Содержание к диссертации
Введение
Гл. I. Современное состояние вопроса о судебно-медицинской диагностике интоксикаций каннабиноидами (обзор литературы) 9
1.1. Наркотические препараты конопли и анализ распространения гашишных наркоманий 10
1.2. Юшнико-токсикологическая характеристика каннабиноидных интоксикаций 18
1.3. Судебно-медицинское определение каннабиноидной интоксикации 38
Гл. II. Материалы и методы исследования 49
2.1. Общая характеристика наблюдений 49
2.2. Морфометрические исследования 54
2.3. Гистохимические методы определения активности дегидрогеназ в головном мозге 57
Гл. III. Эпидемиологический анализ острых и хронических каннабиноидных интоксикаций 67
3.1. Условия, сопутствующие острой и хронической каннабиноидной интоксикации у живых лиц 67
3.2. Признаки каннабиноидной интоксикации, установленной при судебно-медицинской экспертизе трупа 73
3.3. Обобщение результатов 82
Гл. IV. Морфологические изменения при острой и хронической каннабиноидной интоксикации 86
4.1. Характеристика наблюдений в случаях острой и хронической каннабиноидной интоксикации 86
4.2. Морфометрические визуальные и гистологические изменения органов при отравлении каннабисом 88
4.3. Энзиматическая активность дегидрогеназ в головном мозге трупов при каннабиноидной интоксикации 92
4.4. Обсуждение полученных результатов 94
Гл. V. Патоморфология сочетанной каннабиноидной и алкогольной интоксикации 98
5.1. Характеристика наблюдений 98
5.2. Морфометрические и гистологические изменения органов 100
5.3. Активность дегидрогеназ головного мозга при сочетанной каннабиноидной и алкогольной интоксикации 103
5.4. Обсуждение полученных результатов 106
Заключение 108
Выводы 123
Практические рекомендации 126
Список литературы
- Юшнико-токсикологическая характеристика каннабиноидных интоксикаций
- Судебно-медицинское определение каннабиноидной интоксикации
- Признаки каннабиноидной интоксикации, установленной при судебно-медицинской экспертизе трупа
- Энзиматическая активность дегидрогеназ в головном мозге трупов при каннабиноидной интоксикации
Юшнико-токсикологическая характеристика каннабиноидных интоксикаций
Каннабиноиды под наиболее распространенными названиями гашиш и марихуана являются наркотиками и имеют растительное происхождение. Основные психоактивные эффекты гашиша и марихуаны связаны с 9-дельта-тетрагидроканнабинолом (ТГК) - наркотическим веществом, содержащимся в смолистом веществе, стеблях и листьях женских особей ко-нопли-дикорастущей (Cannabis sativa). Особенно богата ТГК разновидность конопли-дикорастущей - конопля индийская (Cannabis indica) [92, 210,211].
Формы каннабиса, используемые в нелегальной продаже: марихуана; гашиш (hash); гашишное масло. Марихуана - высушенная и измельченная верхняя часть растения каннабис с листьями и цветками. Содержание психоактивных веществ в марихуане достигает 13-15%. Гашиш - смола (смолка), выделяемая каннабисом в период вегетации, имеет зеленый, темно-коричневый или черный цвет. Содержание основного психоактивного вещества (ТГК) обычно около 2%, но может достигать 9-10%о. Гашишное масло - концентрированный темный жидкий и вязкий по консистенции экстракт смолы каннабиса с содержанием ТГК от 10 до 30-60%. Гашишное масло добавляют в обычные табачные сигареты или сигареты с марихуаной (в 1 сигарете 500-750 мг марихуаны с содержанием ТГК 1-4%) [188].
У лиц часто употребляющих марихуану может возникать психическая и психологическая зависимость, обусловленная главным психоактивным компонентом каннабиса Д-9-тетрагидроканнабинолом (ТГК). Интоксикация может привести к потере сознания и, реже, к смерти [203].
ТГК высоко липофилен и широко распределяется в организме, мета-болизируясь в целый ряд активных и неактивных метаболитов. Первичный психоактивный метаболит- 11-гидрокси-ТГК [204].
