Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1. Значение и биологические особенности моркови (Daucus сагоtaL.) 13
1.2.Достижения и перспективы использования методов in vitro в селекции растений 15
1.3. Получение гаплоидов растений методами биотехнологии и их практическое значение 17
1.4. Преимущества использования гаплоидов и удвоенных гаплоидов в селекционной работе 22
1.5. Идентификация гаплоидов 25
1.6. Распространение полиэмбрионии (многозародышевости) 25
1.7. Апомиксис 27
1.7.1. Факторы, влияющие на процесс получения удвоенных гаплоидов методом гаплопродюсера 31
1.7.2. Культура зародышей (эмбриокультура) 33
1.8. Метод андрогенеза 34
1.8.1. Культура микроспор 36
1.8.2. Основные факторы, влияющие на процесс андрогенеза в культуре in vitro 37
1.9. Культура завязей и семяпочек 47
ГЛАВА 2. Условия проведения исследований, исходный материал, схема и методики опытов 50
2.1. Цель, задачи исследований 50
2.2. Схема исследований 50
2.3. Условия проведения исследований 54
2.3.1. Почвенные и агроклиматические условия проведения исследований 54
2.3.2. Погодные условия вегетационных периодов 2002-2007 гг. 56
2.4. Материал и методика проведения исследований 62
2.4.1. Исходный материал 62
2.4.2. Методики лабораторных опытов 66
ГЛАВА 3. Эффективность методов получения удвоенных гаплоидов моркови (Daист carota L.) 71
3.1. Идентификация гаплоидов моркови 71
3.2. Получение гаплоидов моркови из полиэмбриональных семян. 75
3.3. Получение семян моркови при индуцированном апомиксисе 80
3.4. Использование эмбриокультуры для получения апомиктов моркови 90
3.5. Получение растений-регенерантов моркови в культуре пыльников 98
3.5.1. Предообработка донорных растений моркови биологически активными веществами и регуляторами роста для повышения эффективности культуры пыльников 98
3.5.2. Уточнение режима стерилизации бутонов моркови для введения в культуру in vitro 100
3 5 3 Сортоспецифицность андрогенеза 103
3.5.4. Питательная среда как индуктор новообразований в культуре пыльников 104
3.5.5. Воздействие положительной пониженной температуры на мор-фогенетическую активность моркови в культуре пыльников 107
3.5.6 Укоренение побегов моркови полученных в культуре пыльников 109
3.5.7. Адаптация растении-регенерантов 110
3.6. Получение растении-регенерантов полученных в культуре семя почек 114
3.6.1. Предобработка донорных растений биологически активными веществами и регуляторами роста для повышнния эффективности культуры семяпочек 114
3.6.2. Сортоспецифичность гиногенеза 116
3.6.3. Питательная среда как индуктор новообразований в культуре семяпочек 116
3.6.4 Влияние положительной пониженной температуры на морфогенетическую активность моркови в культуре семяпочек 119
3.6.5. Укоренение побегов моркови, полученных в культуре семяпочек 120
3.6.6. Адаптация растении-регенерантов 122
3.7. Цитологический анализ растении-регенерантов 124
3.8. Эффективность методов получения гаплоидов и удвоенных гаплоидов моркови 125
3.9. Характеристика растении-регенерантов моркови и апомиктов полученных различными способами 125
Заключение 131
Выводы 133
Предложения для использования в
Селекционной практике 136
Список использованной литературы 137
Приложения 161
- Получение гаплоидов растений методами биотехнологии и их практическое значение
- Основные факторы, влияющие на процесс андрогенеза в культуре in vitro
- Погодные условия вегетационных периодов 2002-2007 гг.
- Получение семян моркови при индуцированном апомиксисе
Введение к работе
В настоящие время, по-прежнему, одной из важнейших задач селекции является сокращение сроков создания новых сортов и гибридов сельскохозяйственных культур. Современный уровень и темпы развития сельскохозяйственного производства диктуют поиск новых путей, применение новых технологий, усовершенствование существующих технологий. Одним из таких современных направлений является, применение методов биотехнологии, которые позволяют сократить сроки создания сортов и гибридов, новых устойчивых форм, оздоравливать растительный материал от вирусов.
