практической конференции «Системный анализ в проектировании и управлении» (2004, Санкт-Петербург, СПбГПУ); обсуждались на объединенном семинаре кафедр вычислительной техники, автоматизированных систем, информатики, технологии машиностроения (2006, Иркутск, ИрГТУ), на семинаре кафедр информационных технологий и системотехники (2006, Красноярск, СибГТУ).
Личный вклад автора. Автором с позиций системного анализа рассмотрен обучающий курс как компонент системы дистанционного образования; спроектирована объектная модель курса с использованием современного объектно-ориентированного CASE-средства Rational Rose; на основе материалов работы [27] доработана и предложена модель обучающего курса, которая должна облегчить создание и сопровождение разрабатываемых курсов с применением теории сетей Петри; приведено вероятностное описание про-
цесса обучения курсу (разделу курса) с использованием математического аппарата цепей Маркова, дающее априорные оценки некоторых характеристик процесса обучения, которые можно в дальнейшем уточнять в процессе реального обучения; разработан программный комплекс, позволяющий создавать обучающие курсы и проводить дистанционное (интерактивное) обучение с его использованием на базе постреляционной СУБД Cache с применением CSP-технологии; создано приложение для расчета и наглядного представления вероятностей достижения различных этапов процесса обучения с целью оценки эффективности обучающего курса и его дальнейшего усовершенствования.
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ в виде статей и докладов. Общий объём публикаций по исследуемой проблематике составляет 2,55 п.л.
Основные результаты исследования опубликованы в следующих работах:
1) Дорофеев А.С., Сосинская С.С, Усов Д.Н. Решение проблемы хранения данных и быстродействия приложений при online обучении с использованием постреляционной СУБД Cache // Роль информационных технологий при обучении на программе МБА: Сб. тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. -М.: Издательский центр МЭСИ, 2003. - С. 78-88.
Дорофеев А.С., Сосинская С.С, Усов Д.Н. Решение проблемы хранения данных и быстродействия приложений при online обучении с использованием постреляционной СУБД Cache // Роль информационных технологий при обучении на программе МБА: Сб. тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. -М.: Издательский центр МЭСИ, 2003. - С. 78-88. - (0,7 п.л., в том числе авторских 0,55 п.л.).
Дорофеев А.С. Применение объектной технологии при построении обучающих курсов // Информационные, технологии в образовании: Сб. трудов XII Междунар. конф. Часть IV. - М.: Просвещение, 2003. - С. 275-276. -(0,2 п.л.).
Дорофеев А.С. Выбор объектно-ориентированной СУБД для программной оболочки дистанционного образования // Открытое образование. -2004. - №3. - С. 55-62. - (0,5 п.л.).
Дорофеев А.С. Структура обучающего курса и моделирование процесса обучения с использованием сетей Петри // Вестник ИрГТУ. - 2004. -№3.-С. 16-21.-(0,4 п.л.).
Дорофеев А.С. Системный подход к описанию модели обучающего курса // Системный анализ в проектировании и управлении: Труды VIII-й Междунар. науч.-практ. конф. Часть 2. - СПб.: Нестор, 2004. С. 276-278. -(0,2 п.л.).
Дорофеев А.С. Структура обучающего курса и моделирование процесса обучения с использованием сетей Петри // Современные информационные технологии в науке и образовании: Сб. докл. и тез. молодежной науч.-практ. конф. / Под общ. ред. A.M. Горленко. - Иркутск: ИрГТУ, 2004. - С. 87-88.-(0,1 п.л.).
Дорофеев А.С. Моделирование процесса обучения с использованием сетей Петри // Компьютерное моделирование 2004: Труды V Междунар. на-уч.-техн. конф. Часть 2. - СПб.: Нестор, 2004. - С. 206-210. - (0,3 п.л.).
Дорофеев А.С. Учет индивидуальных способностей обучающегося в системах дистанционного обучения // Применение новых технологий в образовании: Материалы XV Междунар. конф. - Троицк: Тровант, 2004. - С. 306-307.-(0,1п.л.).
Дорофеев А.С. Обучение и обучающий курс как системы // Системный анализ в проектировании и управлении: Труды IX Междунар. науч.-практ. конф. - СПб.: Изд-во Политехнического университета, 2005. - С. 490-493.-(0,2п.л.).
