Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
ВВЕДЕНИЕ 6
ГЛАВА 1. ГАПЛОИДИЯ. СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ГАПЛОИДНЫХ 13
РАСТЕНИЙ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР BRASSICA OLERACEA L.
Гаплоидия и её значение для селекции растений 13
Культура микроспор Brassica olerace L. 16
Некоторые ботанические и биологические особенности Bras- 22 sica oleraceae L.
1.3.1. Развитие пыльника и микроспор 23
1.4 Изменение программы развития микроспор под действием фак- 28
торов влияющих на андрогенез in vitro
1.4.1. Оптимальная стадия развития пыльцы для введения в 28
культуру
Условия выращивания растений-доноров 30
Влияние генотипа на андрогенез in vitro 31
Влияние температурной предобработки на андрогенез in 32 vitro
Влияние регуляторов роста на морфогенез микроспор ка- 37 пусты белокочанной
Другие факторы, влияющие на андрогенез in vitro 38
1.5. Способы получения удвоенных гаплоидов 44
ГЛАВА 2. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ, ИСХОДНЫЙ МАТЕРИАЛ, 48
СХЕМА И МЕТОДИКИ ПРОВЕДЕНИЯ ОПЫТОВ
2.1. Цель, задачи и схема исследований 48
2.1.1. Схема исследований 49
2.2. Условия проведения исследований 56
Почвенные и агрохимические условия проведения иссле- 56 дований
Погодные условия вегетационных периодов 2007 — 2009 58 гг.
2.3. Материал и методика проведения исследований 60
Исходный материал 60
Методика лабораторных опытов 60 2зз Проведение оценки исходного и полученного в ходе исследо- g4
ваний материала
ГЛАВА 3. Усовершенствование элементов технологии получения уд- 67 военных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор
Влияние наночастиц серебра на донорные растения капусты 67 белокочанной
Влияние температуры на эмбриоидогенез капусты белокочан- 69 ной в культуре микроспор
Определение зависимости стадии развития микроспоры от 71 длинны бутона
Определение зависимости эмбриоидогенеза от стадии развития 75 микроспор
Определение зависимости эмбриоидогенеза от плотности сус- 77 пензии микроспор
Влияние питательной среды на эмбриоидо- и каллусогенез 80
Влияние регуляторов роста на эмбриоидогенез 83
Влияние сахарозы на эмбриоидогенез 86
Влияния кислотности среды на эмбриоидогенез 88
Влияние аскорбиновой кислоты на эмбриоидогенез 90
Влияния питательных сред, регуляторов роста и сахарозы на 91 рост и развитие эмбриоидов
ГЛАВА 4. ОЦЕНКА РАСТЕНИЙ-РЕГНЕРАКТОВ КАПУСТЫ 95 БЕЛОКОЧАННОЙ, ПОЛУЧЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР
Цитологический анализ растений-регенерантов капусты бело- 95 кочанной поколения R0 по количеству хромосом
Оценка растений-регенерантов капусты белокочанной поколе- 97 ния R0 по количеству устьиц и числу хлоропластов в них
Подтверждение гаплоидной природы растений-регенерантов 100 методом ПНР
Характеристика удвоенных гаплоидов капусты белокочанной 103 полученных в культуре микроспор по морфологическим признакам
Биохимический анализ растений-регенерантов капусты белоко- 104 чанной, полученных в культуре микроспор
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 108
ВЫВОДЫ 109
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИОННОЙ 111
ПРАКТИКЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 113
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
Сокращенное название
ГНУ ВНИИО
6-БАП а-НУК
2,4 Д 2 - ip КИН
тдз имк
MS Gamborg В5
Полное название
Государственное научное учреждение Всероссийский научно - исследовательский институт овощеводства
6 - бензиламинопурин
а — нафтилуксусная кислота
2,4 Д - дихлорфеноксиуксусная кислота
N6 - 2 - изопентил- аденозин
6 - фурфуриламинопурин
1-денил -3 (1,2,3 - тидиазол - 5 -ол) мочевина
индолилмасляная кислота
индолил - 3 - уксусная кислота
гибберелловая кислота
абсцизовая кислота
питательная среда Мурасиге - Скуга (Murashige Т., SkoogF., 1962)
питательная среда Гамборга В5 (Gamborg O.L.,
1984)
питательная среда Нитча (Nitsch J. P., 1967)
Введение к работе
Актуальность темы. Капуста была введена в культуру более 5000 лет назад. Родиной всех возделываемых видов капусты считают Средиземноморье. На протяжении тысячелетий из дикой капусты человеку удалось получить большое разнообразие форм. В результате отбора растений и укорачивания междоузлий были получены кочанные формы- — белокочанная, краснокочанная и савойская* (Пивоваров В.Ф., Старцев В.И., 2006).