Морковь (Daucus carota L., var. Sativus Hojfnm ) является главной овощной культурой. Её выращивают во всех частях света на площади 584000 га. Наибольшие посевные площади сосредоточены в Азии (28%), особенно в Китае и Японии, и Европе (134000 га) (в основном в Польше, во Франции и в Великобритании) (Круг Г., 2000).
Особая ценность моркови состоит в том, что её корнеплод, имеющий оранжевую окраску, содержит в себе каротин (провитамин А), калий, кальций, железо, фосфор и другие полезные минеральные элементы (Ткжавин Г.Б., 2007).
Увеличение видов потребления моркови повлияло на рост количества сортов и гибридов. Открытие признака ЦМС и введение его во многие селекционные программы, в первую очередь США, Германии, Нидерландов, Великобритании, Польши, Франции и России. Массовое создание гибридов F| моркови явилось соответствующим ответом селекционеров на требование
Объект исследований — методы получения гаплоидов иудвоенных гаплоидов моркови, метод культуры пыльников (андрогенез), семяпочек (гино-генез), индуцированого апомиксиса, эмбриокультура, полиэмбриония.
Предмет исследований — пыльники, семяпочки, зародыши, семена линий, сортов и гибридов F] моркови столовой (Daucus carota L.).
Научная новизна работы. Научная новизна работы. В результате проведенных исследований усовершенствованы элементы технологии получения регенерантов из репродуктивных органов для создания удвоенных гаплоидов моркови.
Показано, что у гаплоидов число замыкающих клеток устьиц в поле зрения микроскопа при увеличении 15x40 составляет 14-16 шт., у диплоидов- 9-12 шт., число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц у гаплоидов - 6-9 шт., у диплоидов- 12-14 шт.
Впервые показано, что частота появления полиэмбриональных семян у моркови зависит от сортообразца и колеблется от 0 до 0,25%, а частота появления близнецовых гаплоидовот 0 до 0,05%.
Опыление цветков моркови, характеризующихся петалоидным типом стерильности, пыльцой сельдерея сорта Белоснежный и петрушки сорта Алба на фоне обработки растений <я-НУК в концентрации 0,075 г/л и гиббереллина в концентрации 0,025 г/л приводит к образованиию апомиктичных семян, всхожесть которых варьирует от 9% до 21%, что позволяет получить до 0,15% жизнеспособных апомиктичных растений.
Показано, что культивирование апомиктичных зародышей hi vitro позволяет получить жизнеспособные растения, которые составляют от 0,5% до 2,3% от числа культивируемых зародышей.
Культивирование семяпочек на среде MSm, включающей полный состав питательных веществ и 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, позволяет получить от 1,6%'до 6,7%) эмбриогенных образований.
Объект исследований — методы получения гаплоидов иудвоенных гаплоидов моркови, метод культуры пыльников (андрогенез), семяпочек (гино-генез), индуцированого апомиксиса, эмбриокультура, полиэмбриония.
Предмет исследований — пыльники, семяпочки, зародыши, семена линий, сортов и гибридов F] моркови столовой (Daucus carota L.).
Научная новизна работы. Научная новизна работы. В результате проведенных исследований усовершенствованы элементы технологии получения регенерантов из репродуктивных органов для создания удвоенных гаплоидов моркови.
Показано, что у гаплоидов число замыкающих клеток устьиц в поле зрения микроскопа при увеличении 15x40 составляет 14-16 шт., у диплоидов- 9-12 шт., число хлоропластов в замыкающих клетках устьиц у гаплоидов - 6-9 шт., у диплоидов- 12-14 шт.
Впервые показано, что частота появления полиэмбриональных семян у моркови зависит от сортообразца и колеблется от 0 до 0,25%, а частота появления близнецовых гаплоидовот 0 до 0,05%.
Опыление цветков моркови, характеризующихся петалоидным типом стерильности, пыльцой сельдерея сорта Белоснежный и петрушки сорта Алба на фоне обработки растений <я-НУК в концентрации 0,075 г/л и гиббереллина в концентрации 0,025 г/л приводит к образованиию апомиктичных семян, всхожесть которых варьирует от 9% до 21%, что позволяет получить до 0,15% жизнеспособных апомиктичных растений.