Ранее повсеместно распространенная дикорастущая конопля исполь зовалась для лечения. В США до 1942 года препараты из конопли продавались в аптеках как медикаментозные средства широкого профиля; названия этих препаратов можно увидеть в списках государственной Фармакопее США тех лет. Однако, накопившийся негативный опыт и многочисленные факты отрицательного социального и медицинского влияния наркотика, развеяли миф о его безопасности. Большинство исследователей утвердились во мнении, что марихуана, хотя и проявляет более низкую тенденцию к продуцированию физической и психической зависимости, все же может вызвать наркотическое пристрастие и оказывать вредное воздействие на ментальные, эмоциональные и физические функции организма [165, 166]. В США до 1992 г. марихуана относилась к списку №2, что означало возможность ее ограниченного использования для больных СПИДом, онкологическими заболеваниями, глаукомой с медицинскими целями. С 1992 г. в США производится только основной психоактивный ингредиент марихуаны ТГК, который в составе препаратов дронабинол, маринол, наби-нол, цезамет разрешен к использованию в США и Германии для лечения глаукомы и токсикоза раковых больных. В Нидерландах и Испании выращивание небольшого количества конопли и использование ее для собственных нужд не преследуется законом. В России, в настоящее время, кан-набис, его препараты и все изомеры ТГК входят в Список №1 постоянного комитета по наркотикам РФ, что запрещает их использование с любыми, в том числе медицинскими целями [156].
Различия гашиша и марихуаны заключаются в разных способах извлечения ТГК из конопли. В зависимости от вида в разных частях растений конопли количество ТГК колеблется от 1 до 15 % ее сырого веса. Марихуана получается при высушивании и последующем измельчении цветков, листьев и верхушек конопли. Марихуана наиболее распространена в Европе и Америке. Используют также высушенную травяную смесь, получившую на русском, и соответственно английском языке, в сленге нарко манов обозначение «травка» (grass) или «сено» (hay) [299].
Гашиш получают из смолы, образующейся на верхушках цветков конопли - матерки. Смола конопли высушивается, иногда прессуется. Гашиш называют также анашой; на сленге подростков он чаще всего фигурирует как "план". В наркотическом отношении гашиш приблизительно в 10 раз сильнее марихуаны. Синтетический гидроканнабинол 20-кратно превышает действие естественного гашиша [152, 158].
После алкоголизма гашишизм — наиболее распространенный вид наркотизма в мире (по числу пораженных лиц). Гашиш обычно курят как в виде чистой смолы (в кальянах, наргиле, джоза, килимах), так и в смеси с табаком, жуют (банг). Но иногда глотают в пилюлях, заваривают, как кофе, добавляют в пищу, принимают в форме жидкого экстракта с пряностями, смешивают с беленой или дурманом. Подобные формы приема распространены в арабских и азиатских странах. В странах европейской цивилизации гашишное опьянение достигается курением в смеси с табаком, т. е. возникает смешанная гашишно-никотиновая интоксикация [169].
Опьяняющее действие конопли известно с XV в. Для достижения расслабляющего, успокаивающего, легкого одурманивающего эффекта конопля и ее наркотические продукты широко используются в мусульманских странах Востока, среди народов Азии и Африки. Мусульманство запрещало употребление спиртных напитков. Гашиш сделался для мусульман самым популярным заменителем алкоголя. Его стали курить в мужских компаниях, ведя "застольные" беседы [171].
Первое научное описание гашишной интоксикации принадлежит французскому психиатру Моро де Туру (Moreau de Toures J.), 1845. Он же предложил использовать гашиш для экспериментального исследования психики, возможно, став, таким образом, основателем экспериментальной психиатрии. Но злоупотребление гашишем в Европе до середины XX столетия оставалось весьма ограниченным.
Судебно-медицинское определение каннабиноидной интоксикации
При экспертизе живых лиц по поводу наличия каннабиноидов основным объектом исследования является моча. Моча одновременно наиболее доступный и удобный для химико-токсикологического исследования объект при использовании высокочувствительных и специфических методов анализа, таких как хроматомасс-спектрометрия (ГХ/МС), газовая хроматография (ГХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [12, 43, 47, 89, 131, 132, 135, 142, 224, 256].