Иммобилизация на поверхности материала носителя
Замена нефиксированной биомассы микроорганизмов в традиционном микробиологическом производстве на биокатализаторы в виде иммобилизованных бактерий поднимает биотехнологию на качественно новый, существенно более высокий уровень. При использовании иммобилизованных клеток эти преимущества возникают не потому, что как таковая иммобилизация коренным образом изменяет свойства микроорганизмов, а вследствие того, что существенно изменяются условия проведения самих биотехнологических процессов.
К преимуществам иммобилизованных клеток перед интактными можно отнести следующие: 1. Существенно упрощаются операции разделения используемого катализатора и сред, содержащих целевые продукты, что почти всегда позволяет перейти от периодических схем к более производительным и прогрессивным непрерывным технологиям с одновременным уменьшением размеров реакторов. 2. Для непрерывных процессов появляется возможность более длительной эксплуатации клеток в отличие от однократного использования свободных культур. 3. До определенной степени повышается устойчивость клеток к действию различных неблагоприятных инактивирующих внешних факторов (температуры, кислотности, концентрации электролитов или токсических веществ), а иногда становится возможной и дополнительная защита культуры от патогенной для нее микрофлоры в случае нарушения стерильности. 4. Имеется возможность повышения продуктивности процессов в результате увеличения концентрации биомассы в единице рабочего объема реактора [33]. Ко всем методам иммобилизации клеток и используемым при этом носителям предъявляются определенные требования, а именно: A. Используемый способ иммобилизации не должен в значительной степени затрагивать ферментные системы клетки, необходимые для реализации конкретной технологии. Поэтому при проведении иммобилизации желательно либо совсем исключить, либо свести к минимуму контакт клеток с токсичными для них веществами, а также предотвратить нежелательное воздействие на микроорганизмы температурных и осмотических стрессов. Б. Иммобилизацию предпочтительно осуществлять таким образом, чтобы клетки надежно удерживались носителем. B. Необходима хорошая операционная стабильность получаемых иммобилизованных биокатализаторов для их длительной эксплуатации, что зависит от механической, химической и биологической устойчивости носителя в условиях конкретного технологического процесса. Г. Материал носителя не должен создавать значительных диффузионных препятствий массообменным процессам. Д. Существенную роль, особенно при крупномасштабном производстве, играет экономическая сторона вопроса, а именно невысокая стоимость применяемого метода иммобилизации клеток и доступность исходных компонентов [33]. Подбирая метод иммобилизации, можно получить оптимальный биокатализатор для определенной реакции. Известные методы иммобилизации ферментов и клеток можно разделить на три группы: связывание на жестком носителе; включение в пространственную структуру без образования связей и «сшивка» ферментов или клеток между собой при помощи бифункциональных реагентов. Связывание на поверхности материала носителя подразделяется на адсорбцию и ковалентное связывание. Среди методов пространственного фиксирования выделяют включение в структуру геля, микрокапсуляцию и иммобилизацию с использованием мембранной технологии [37]. Для создания биокатализаторов на основе данного подхода могут быть использованы следующие типы носителей: 1. Непористый носитель, в который микроорганизмы не способны проникать на глубину намного большую, чем их размер. 2. Ячеистый носитель, в котором величина макропор (ячеек) такова, что клетки проникают на значительную глубину внутрь материала матрицы и фиксируются на поверхности макропор. 3. Сами клетки выступают в роли носителя. Иммобилизация происходит путем искусственной агломерации микроорганизмов с помощью флокуляции, химической сшивки либо образованием полиэлектролитных комплексов с макромолекулярными противоионами. При иммобилизации на поверхности носителя клетка может быть связана с ним различными взаимодействиями: - адсорбционно-неспецифические. Нековалентные взаимодействия поверхности клетки и носителя (ионный обмен с образованием слабодиссоциирующих солевых связей, хелатирование, гидрофобные взаимодействия, водородные связи). - адсорбционно-биоспецифические. Образование прочных комплексов аффинных лигандов носителя с соответствующими рецепторами на поверхности клетки с помощью нековалентных связей. - химические. Ковалентное связывание клеток с носителем непосредственно либо с помощью специального сшивающего агента. К достоинствам адсорбционной иммобилизации относится простота методов ее проведения. По существу, иммобилизация происходит при контакте водной суспензии микроорганизмов с адсорбентом. Способы иммобилизации разделяются на статические, с перемешиванием, а также путем нанесения на колонке. «Идеальный» адсорбент должен обладать соответствующей химической и биологической стойкостью, механической прочностью, а также зарядом, противоположным адсорбируемому веществу. Кроме того, должна существовать возможность получения адсорбента в виде удобных в технологическом отношении форм. Необходимо, чтобы он был способен выдерживать стерилизацию. Данные требования, разнообразие экспериментальных задач и свойств микроорганизмов обусловливают существование широкого набора применяемых для адсорбционной иммобилизации материалов [33].