Показано, что культивирование апомиктичных зародышей hi vitro позволяет получить жизнеспособные растения, которые составляют от 0,5% до 2,3% от числа культивируемых зародышей.
Культивирование семяпочек на среде MSm, включающей полный состав питательных веществ и 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, позволяет получить от 1,6%'до 6,7%) эмбриогенных образований.
Практическая ценность исследований. Проведено сравнение эффективности способов получения регенерантов для создания удвоенных гаплоидов моркови: андрогенез, гиногенез, эмбриокультура. Определены условия культивирования от введения эксплантов in vitro до укоренения побегов и адаптации растений-регенерантов к условиям in vivo.
Установлена частота образования близнецовых гаплоидов моркови, которая составляет от 0 до 0,05%. Выявлено, что линия 8В характеризуется высокой андрогенной, сорт Manufuruji long - гиногенной способностью, у которых частота образования эмбриоидов соответственно составляет 18,9% и 43,5%. Установлено, что использование среды MS, содержащей половинную дозу макро- и микроэлементов, ИМК в концентрации 0,5 мг/л, сахарозу - 10 г/л и агар - 7 г/л в зависимости от типа экспланта позволяет укоренить от 79,8% до 77,5% побегов.
Работа выполнена в отделе биотехнологии ГНУ Всероссийского научно - исследовательского института овощеводства в 2002 - 2009 гг. под руководством доктора биологических наук, профессора Полякова А.В.
Обоснование и достоверность научных положений. Исследования выполнены по методикам, рекомендованным научными учреждениями страны. Все выводы и предложения подтверждены экспериментальными исследованиями, статистической обработкой полученных данных.
Апробация работы. Основные результаты экспериментальной работы по диссертации, выводы и предложения были доложены или представлены на Международной научно-практической конференции «Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке» (Москва, 2003 г.), Международной научно - практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур» (Москва, 2004 г.), III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005 г.), III Российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций
с нетрадиционными природными ресурсами и создание функциональных продуктов» (Москва, 2005 г.), а также на заседаниях методической комиссии селекции, семеноводству и биотехнологии ГНУ ВНИИО Россельхозакадемии (2002-2009 гг.)
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
полиэмбриония у моркови как источник получения гаплоидов;
уточнённые условия получения апомиктичных семян;
оптимизированные условия получения апомиктичных растений моркови в эмбриокультуре;
уточнённые условия культуры пыльников моркови;
уточнённые условия культуры семяпочек моркови.
Публикации результатов исследований
По результатам исследований по теме диссертации опубликовано 6 работ, в т.ч. одна в журнале «Картофель и овощи», рекомендованном ВАК РФ.
Ильченко О.В. Оценка генотипов моркови различного географического происхождения на устойчивость к фузариозу и альтернариозу в условиях искусственного инфекционного фона / Т.Н. Лебедева, Н.В. Ипатова, А.В. Поляков, О.В. Ильченко/УМатериалы Всероссийского совещания: «Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии», 16-18 июля 2003 г. М: ВНИИФ, 2003.- С. 61 - 63.
Ильченко О.В. Андро- и гиногенез моркови (Daucus carota L.) /А.В. Поляков, О.В. Ильченко // Международная научно-практическая конференция «Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке», Москва, 2003. - С. 420-422.
IlchenkoO.V. Andro- andgynogenesis of carrol (Daucus carota L.) / A.V. Poliakov, O.V. Ilchenko// «International scientific - practical conference «Perspective directions in breeding and seed production of agricultural plants in XXI centure» Moscow, 2003. - P. 420-422.
3.Ilchenko O.V. Production of andro- and gynogenic plants of carrot (Dau-cuscarota L.) I A.V. Poliakov, O.V. Ilchenko //Proceedings of International Scientific Practical Conference "Biotechnology of vegetable, flower and not widely spread crops" (March, 22 - 25, 2004). - Moscow: Institute of Vegetable crops, 2004.-P. 146-150.