Главным компонентом, определяющим наркотические психоактивные свойства марихуаны является транс-дельта-(9)-тетрагидроканнабинол (ТГК). Компонентами, которые подтверждают употребление марихуаны, являются ТГК и его основные метаболиты: первичный психоактивный метаболит 11-гидрокси-дельта-(9)-тетрагидроканнабинол (11-ОН-ТГК) и конечный биологически неактивный продукт 11-нор-9-карбокси-дельта-(9)-тетрагидроканнабинол (ТГК-СООН), а также в меньших количествах кан-набинол и каннабидиол [10, 155, 183, 220].
Первичный метаболит может быть обнаружен в плазме крови; в моче его можно обнаружить только в первые несколько часов после приема и в гораздо меньших количествах [15, 330, 169].
Большинство прикладных экспертных методик анализа каннабиноидов (более 90%), которые используются для доказательства факта употребления марихуаны и ТГК-содержащих наркотических средств, основываются на анализе ТГК-СООН в моче [278].
Пробоподготовка для анализа ТГК-СООН, как правило, включает 3 основные стадии: гидролиз; экстракцию (жидко-жидкостную (ЖЖЭ) или твердофазную) и дериватизацию. Общая процедура пробоподготовки, используемая в различных химико-токсикологических лабораториях досточ-но похожа [293].
Иммунохимические методы определения каннобиноидов (ПФИА, ИФА, ИХА) отличаются высокой чувствительностью и используются как предварительные. Подтверждающими методами исследования являются ГХ/МС, ГХ, ВЭЖХ [156].
Согласно литературным данным внешние проявления каннабиноид-ная интоксикации весьма незначительны. К ним относятся гиперемия конъюнктив и общая кахексия. Из субъективных ощущений курильщиков марихуаны известно, что употреблениие каннабиса сопровождается сухостью слизистых оболочек рта и глотки [142].
Через 10 минут после выкуривания 10 мг марихуаны (0,019-0,026 мг/л х 3,18) концентрация ТГК составляла 0,060-0,083 мкмоль/л. Пик содержания в плазме наступает через 10 минут после курения или через 3 часа после приема внутрь. Около 70% дозы выводится через 72 часа, примерно в равных соотношениях с мочой и калом [293].
Методы иммуноисследования дают возможность измерить активное вещество, метаболиты или и то, и другое. В большинстве наборов реактивов используются антитела против ТГК-СООН, являющейся неактивным, но самым обильным метаболитом ТГК. Этим методом ТГК-СООН может регистрироваться в моче в течение нескольких недель после последнего употребления марихуаны [294].
Минимальная эффективная доза ТГК в крови 5 мг, эффективная оральная доза 50-200 мкг/кг веса, эффективная доза при курении 25-50 мкг/кг. Токсическая доза, составляющая около 0,035 мг/кг, сильно зависит от толерантности к каннабису. Сигареты содержат, обычно, около 300-750 мг марихуаны с долей ТГК от 0,5 до 11%, иногда до 13-15% и выше, в редких случаях. Обычная суточная доза марихуаны - 2 сигареты (около 40 мг ТГК). В процессе курения значительная часть ТГК подвергается термической деструкции. При глубоком дыхании и задержке дыхания до 20-30 секунд, около 50% ТГК попадает в кровь. При курении средняя биодоступность 10-23%. Способность ТГК связываться с липопротеинами составляет около 97% [156,293, 296].
Кинетика всасывания ТГК зависит от способа введения каннабиса. Кон 41 центрационные профили ТГК при курении и внутривенном введении подобны, но в случае курения концентрация вдвое меньше. При курении, достигаемая концентрация ТГК зависит от умения курильщика (продолжительности затяжки, объема ингаляции, задержки дыхания). ТГК поступает в систему кровообращения в течение нескольких минут, максимум концентрации в плазме крови достигается через 5-30 минут. Последующее снижение концентрации ТГК в плазме крови до уровня 1-3 нг/мл происходит в течение 3-5 часов [142,272,293,294].