Носители для адсорбционной иммобилизации
Как уже отмечалось, перспективы применения иммобилизованных клеток широки, и включают в себя проведение процессов биотрансформации различных соединений, осуществление биодеградации органических веществ и ксенобиотиков, а также биоэлектрокатализ. Создание биосенсоров на основе биологических чувствительных элементов [7], представляющих собой либо иммобилизованные ферменты в виде тонких гомогенных биоактивных слоев на твердых носителях [6, 61, 139, 158, 159], либо целые клетки [75, 95, 136], также требует усовершенствования способов иммобилизации. При формировании рецепторного элемента биосенсора используют различные методы иммобилизации микроорганизмов - включение в гели, синтетические мембраны, а также адгезию, химическое прикрепление клеток друг к другу или к носителю с помощью бифункциональных реагентов [31]. В настоящее время разработаны биосенсоры на количественное определение акрилонитрила в водных растворах, основанные на кондуктометрическом определении заряженного акрилата аммония, образуемого из незаряженного акрилонитрила иммобилизованными клетками R. ruber - продуцентами нитрилаз [136]. Для определения цианидов в среде в качестве альтернативы ион-селективному цианидному электроду была разработана биосенсорная система, основанная на аммонийном электроде и ферменте цианидазе. Кроме иммобилизованного фермента, биосенсор на цианиды может содержать целые клетки R. rhodochrous, обладающие данной ферментативной активностью [95].
Иммобилизация нитрил конвертирующих бактерий в целях биотрансформации и биоремедиации направлена на получение стабильного биокатализатора для долговременного использования. Hughes et al. обобщают опыт применения иммобилизованных клеток родококков в промышленном синтезе акриловых мономеров. Иммобилизованные в ПААГ клетки штамма R. erythropolis, обладающие нитрилгидратазной активностью, конвертировали 1,1 М акрилонитрил с потерей не более 50% активности в течение 6 часов. Штамм R. ruber, проявляющий нитрилазную активность, был устойчив к условиям полимеризации акриламидного геля. Иммобилизованный биокатализатор трансформировал 1,3 М акрилонитрил с сохранением 50 % активности в течение 47 дней. Штамм R. rhodochrous, включенный в ПААГ, гидролизовал 0,42 М акриламида до акрилата аммония в течение 8 дней с сохранением 50% первоначальной активности [87]. Для иммобилизации нитрилконвертирующих микроорганизмов авторы также предлагали включение в гидрогели альгината кальция [58, 81, 84], альгината бария [66], пектина, к-каррагинана [65], ПВС [46], агара и агарозы [59]. У некоторых из этих иммобилизованных биокатализаторов повышалась термостабильность и толерантность к токсическим химическим веществам. Целые клетки В. pallidus, иммобилизованные в альгинате кальция, были более устойчивы к высоким концентрациям 3-цианопиридина и никотиновой кислоты, чем свободные клетки [118]. Клетки Candida guilliermondii, включенные в гранулы альгината кальция, могли метаболизировать субстраты, недоступные для свободных клеток, такие как циклопентанокарбонитрил, бензонитрил, бензамид [66]. С другой стороны, отмечалось снижение каталитической активности при иммобилизации включением в гели, что объяснялось ограничением массопереноса и доступа кислорода к клеткам [118].