4. Ильченко O.B. Получение регенерантов сельдерейных (Apiaceae), тыквенных (Cucurbitaceae), капустных (Brassicaceae) и ряда цветочных культур in vitro I А.В. Поляков, И.И. Тарасенков, О.И. Федоришина, А.А. Ткачева, Н.Н., О.В. Ильченко, Ананьина, Н.Н. Лебедева, М.И. Иванова, Т.В. Ларионова, И.Н. Боровикова //III Московскиймеждународный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития". - Москва (14 - 18 марта 2005 г.), 2005. - С. 286-287.
Ilchenko O.V. Obtaining regenerants of Apiaceae, Cucurbitaceae, Brassicaceae and some flower crops in vitro I A.V. Poliakov, I.I. Tarasenkov, O.I. Fedori-shyna, A.A. Tkacheva, O.V. Ilchenko, N.N. Ananina, N.N. Lebedeva, M.I. Ivano-va, T.V. Larionova, I.N. Borovikova //III Moscow International Congress "Biotechnology: state of the art and prospects of development".- Moscow (March, 14 -18, 2005), 2005.-P. 286-287.
5.Ильченко O.B. Распространение полиэмбрионии у моркови (Daucus carota L.) I А.В. Поляков, Т.Э. Клыгина, O.B. Ильченко //III Российская научно-практическая конференция "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов". -Москва: РАЕН, (6-7 июня 2005 г.), 2005.- С. 40 - 41.
6.Ильченко О.В. Получение апомиктичных семян моркови. /О.В. Ильченко //Картофель и овощи. - 2007. - №6. - С.31.
Структура и объем работы
Диссертационная работа состоит из введения, 3 глав, выводов, заключения, предложений для использования в селекционной практике, списка использованной литературы содержащего 181 наименований, в том числе 91 иностранных авторов, и 90 отечественных авторов. Она изложена на 165
страницах машинописного текста, содержит 37 таблицы, иллюстрирована 23 рисунками и 5 приложениями.
Получение гаплоидов растений методами биотехнологии и их практическое значение
Гаплоидия - это процесс, проводящий к получению растений с уменьшенным вдвое числом хромосом, т.е. у гаплоидов в хромосомном наборе представлена только одна (п) из гомологичных хромосом (Лутова Л.А., 2003).
Известно, что метод гаплоидии позволяет преодолеть ряд селекционных трудностей. Поскольку гаплоиды имеют лишь один набор хромосом, то проявление и обнаружение рецессивных генов значительно упрощается. Гаплоидные растения стерильны, но при обработке их колхицином или другими веществами, вызывающими удвоение числа хромосом, образуются полноценные семена, способные дать начало диплоидным фертильным растениям с двумя наборами идентичных хромосом. На основе гаплоидов гомозиготные линии могут быть получены за 2 - 3 года (Дворядкина А.Г., 1972).
История гаплоидии высших растений насчитывает более 80 лет. Обычно отсчет ведется с 1921 года, когда впервые было выявлено и цитологически определено гаплоидное растение у Datura stramonium (Blakeslee A.F., et al., 1922). Первые экспериментальные гаплоиды были получены в результате отдаленной гибридизации у Nicotiana tabacum (Clausen R.E., Mann M.C., 1924; Kostoff D., 1929), паслена черного (Jorgensen С.A., 1928). К настоящему времени гаплоиды получены более чем у 200 видов (включая гибридные формы) и число их растет, в основном, за счет получаемых в культуре in vitro (Тыр нов B.C., 1998).
Методам биотехнологии растений, связанными с получение гаплоидов и/или удвоенных гаплоидов в системах in vitro уделяется особое внимание. Эти вопросы освещены в ряде монографий и обзоров как зарубежных (Vasil I.K., Nitsch С, 1975; Vasil I.K, 1980; Лейке Г. и др., 1980; Ницше В., Венцель Г., 1980; Collins G.B., Genovesi A.D., 1982; Bajaj Y.P.S., 1983; Heberle - Bors E., 1985; Дапвелл Д.М., 1989; Szarejko I., et al., 1991; Атанасов А.И., 1993; Keller J., Korzun L., 1996), так и отечественных (Левенко В.А., 1978; Калинин Ф.А., и др., 1980; Шамина З.Б., 1981; Юркова Г.Н., Левенко В.А., 1981; Резникова С.А., 1984; Бугара A.M., Русина Л.В., 1988; Муромцев Г.С., и др., 1990; Тырнов B.C., 1998; Бутенко Р.Г., 1999) авторов.