Фармакокинетика выведения ТГК описана моделью 2-фазного элиминирования. Фаза «быстрого» выведения продолжается около 40 минут, фаза «медленного» выведения - до 24 часов. У 226 потребителей марихуаны содержание ТГК в крови определялось в интервале от 0 до 113 нг/мл при среднем значении 15,4 нг/мл. Максимальной концентрации ТГК в крови соответствовали максимальные по выраженности психопатологические эффекты (high). Время половинного снижения концентрации ТГК в плазме крови, в течение «быстрой» и «медленной» фаз элиминации составило соответственно 3-4,5 минут и около 20 часов [296].
Основной путь превращения ТГК в организме человека связан с быстрым окислением углерода аллильной группы энзимной системой печеночного цито-хрома Р450 до первичного короткоживущего психоактивного 11-гидрокси-дельта 9-тетрагидроканнабинола (11-ОН-ТГК), который далее под действием алкоголь-дегидрогеназы (АДН) окисляется в конечный биологически неактивный продукт: 11-нор-дельта 9-тетрагидроканнабинол-9-карбоновую кислоту (ТГК-СООН). Начальный продукт биотрансформации 11-ОН-ТГК обладает равной с ТГК активностью или превышает ее. Пиковая концентрация 11-ОН-11К в плазме гораздо ниже, чем исходного ТГК. В моче 11-ОН-ТГК обычно не обнаруживается [31,293].
Признаки каннабиноидной интоксикации, установленной при судебно-медицинской экспертизе трупа
В группе наблюдений, объединенных по признаку отсутствия любых интоксикаций, включая каннабиноидную и алкогольную, на основании комплексного судебно-медицинского исследования трупа с обязательным судебно-химическим лабораторным исследованием, при гистологическом, морфометрическом и гистохимическом исследовании были получены по 95 казатели, использованные в качестве контрольных. При гистологическом исследовании были отмечены острые расстройства кровообращения, пери-васкулярные кровоизлияния, отек в головном мозге и легких, наличие дистрофических изменений нейронов, четкая структурная дифференцирован-ность коркового вещества надпочечников с мелкими очагами делипидиза-ции и цитолиза спонгиоцитов. Не характерными для данной группы наблюдений были некробиотические, гиперпластические и склеротические изменения в головном мозге, легких, надпочечниках.
При острой каннабиноидной интоксикации установлено некоторое уменьшении линейных размеров гипофиза и увеличение веса и размеров, а также степени размягчения мозгового вещества надпочечников. Установленная зависимость согласуется с имеющимися в литературе представлениями о гормонрегулирующей роли ГГС. Функциональная активность надпочечников зависит от факторов, вырабатываемых в гипоталамусе и гипофизе, взаимодействие которых между собой осуществляется по принципу прямой или обратной отрицательной связи (А.Хэм, Д.Кормак, 1983).
По сравнению с контрольной группой при острой каннабиноидной интоксикации отмечались более выраженные (3,5-4 балла) очаговые нарушения кровообращения в сосудах головного мозга и легких, имело место стирание границ между структурно-функциональными зонами надпочечника, усиление пигментации коры, увеличение числа темных клеток и площади их распространения на границе коры и мозгового вещества, де-липидизация спонгиоцитов.
В выделенной подгруппе с хронической каннабиноидной интоксикацией (при отрицательном результате ГЖХ исследования крови на наличие этанола), средние линейные показатели веса и размеров гипофиза имели выраженную тенденцию к уменьшению. Вес гипофиза составлял в среднем 3,4+0,03 г. (контроль 4,0+0,04 г.); размер гипофиза - 0,47+0,04 у.е. (контроль 0,5+0,05 у.е.). Однако различия были статистически несущественны (р 0,05). По сравнению с контрольной группой наблюдений надпочечники были гипертрофированы, в основном за счет коркового слоя.
Средний вес надпочечников составлял 9,9+0,8 г. (контроль 9,1+0,5 г.). Наибольшая толщина левого надпочечника в медиальных отделах была равна 7,1+0,08 мм (контроль 6,2+0,06 мм), коэффициент отношения К/М -0,52+0,05 (контроль 0,44+0,05). Степень размягчения мозгового вещества надпочечников увеличилась (р 0,05) по сравнению с контролем на 33% и составила -1,2+0,04 (контроль 0,9+0,01).