В кочанах капусты в обилии содержатся витамины Р, К, Вь В2, РР, С, инозит, фолиевая кислота, биотин. Все эти вещества и витамины полезны и необходимы для>организма человека. Зеленые листья капусты служат источником каротина, переходящего в организме человека в витамин А. В капусте был также обнаружен витамин U, который употребляют в качестве эффективного быстродействующего средства для лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. Капуста богата полезными минеральными солями. Особенно много в ней калия, фосфора, есть кальция железо, марганец. Капуста является так же источником Сахаров и легкоусвояемых белков. По содержанию азотистых веществ она превышает брюкву, репу, морковь, свеклу. Клетчатка капусты способствует выведению из организма жироподобных веществ - холестерина (Петрушко Ю.Н., 2003).
Немаловажное значение капуста имеет в качестве кормового растения для сельскохозяйственных животных и птиц, для чего в свежем или силосованном виде используют отходы от столовых сортов и специально культивируют кормовые сорта, но главным образом листья капусты (Петрушко Ю.Н., 2003).
Капуста белокочанная является перекрёстноопыляемым растением, имеющим двухлетний цикл развития. В связи с этим селекционный процесс этой культуры является длительным и трудоемким и основан преимущественно на внутривидовой гибридизации с последующим многократным отбо-
ром, использовании инфекционно-провокационных фонов для оценки материала на устойчивость к стрессовым факторам среды (Поляков А.В., 2000).
Основные направление в селекции капусты белокочанной, это скоро-спелость, устойчивость к болезням (кила, сосудистый бактериоз, фузариоз и др.) и вредителям (Пивоваров В.Ф., Старцев В.И., 2006).
Использование удвоенных гаплоидов в овощеводстве особенно актуально в связи с тем, что в последние годы в производстве особое внимание стали уделять технологиям, сортам и гибридам, приводящим к получению высокой выравненное, и урожайности (Литвинов С.С., 2003). В связи с этим роль гаплоидных растений в селекции очень велика. Применение их позволяет существенно повысить эффективность селекционного процесса, ускорить получение генетически стабильных линий и облегчить поиск редких признаков, контролируемых рецессивными генами (Поляков А.В., 2000).
В настоящее время гаплоиды можно получать различными способами, однако искусственным путем с использованием методов культуры изолированных тканей удается получать большее их количество. На сегодняшний день разработаны и наиболее часто применяются следующие способы получения гаплоидов с использованием методов in vitro:
культура изолированных пыльников и микроспор;
культура семяпочек;
метод гаплоиндуктора, при котором из-за несовместимости родителей происходит элиминация отцовских хромосом. Однако, метод гаплоиндуктора и культура семяпочек очень трудоёмки, а в культуре пыльников происходит развитие диплоидов из соматических тканей. Наиболее эффективным и технологичным является использование метода культуры микроспор. Но в данном направлении остаётся ещё много проблемных вопросов.
Исходя из вышеописанных проблем, целью исследований является усовершенствование элементов технологии получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор для использования их в селекционном процессе.
Объект исследований — технология получения удвоенных гаплоидов капусты белокочанной в культуре микроспор.
Предмет исследований — бутоны, пыльники, микроспоры, эмбриоиды, растения - регенераты капусты белокочанной.
Научная новизна работы. Впервые в России усовершенствованы компоненты и технологические элементы, позволяющие получать гаплоиды и удвоенные гаплоиды капусты белокочанной в культуре микроспор. В результате проведённых исследований усовершенствованы элементы технологии культуры микроспор: установлена оптимальная длина бутона капусты белокочанной - 3-5 мм, содержащая невакуолизированные микроспоры, обладающие морфогенетической активностью. Выявлены эффективные концентрации 6-бензиламинопуриа (БАП) - 4 мг/л, а-нафтилуксусной кислоты (НУК) - 0,3 мг/л для индуцирования эмбриоидогенеза Показана эффективность температурной предобработки бутонов повышенной (+32С) температурой в течение 1 суток. В результате оптимизации условий культивирования микроспор (соотношение и концентрация регуляторов роста, состава питательной среды, концентрации сахарозы) повышена эффективность эмбриоидогенеза до 0,164±0,04%. Проведена оценка с помощью RAPD-анализа полученных растении-регенерантов, в результате которой установлена их генетическая гетерогенность в сравнении с исходным материалом. С помощью цитологического анализа доказана гаплоидная природа растении-регенерантов капусты белокочанной, полученных в культуре микроспор.
Впервые в России усовершенствованы технологические элементы культуры микроспор капусты белокочанной, позволяющие получать гаплоиды и удвоенные гаплоиды. Выявлены эффективные концентрации 6-бензиламинопуриа (БАП) - 4 мг/л, а-нафтилуксусной кислоты (НУК) - 0,3 мг/л для индуцирования эмбриоидогенеза, показана эффективность температурной предобработки бутонов повышенной (+32С) температурой в течение 1 суток, установлено высокая эффективность использования наночастиц се-
ребра в концентрации 0,12 ^М для снижения бактериальной и грибной инфекции у донорных растений.