Гаплоиды могут различаться по своим генетическим и цитологическим особенностям. Поэтому неоднократно делались попытки разработать классификацию гаплоидов (Katayama V., 1935; Kimber G., Riley R., 1963; Fossard R.A., 1974; Хохлов С.С, и др., 1970, 1976). С учетом новых данных в настоящее время гаплоиды разделяют на следующие основные типы (Тырнов B.C., 1998): 1. Матроклинные - развившиеся из клеток женской половой сферы (зародышевого мешка) и имеющие ядро и цитоплазму от одной особи; 2. Андрогенные - развивающиеся из клеток женской половой сферы, у которых собственные хромосомы замещены хромосомами спермия и, следовательно, имеющие цитоплазму от одной особи, а ядро от другой. (К андро-генным относятся гаплоиды, возникшие в результате элиминации хромосом материнского родителя при делении клеток гибридного проэмбрио и на более поздних стадиях развития); 3. Андроклинные - развивающиеся из пыльцевых зерен. Зі от тип получают в культуре пыльников или изолированных микроспор. Это явление в настоящее-время чаще всего определяют как «андрогенез in vitro». Каждый тип разделяется на две подгруппы: моноплоиды и полигап лоиды. Первые происходят от диплоидов, вторые - от полиплоидов. Полигаплоиды в свою очередь подразделяются на автополигаплоиды и аллополига-плоиды в зависимости от геномной структуры исходного полиплоида. Иногда гаплоиды имеют отклонения в числах хромосом (на 1-2 хромосомы больше или меньше). По аналогии с анеуплоидами их предложено называть анеугаплоидами (Тырнов B.C., 1998). Говорить о практическом использовании какого-либо явления можно лишь в том случае, если оно встречается с достаточной для этой цели частотой. Спонтанная матроклинная гаплоидия крайне редка (0,1-0,01 %). Андро-генные гаплоиды встречаются еще реже (тысячные доли процентов). К настоящему времени разработан ряд методов, позволяющих получить гаплоиды с частотой, достаточной для решения прикладных задач. Используемые методы основаны на следующих принципах (Тырнов B.C., 1998): 1. Создание линий, у которых гаплоидия определяется ядерными или цитоплазматическими детерминантами материнского родителя. Частота гап-лоидии при этом варьирует от нескольких процентов до 100 и даже выше (за счет близнецов типа п—п, п-2п, п-п-п, п-2п-п и др.); 2. Использование линий - гаплоиндукторов. Гаплоиндуцирующая способность основана на том, что спермии некоторых линий не способны проникать в яйцеклетки или генеративная клетка не делится и вместо 2 спермиев остается одно ядро (клетка). В результате при опылении такими линиями нормальных материнских форм вместо двойного оплодотворения осуществляется одинарное - яйцеклетки или центральной клетки. Первый случай легален, так как эндосперм не развивается, и часть неоплодотворенных яйцеклеток дает гаплоидные зародыши. Частота гаплоидии может достигать при этом нескольких десятков процентов; 3. Экспериментальное получение «односпермиевой» пыльцы, опыление которой, как и в предыдущем случае, ведет к одинарному оплодотворению с возникновением гаплоидов. «Односпермиевую» пыльцу получают при облучении ионизирующей радиацией, воздействии колхицином и другими полиплоидизирующими веществами; 4. Получение гаплоидов в культуре in vitro пыльников и неоплодотво-ренных завязей и семяпочек; 5. Использование так называемых гаплопродюссеров и культуры in vitro молодых зародышей. Метод основан на скрещивании разных видов. После деления зиготы в клетках проэмбрио идет элиминация хромосом до одного генома одного из видов. Вычлененные зародыши доращиваются in vitro. Метод широко используется для получения гаплоидов ячменя и пшеницы; 6. Использование полиэмбрионии. При проращивании семян выявляют те, которые дают несколько близнецовых проростков (двоен, троен и др.). Среди близнецов нередко встречаются гаплоиды.