Таким образом, линейные размеры гипофиза и надпочечников при ХКИ изменялись более резко, чем при ОКИ, а различия между этими подгруппами становились более значимыми. Клеточно-тканевые изменения на границе структурных зон надпочечника, в пучковой и сетчатой зонах коры, на границе с мозговым веществом, которые обнаружены нами при канна-биноидной интоксикации, подтверждаются данными литературы при изучении алкогольных токсических воздействий (В.И. Алисиевич, 1973).
При гистологическом исследовании головного мозга отмечались очаговые некротические изменения нейронов (0,21+0,03 балла), чаще встречались воспалительные и склеротические изменения в головном мозге и его оболочках (0,17+0,02 балла) и легких (0,27+0,03 балла).
Изучение дегидрогеназ (диафораз) в ядрах гипоталамуса выявило их низкую исходную энзиматическую активность, которая при каннабиноид-ной интоксикации имела тенденцию к еще большему снижению. Таким образом, полученные нами данные с одной стороны свидетельствовали о существовании в гипоталамусе метаболической активности этанолокис-ляющих ферментов, а с другой - о дифференцированном распределении АДГ и АльДГ в его ядрах. Кроме этого, дифференцированное распределение этанолокисляющих ферментов в супраоптическом и паравентрикуляр-ном ядрах гипоталамуса указывает на наличие в них этанолзависимых, повышенно чувствительных структур, которые в условиях каннабиноидных интоксикаций могут служить "мишенями" для токсикантов (Ю.И. Пигол-кин и соавт., 2002).
В условиях ОКИ активность АДГ в нейронах СО (2,46-2,50 балла) и ПВ (2,31-2,39 балла) ядер была снижена более значительно, нежели при ХКИ (СО ядро - 2,51-2,56 балла, ПВ ядро - 2,35-2,39 балла).
При ОКИ отмечалось повышение активности АльДГ в паравентри-кулярном ядре переднего гипоталамуса до 3,2 баллов (р 0,05). Активность АльдГ в нейронах супраоптического ядра при ОКИ колебалось в интервале 2,3 - 2,7 балла.
Оказалось, что при ХКИ в отсутствии экзогенной алкоголемии энзи-матическая активность АльДГ в гипоталамусе ингибирована. В нейронах супраоптического ядра она составляла 2,2-2,9 балла, в нейронах паравен-трикулярного ядра - 2,67-2,74 балла. ГЛАВАV
Данное исследование, представляющее собой группу сравнения, выполнено на практическом судебно-медицинском материале. Наблюдение включает в себя 6 случаев смерти, наступившей без агонии от разных механических травм. Возраст умерших находился в интервале между 25 и 37 годами.
Энзиматическая активность дегидрогеназ в головном мозге трупов при каннабиноидной интоксикации
Для контроля ферментативной активности АДГ из инкубационной среды исключается субстрат (спирт) или кофермент (НАД), или же срезы нагреваются до плюс 80 градусов по Цельсию и выдерживаются в таком состоянии в течение часа. При добавлении в инкубационную среду 320 мкл пиразола (4,1 мг/мл д.в.) происходит полная инактивация АДГ (С.А. Teaque et al., 1980). Такой же эффект достигается при погружении срезов перед инкубацией в 0,01 М раствор йодацетата (йодуксусная кислота - 185 мг/100 мл 0,01 н NaOH). Окрашивания препаратов при этом не происходит. Для проготовления рабочих растворов навески Na-пирофосфата, НАД, НСТ и пиразола взвешивались с точностью до 0,001 г. НСТ следует предварительно растворить в диметилформамиде. Хлористый магний перед употреблением нужно подвергнуть перекристаллизации. Раствор НАД сохраняет свою активность всего несколько часов, поэтому для инкубации каждый раз следует готовить новый раствор. Буферные растворы готовятся на бидистиллированной воде при 4 С.