Диффузионных затруднений можно избежать при иммобилизации целых клеток методом адсорбции. Предпринимались попытки адсорбционной иммобилизации нитрилгидролизующих микроорганизмов, в частности, на кремнеземе и на активированных полисульфоновых мембранах, но при адсорбции без активации носителя клеточная нагрузка, ферментативная активность и операционная стабильность были относительно более низкими [93]. Анализ литературных данных показал, что незаслуженно мало внимания уделяется применению углеродных носителей для адсорбционной иммобилизации каталитически активных клеток. Т.И. Давиденко отмечает, что активный уголь пригоден в качестве носителя микробных клеток. Т.к. одним из факторов, препятствующим сорбционной иммобилизации микроорганизмов, являются электростатический и гидратный барьеры, то микроорганизмы проявляют большее сродство к гидрофобному сорбенту. Причем предельная сорбция и прочность удерживания гидрофобных клеток выше, чем гидрофильных, и при достаточно высоких концентрациях микроорганизмы с гидрофобной поверхностью способны к многослойной сорбции [11]. Гидрофобность поверхности активных углей и клеток родококков может увеличивать эффективность адсорбции. Разработанные Г.А. Коваленко с соавт. макроструктурированные керамические носители, покрытые слоем каталитического волокнистого углерода и графитоподобным углеродом, успешно применялись для иммобилизации как нерастущих бактериальных клеток [102] и клеток дрожжей, так и растущих алканотрофных родококков [21]. Авторы отмечали, что носители со слоем каталитического волокнистого углерода обеспечивают прочное связывание микробных клеток с носителем, а также полное сохранение ферментативной активности микроорганизмов и максимальную стабилизацию полученных биокатализаторов [21].
Таким образом, остается актуальной разработка адсорбционных методов иммобилизации питрилконвертирующих родококков и поиск подходящих носителей, а таюке изучение свойств иммобилизованных бактерий.
Сорбционная емкость углеродных сорбентов по отношению к субстрату и продукту нитрилгидратазной реакции
Определена способность клеток родококков адсорбироваться на углеродных носителях, отличающихся по структуре и пористости. Как видно из рис. 5, наибольшей сорбционной емкостью, достигавшейся в результате 35-минутной адсорбции, обладали активные дробленые угли: БАУ - 14,6 мг сухих клеток/г сорбента и NORIT РК 1 -3 - 13 мг/г.
Наименьшей сорбционной емкостью среди изученных носителей обладали волокнистые углеродные материалы - «Войлок» (7,5 мг/г сорбента), «Урал» (9,5 мг/г сорбента), а также углеродный материал на основе фуриловой смолы ФАС (8 мг/г сорбента).
Максимальная сорбционная емкость углеродного тканого материала «Урал» по отношению к клеткам, близкая по величине к сорбционной емкости активных дробленых углей, достигалась через сутки сорбции, тогда как другие изученные углеродные сорбенты достигали максимума сорбции в течение получаса.
Известно, что процесс адсорбции микробных клеток зависит от площади доступной поверхности, которая слагается в основном из макропор, превышающих по размерам микробную клетку. БАУ обладает развитой системой макропор (1,35-1,45 см3/г), что составляет 80-82% от общего объема пор. Диаметр макропор находится в диапазоне от 5 до 40 мкм. Это обеспечивает эффективную адсорбцию клеток R. ruber gtl, выращенных до стационарной фазы роста на минимальной среде N, когда проявляется максимальная каталитическая активность [22] и размер клеток находится в пределах от 1 до 7 мкм. Сходные величины адсорбции наблюдаются и для клеток R. erythropolis 84, проявляющих максимальную каталитическую активность в середине логарифмической фазы роста на минимальной среде N [22], когда размер клеток достигает 3 мкм. Дисперсионное состояние углеродных сорбентов также имеет значение для процесса адсорбции клеток. Так, мелкодисперсность ФТД и угля-сырца обеспечивает адсорбцию родококков, сравнимую с БАУ. Среди изученных сорбентов, активный нетканый материал «Войлок» имеет наименьший суммарный объем пор -0,60-0,68 см /г, в то время, как у ФАС и активной ткани «Урал» суммарный объем микро- и мезопор превышает объем макропор, что отражается на процессе адсорбции клеток.