Явление гаплоидии в последние время привлекает всё большее внимание селекционеров. Использование гаплоидных растений позволяет решать целый ряд как теоретических, так и практических задач. Гаплоидия у высших растений помогает в изучении их генетики и эволюции. С её помощью можно определять геномный состав видов и уточнять их таксономическое положение, исследовать влияние дозы геномов в полиплоидных рядах, выяснить происхождение и генетические причины апомиксиса и решать другие проблемы. На этом явлении основаны методы получения из гаплоидов гомозиготных диплоидных линий, а также наиболее удачных рекомбинаций генов при комбинационной селекции. Впервые на перспективность применения гаплоидов для решения селекционных задач указал в 1929 г. Г.Д. Карпеченко (Гужов Ю.Л., Фукс А., Валичек П., 2003).
Основные факторы, влияющие на процесс андрогенеза в культуре in vitro
Проанализировав литературные источники в качестве общих рекомендаций по выбору растительного материала для использования в культуре in vitro можно принять следующие: использовать выращенные в поле растения-доноры лучше, чем выращенные в тепличных условиях, образовавшиеся в начале цветения, предпочтительнее образовавшихся позже. Нормальные условия освещения, питания и водного режима растения - донора также способствуют получению хороших результатов.
Основные факторы, от которых зависит процесс андрогенеза в культуре in vitro.
Значение генотипа. Первый шаг в использовании культуры микроспор и пыльников - это выбор отзывчивого к индукции андрогенеза генотипа. Различия были выявлены между видами и между генотипами одного вида, особенно в случае зерновых культур. Некоторые виды семейств Solanaceae и Brassicaceae имеют самую высокую способность к андрогенезу в культуре in vitro, тогда как у Роасеасе она несколько слабее, а у Fabaceace сильно ограничена. Существенная разница наблюдается также между отдельными линиями и сортами. Дигаплоиды характеризуются более высокой частотой андрогенеза по сравнению с исходными (донорными) растениями. Способность к андрогенезу наследуется при скрещивании (Лутова Л.А., 2003).
Большое количество исследований было проведено на экономически важных видах; и выделены отзывчивые к индукции гаплоидного эмбриогенеза генотипы, но только маленькая доля исследованных генотипов оказалась удобной для культуры пыльников и микроспор. У кукурузы, из проверенных генотипов, только 5 были способны формировать андрогенные эмбриои-ды. Следует отметить, что зависимость каллусогенного и эмбриогенного потенциала пыльников от генотипа установлена у многих культур: пшеницы (Buyser J., Henry Y., 1985; Henry Y., 1990; Lazar M.D., et al, 1984; Дьячук П.А. и др., 1986; Базько Л.В., 1988; Fadel F., Wenzel G., 1990), риса (Song H.G., et al., 1976; Харченко П.Н., Кучеренко Л.A., 1977), хлопчатника (Шамина З.Б., Тураев A.M., 1986; Шамина З.Б. и др., 1986) картофеля (Mix G., 1982;; Мару-ненко И.М. и др., 1988, 1990), томата (Zagorska N. et al, 1982), капусты белокочанной (Roulund N. et al., 1991), шалфея мускатного (Бугара A.M. и др., 1988).
Отмечено также, что регенерация растений в культуре пыльников злаков осуществляется значительно легче из материала гибридного происхождения, чем из сортов и константных линий (Богуспаев К.К., Анапияев Б.Б., Батыргожин Б.А., Рахимбаев И.Р.,1991; Sesek S., Dencic S., 1996; Жамбакин К.Ж., 2002). Выявлено превосходство признаков эмбриогенеза и регенерации зеленых растений поколения F2 по сравнению с Fi (Bedo Z., Karsal 1., Gy V., Lang L., 1992). Однако получение гаплоидов из гибридных комбинаций в большой степени зависит от андрогенетической способности исходных родительских форм, т.к. способность к андрогенезу - наследственное свойство (Moieni A., Sarrafi А., 1996). При подборе питательной среды важно учитывать, что индукция морфогенеза тесным образом связана с фактором взаимодействия генотип - питательная среда. Поэтому в каждом конкретном случае желательно эмпирически подбирать питательные среды к конкретному используемому генотипу (Лукьянюк С.Ф., Сулима Ю.Г., Игнатова С.А., 1979).