Гистопрепараты исследуются на оптическом микроскопе. Изучается распределение АДГ в нейронах гипоталамуса, нейронных и железистых структурах передней и задней доли гипофиза. Темно-синие мелкозернистые и диффузные массы выпавшего осадка формазана синего цвета указывают на активность АДГ. Гистотопография изучаемых нейронов уточня 130 ется с помощью контрольных срезов, окрашенных по Нисслю,.
Определение активности АльДГ в гипоталамусе проводится по методу Зиматкина СМ. с соавт. (1985), в основе которого лежат гистохимические методы Э. Пирса, 1962; Р. Лилли, 1969 и 3. Лойда и соавт., 1982 по выявлению НАД-зависимых дегидрогеназ в головном мозге. Специфичность данной реакции для определения АльДГ доказана с помощью избирательных ингибирующих свойств цианамида. При определении активности АльДГ требуется контроль за режимом температуры и времени. Замороженные среды толщиной 15 мкм для определения активности АльДГ готовятся в камере криостата, при температуре минус 20 градусов по Цельсию с использованием антироллерной пластины. Готовые срезы беличьей кисточкой укладываются на предметные стекла, размораживаются с помощью пальца в камере криостата, а затем подсушиваются при комнатной температуре. Стекла со срезами помещаются в стеклянную кювету для инкубации, которая герметизируется с помощью притёртой крышки.
Инкубация проводится в термостате в течении 30 минут при температуре плюс 37 градусов по Цельсию, для чего в кювету с объектами нужно добавить предварительно подогретый инкубационный раствор.
Срезы трижды по 1 минуте промываются изотоническим раствором хлористого натрия, фиксируются в 5,0% растворе формальдегида, приготовленном на 0,1 М Na-пирофосфатном буфере. Затем проводится обезвоживание в 50% и 70% этаноле в течение 30 секунд и в абсолютном спирте -1,5 минуты. После этого препараты подсушиваются при комнатной температуре, просветляются в ксилоле 1 минуту и заключаются в бальзам.
Исключением из инкубационной среды ацетальдегида, кофермента НАД " или же нагреванием срезов до плюс 80 градусов по Цельсию в течение часа можно провести проверку активности АльДГ.
При приготовлении рабочих растворов следует соблюдать следующие правила: ацетальдегид добавляется в инкубационнную среду непосредст 131 венно перед проведением инкубации; для приготовления раствора амитала он растворяется в смеси этанол - вода, в соотношении 1:1; при приготовлении растворов поливинилпирролидона (ПВП) и ацетальдегида нужно использовалась бидистиллированную воду. Особенности приготовления растворов хлористого магния и НСТ такие же как при определении активности АДГ. Срок хранения инкубационной среды не превышает 2-х часов.
Исследование гистопрепаратов следует проводить на оптическом микроскопе. Для определения активности АльДГ нужно измерить оптическую плотность выпавшего осадка формазана темно-синего цвета.
При использовании метода одновременного гистохимического определения АДГ и АльДГ в одном гистопрепарате, предложенном Т. Watabiki с соавт. (1989) проводится последовательная инкубация криостатных срезов с нитротетразолиевым синим и феррицианидом в присутствии субстратов, НАД и ионов меди (Си2+). Локализация и активность каждого из ферментов устанавливается соответственно по плотности образующегося осадка: формазана и ферроцианида. Одновременное гистохимическое определение АДГ и АльДГ с нитросиним тетразолием и феррицианидом меди осуществляется в два этапа.
На первом этапе, в процессе инкубации этанола в присутствии НАД, феназинметасульфата и нитросинего тетразолия образуется металл-формазановый комплекс (синего цвета), хелатированный ионом меди. Он характеризует активность АДГ. На втором этапе определяется активность АльДГ по плотности осадка ферроцианида меди (коричневого цвета), образующегося при инкубации срезов с ацетальдегидом, сульфатом меди, цитратом натрия, НАД и феррицианидом.
Из замороженных в жидком азоте объектов на микротоме криостата МК-25 при температуре минус 18 грудусов по Цельсию готовятся срезы толщиной 15 шп. Срезы нужно разместить на охлажденных предметных стеклах, расправить кисточкой, разморозить и высушить.