Взаимодействие клетки с активными углями идет по адсорбционно-неспецифическому типу, которое представляет собой нековалентные взаимосвязи клетки и носителя. Основной вклад в адсорбцию клеток в этом случае вносят гидрофобные связи. На процесс адсорбции клеток влияют как поверхностные свойства носителя, так и микробной клетки. Известно, что родококки обладают гидрофобной поверхностью, а активный уголь является гидрофобным сорбентом [11]. Кроме того, родококки способны формировать многослойные биопленки на поверхности инертных материалов [21]. Следовательно, гидрофобные сорбенты, в том числе угли, более пригодны для иммобилизации микробных клеток, чем гидрофильные, а микроорганизмы с гидрофобной поверхностью быстрее формируют биопленку на носителе.
Чтобы адекватно оценить нитрилгидратазную активность иммобилизованных клеток бактерий, необходимо определить количество субстрата и продукта ферментативной реакции, адсорбированное на носителях. Определена сорбционная емкость углеродных сорбентов по отношению к акрилонитрилу - субстрату ферментативной реакции, катализируемой нитрилгидратазой. Показано, что высокой сорбционной емкостью (до 350-400 мг/г) обладали БАУ, «Войлок» и ФАС (рис. 6). Минимальная сорбция наблюдалась на угле-сырце. Следуя полученным данным, на БАУ, «Войлоке» и ФАС сорбируется около 15% внесенного 1 М субстрата и 50% от 0,3 М. Как показано далее, это приводит к тому, что концентрации субстрата, при которой достигается максимальная активность интактных клеток, недостаточно для проявления максимальной активности иммобилизованными клетками.
При использовании иммобилизованных клеток в производственных процессах важно, чтобы продукт ферментативной реакции минимально адсорбировался на носителе. С целью оценки сорбционной емкости носителей по отношению к продукту реакции была проведена адсорбция 10 мМ раствора акриламида на углеродных сорбентах.
Определена сорбционная емкость носителей по отношению к акриламиду (рис. 7). Установлено, что носители с иммобилизованными на них клетками адсорбируют меньше акриламида, чем свободные от клеток. Наибольшее количество акриламида адсорбирует активированная углеродная ткань «Урал» - 27 мг АА на г сорбента в ненагружешюм клетками состоянии, и 17 мг АА на г сорбента, нагруженного клетками. Практически отсутствует сорбция акриламида на угле-сырце. Разница между сорбцией продукта реакции свободными и нагруженными носителями достаточно велика для активных дробленых углей - БАУ (22 и 7 мг АА на г сорбента соответственно) и NORIT РК 1-3 (17 и 7,5 мг АА на г сорбента соответственно). Определенное количество акриламида, по-видимому, адсорбируется на поверхности макропор, поэтому при иммобилизации клеток акриламид адсорбируется в меньшем количестве. Суммарный объем пор угля-сырца в основном представлен макропорами, что объясняет малые величины адсорбции молекул акриламида и полное отсутствие его адсорбции при предварительной иммобилизации клеток. Активная ткань «Урал», напротив, сохраняет способность к адсорбции больших количеств акриламида даже после предварительной иммобилизации клеток. Этот факт может быть обусловлен тем, что суммарная поверхность активной ткани «Урал» образована в равной мере микро- и макропорами, представляющими собой не сетевую структуру, как в гранулированных углях, а главным образом межволоконное пространство.
Нитрилгидратазная активность и операционная стабильность клеток родококков, адсорбированных на новых углеродсодержащих носителях
При оценке операционной стабильности было выявлено, что клетки R. ruber gtl, теряющие в суспензии 50% нитрилгидратазной активности ко второму циклу полной конверсии 1,3 М раствора НАК, при иммобилизации на активных углях способны выдержать 5-7 циклов конверсии без потери активности. Известно, что тепловой выход реакции гидратации НАК составляет +18-19 ккал/моль [2], а разогрев реакционной смеси приводит к падению активности фермента. В этом случае, вероятной причиной стабилизации нитрилгидратазной активности при адсорбционной иммобилизации бактерий может быть локальный отвод тепла от мест прикрепления иммобилизованных клеток через материал носителя, что устраняет локальные перегревы и снижает скорость тепловой денатурации при работе фермента. Это обусловлено разностью коэффициентов теплопроводности, составляющих для воды - 0,58, а для углеродных материалов- 1,19-1,23 Вт/м/К.