Вместе с тем отмечено высокое значение случайной вариабельности. В некоторых случаях этот показатель превышает степень влияния генотипа и питательной среды. Более того, здесь следует также отметить, что достоверная разница в отзывчивости на индукцию андрогенеза наблюдается и среди растений внутри сорта. Такое положение выявлено на пшенице (Picard Е., Rode A.., Doussinaul G., Rousset М., Rives М.,1990), кукурузе и других куль турах (Ockendon D.J.. Sutherland R.A., 1987). Это различие нельзя объяснить только генетическим разнообразием внутри сорта. Более того, отмечено различие в андрогенезе среди колосьев одного растения, показано, что главный колос наиболее продуктивен (Buyser J., 1979). Цветки, расположенные у ба-зальной части колоса, производят в два раза больше эмбриоидов, чем расположенные у вершины (Picard Е., de Buyser J., 1975а). В некоторых работах обнаружено между пыльниками одного цветка (Henry Y ., J. de Buyser, 1990).
Физиологическое состояние исходного (донорного) растения и экс-планта. Список физиологических факторов, которые влияют на пыльцу в культуре пыльников или микроспор включает в себя такие особенности как, условия роста и развития растений - доноров, стадию развития микроспор, предшествующую культивированию in vitro, предобработку пыльников, состав питательной среды, источник углеводов, гормонов, температуру индукции, твердую или жидкую среды, фотопериод.
Донорные растения, используемые для получения пыльников и пыльцы, необходимо выращивать в контролируемых условиях при определённых режимах температуры, освещения, влажности и минерального питания. Изучение этого вопроса, представляет определённый интерес, поскольку исследования, проведенные на моркови Г.Б. Тюкавиным и Н.А. Шмыковой (2000) позволяют полагать, что влияние условий выращивания донорных растений на процесс формирования морфогенной каллусной ткани довольно существенное. Для каждого вида, сорта или гибрида следует подбирать свои режимы выращивания. Выращивание донорных растений при пониженной температуре воздуха (14С - днем; 8С - ночью) позволило повысить выход гаплоидов в культуре пыльников льна масличного (Nichterlein К., Umbach Н., Friedt W., 1991). Положительный эффект оказывает повышение интенсивности освещения, выдерживание донорных растений в условиях пониженных температур (2-5 С), а также минеральная подкормка за несколько дней перед изолированием пыльников (Лутова Л.А., 2000). Повышение андрогенетиче ских способностей у злаков отмечается под воздействием химических и физических факторов (Рахимбаев И.Р. и др., 1992).
Наблюдения Г.Б. Тюкавина и Н.А. Шмыковой показали, что пыльники растений, обработанных раствором актеллика, обладают повышенной способностью к образованию эмбриоидов. Экспериментальные данные, полученные при обработке раствором актеллика срезанных соцветии, подтвердили эти результаты. Под его воздействием происходило увеличение доли морфогенетической компетентной пыльцы (микроспор поделившихся на две равные клетки), и одновременно отмечалось увеличение числа стерильных пыльцевых зёрен. Этот эксперимент указывает на необходимость цитологического контроля при использовании инсектицидов и других биологически активных веществ в период бутонизации донорного растения.
Погодные условия вегетационных периодов 2002-2007 гг.