Практическая ценность. Установлено, что использование питательной среды Мурасиге - Скуга (Murashlge Т., Skoog F., 1962) (MS), содержащей БАЛ в концентрации 4 мг/л, НУК — 0-3 мг/л, аскорбиновую кислоту — Г мг/л, сахарозу — 120 г/л, и режима температурной предобработки бутонов капусты белокочанной +32Є в течение 1 суток, индуцирует эмбриоидогенез микроспор с частотой 0; Г64±0,04% и позволяет получить гаплоиды и удвоенные гаплоиды.
Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями; статистической обработкой полученных данных.
Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы, и предложения были доложены и представлены на IV конференции; РАЕН Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты (Москва, 2007); VIII и IX Молодежной-научной конференции, посвященной памяти F.C. Муромцева (Москва, 2008, 2009); на IX Международной научной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 2008); на Международной научно-практической конференции, посвященной памяти Б.В. Квасникова (Верея, 2009):
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
применение наночастиц серебра в концентрации 0,12 мМ в качестве стерилизующего агента для предобработки донорных растений капусты белокочанной позволяет снизить инфицированность эксплан-тов бактериальными и грибными инфекциями;
лучшая стадия для получения гаплоидных растений является ранняя невакуолизированная микроспора; при введении в культуру, плот-
ность суспензии микроспор составляет 50000 шт./мл в жидкой питательной среде;
культивирование микроспор на питательной среде-MS, содержащей БАП в концентрации 4 мг/л, НУК - 0,3 мг/л, сахарозу-120 г/л, рН-5,6, аскорбиновую кислоту - 1 мг/л, плант агар-5 г/л, при температуре +25С и фотопериоде 16/8, позволяет получить эмбриоиды;
культивирование эмбриоидов на питательной среде MS, содержащей БАП в концентрации 1 мг/л, НУК - 0,1 мг/л, сахарозу 30 - г/л, рН 5,6, плант агар 5 г/л, при температуре +25С и фотопериоде 16/8 позволяет получить растения-регенеранты;
линии, полученные на основе удвоенных гаплоидов капусты белокочанной сорта Подарок и линии 33, характеризуются высокой вы-равненностью, повышенным содержанием витамина С и Сахаров.
Публикации результатов исследований
По результатам исследований по теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе одна в журнале «Картофель и овощи», рекомендованном ВАК РФ.
Зонтиков Д.Н. Культура микроспор: состояние и* перспективы //А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков, Р.В Сергеев //Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты. Сб. науч. трудов. Москва: РАЕН, 2007, вып. 16. - С. 172 - 187.
Зонтиков, Д.Н. Культура микроспор Brassica oleracea L. /Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова //Сб. науч. трудов VIIL Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2 апреля 2008 г.). — М.: ГНУ ВНИИСБ, 2008. — С. 17-18.
Зонтиков, Д.Н. Эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре микроспор /А.В. Поляков, Д:Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова //Тезисы IX Международной конференции «Био-
логия клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.). — М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. — С. 306-307.
Зонтиков, Д.Н. Регенерационная способность капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) /С.А. Зонтикова, А.В. Поляков, О.Ф. Чикризова, Д.Н. Зонтиков, Г.Н. Ралдугина //Тезисы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Звенигород, 8-12 сентября 2008 г.). — М.: ИД ФБК-ПРЕСС, 2008. — С. 136-137.
Зонтиков, Д.Н. Влияние температурного стресса и борной кислоты на эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре микроспор /Д.Н. Зонтиков, А.В. Поляков //Сб. науч. трудов по овощеводству и бахчеводству к 110-летию со дня рождения Б.В. Квасникова.—Верея, 2009. — С. 191-193.
Зонтиков, Д.Н. Генетический и морфофизиологический полиморфизм овощных культур и использование его в селекции на устойчивость к стрессам /А.В.Поляков, О.Ф. Чикризова, Д.Н. Зонтиков, С.А. Зонтикова, Н.Н. Давыдова, К. Рабей //Сб. науч. трудов V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», часть 1 (Москва, 16-20 марта 2009 г.). — М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2009. — С. 258-259.
Зонтиков, Д.Н. Влияние температурного стресса и кислотности среды на эмбриоидогенез капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре микроспор /Д.Н. Зонтиков //Сб. науч. трудов IX Молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 8 апреля 2009 г.). — М.: ГНУ ВНИИСБ, 2009: — С. 13-14.
Зонтиков, Д.Н. Температурный стресс повышает выход эмбриои-дов капусты белокочанной в культуре микроспор /А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков //Картофель и овощи. — 2009. — №7. — С. 25.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы, содержащего 124 наименование, в том числе 67 иностранных авторов.
Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 таблицами, 16 рисунками.