Падение активности после 5-7 циклов конверсии в нашем случае связано с инактивацией фермента, а не с вымыванием клеток, либо фермента из разрушенных клеток, что было определено по отсутствию нитрилгидратазной активности в промыве. В то же время, в литературных источниках подобный факт объясняется слабостью адсорбционных взаимодействий клетки и носителя и, как результат, смывом клеток при проведении последовательных циклов реакций [93].
Клетки штамма R. erythropolis 84 в суспензии обладают гораздо меньшей операционной стабильностью по сравнению с R. ruber gtl. Во втором цикле конверсии сохраняется лишь около 10% первоначальной активности, а стабилизация активности при адсорбционной иммобилизации незначительна и выражается в сохранении 30% активности во втором цикле реакций. Это связано, возможно, с более низкой термостабильностью нитрилгидратазы штамма/?, erythropolis 84 [22].
Тепловая денатурация внутриклеточного фермента при пролонгированном действии на клетки повышенной до 50-70С температуры зависит от времени воздействия этой температуры. У иммобилизованных клеток она наступает позже и менее выражена, чем у клеток в суспензии, что также обусловлено защитным действием активных углей, которое обусловлено более высокой теплопроводностью этих носителей по сравнению с водой.
Нами была проведена адсорбция клеток родококков на новых углеродсодержащих адсорбентах с различной морфологией углеродного поверхностного слоя, синтезированного на поверхности керамзита, а также на углеродных носителях, приготовленных путем карбонизации графитизированной сажи (Сибунит) и илистых отложений озер (Сапропель). При сравнении новых карбонизированных носителей марки Сибунит и Сапропель установлено, что Сапропель является наиболее предпочтительным носителем для целых клеток вследствие широкопористой структуры.
Проведенные эксперементы подтвердили, что на биокаталитические свойства иммобилизованных клеток родококков существенно влияет морфология углеродного слоя. Как было показано Г.А. Коваленко с соавт., носители с синтезированным на поверхности шероховатым слоем КВУ являются оптимальными для иммобилизации нерастущих клеток дрожжей и растущих клеток алканотрофных родококков. Авторы наблюдали активацию в 1,5-1,8 раза внутриклеточной инвертазы у адсорбированных дрожжевых клеток и возрастание оксигеназной активности в 3,7 раза у адсорбированных родококков по сравнению с суспендированными клетками [21]. Нами было показано, что нитрилгидратазная активность клеток, иммобилизованных на Сапропеле, не только сохраняется на уровне активности клеток в суспензии, но и возрастает в 2-2,8 раза при повышении концентрации субстрата до 1,3 М. У клеток R. ruber gt\, адсорбированных на Сибуните и керамзите со слоем КВУ, наблюдалось повышение нитрилгидратазной активности в 1,2-2,3 раза. Повышение ферментативной прикрепленное состояние для почвенных бактерий является естественным физиологическим состоянием в отличие от суспендированного в водной среде.
Активность клеток R. ruber gtl после иммобилизации на носителе со слоем гладкого графитоподобного углерода составляет лишь половину исходной активности суспензии и снижается уже во втором цикле последовательных ферментативных реакций. В то же время, нитрилгидратазная активность клеток, иммобилизованных на адсорбентах с шероховатым КВУ-слоем и на массивном КВУ, сохраняется на уровне активности клеток в суспензии в течение 6 последовательных циклов ферментативных реакций.
Таким образом, среди изученных углеродсодержащих композиционных материалов и карбонизированных адсорбентов наиболее перспективными для целей иммобилизации каталитически активных клеток являются носители с шероховатым КВУ-слоем, либо обладающие развитой системой макропор (Сапропель).
Для решения проблем, связанных с применением иммобилизованных клеток микроорганизмов в биокатализе, необходимы глубокие знания особенностей взаимодействия носителей и клеток, физиологии клеточных популяций, развивающихся внутри носителей и в присутствии носителей [28]. Нами проведено изучение растущих в присутствии активных углей и углеродсодержащих носителей клеток родококков. Было показано, что растущие в присутствии углеродных сорбентов клетки R. ruber gtl адсорбировались в процессе роста на носителях, оставались жизнеспособными и не снижали ферментативную активность. Количество выросшей биомассы превышало таковую в суспензии, что подтверждалось гравиметрически.