Исследования проводили в отделе биотехнологии в ГНУ ВНИИО Рое-сельхозакадемии в 2002-2009 гг. Донорные растения моркови выращивали в открытом фунте на территории, прилегающей к ГНУ ВНИИО (д. Верея, Ра-менский район, Московской области). Московская область входит в состав Нечерноземной зоны Европейской части Росси и расположена в Центральной части Русской равнины. Климат области характеризуется умеренно теплым летом и сравнительно холодной зимой. Самый холодным месяцем является январь, среднемесячная темпера тура которого составляет — 10 - 11 С. Самый теплый месяц - июль, когда среднемесячная температура достигает + 17... + 18 С. Среднегодовое количество осадков на территории колеблется от 450 до 600 мм, средняя относительная влажность воздуха составляет 70 %. На территории Московской области преобладают подзолистые, дерново-подзолистые, серые лесные и черноземные почвы. В зависимости от термических ресурсов вегетационного периода и степени обеспечения его влагой территория области делится на три агроклиматических района: менее теплый, теплый и более теплый. Раменский район входит в теплый агроклиматический район, который характеризуется суммой активных температур (более + 10 С) 1900 - 1950 С. Продолжительность безморозного периода в воздухе - 136 суток, на почве ПО суток. Период с температурой более + 15 С составляет 60...65 суток. Переход среднесуточных температур воздуха: через + 15 С - 10 июня и 20 августа; через + 10 С - 5 мая и 15 сентября и через + 5 С - 20 апреля и 10 октября. Дата полного оттаивания почвы: ранняя - 25 апреля, средняя - 30 апреля и поздняя - 5 мая. Запас воды в снежном покрове к началу снеготаяния - 100 - 130 мм. Осадки за год составляют 600 мм, за теплый период (апрель - октябрь) - 400 мм. Показатель влагообеспечения (апрель - август) - 0,9 (Справочник по климату СССР, 1964). Грунтовые воды за период вегетации довольно значительно изменяют свой уровень (от 55-60 см в начале вегетационного периода до 150-160 см в конце) (Ермаков, 1972). Почва аллювиальная, луговая, среднесуглинистая, хорошо окультуренная, с мощным гумусовым горизонтом (содержание гумуса в слое 0-20 см составляет 3,41 - 3,44%; в слое 20-40 см - 2,91-3,02%) и нейтральной реакцией среды (рН солевой вытяжки - 6,87), высоким содержанием суммы поглощенных оснований (47-50 мг-экв. на 100 г почвы в слое 0-20 см). Гидролитическая кислотность 0,72-0,92 мг-экв. на 100 г почвы. Степень обеспеченности питательными веществами: фосфором - хорошая (содержание Р2Оз в слое 0-20 см - 21,78 - 23,62 мг на 100 г почвы по Чирикову); калием - низкое (содержание К20 в слое 0-20 см - 11,38 - 17.88 мг на 100 г почвы по Масловой). Удельный вес почв пахотного слоя 0-25 см — 2,61 г/см . Капиллярная влаго-емкость 43-44%. Гигроскопическая влажность - 8,25%. 2002 г. Среднесуточная температура воздуха в среднем за вегетацию в 2002 г. составила + 16,5 С, что на 2,5 С выше нормы (рис. 1 а, прил. Б). Сле дует отметить, что температура воздуха за все месяцы вегетации была выше среднемноголетних значений. Наибольшие отклонение среднесуточной тем пературы по сравнению со среднемноголетними данными, наблюдалось в июле месяце и составило - 5,3 С выше нормы. Сумма выпавших осадков за весь вегетационный период составила всего 268,1 мм, что меньше среднемноголетнего значения на 98 мм. В мае сумма выпавших осадков составила всего 5,8 мм, что было меньше среднемноголетних значений на 44,2 мм. Самыми засушливыми месяцами были июль и август. Осадков выпало за этот период 43,5 мм, что меньше среднемноголетних значений за эти месяцы на 106,5 мм. В сентябре и октябре выпало наибольшие количество осадков и превысило среднемноголетний показатель на 63,8 мм (рис.1 а). В целом анализируя данные можно сделать выводы о том, что 2002 г. был засушливым. Среднесуточные температуры воздуха превышали средне-многолетние данные, а количество выпавших осадков за вегетационный период было ниже среднемноголетних данных и составило 98 мм. 2003 г. Среднесуточная температура воздуха в среднем за вегетацию не особо отличалась от среднемноголетней. Только лишь в мае и июле средне суточная температура превышала среднемноголетний показатель на 4,8 С0 и 4,2 С соответственно. Наибольшие количество выпавших осадков было в августе и сентябре и составило 85,0 мм и 87,5 мм, что на 15,0 мм и 32,5 мм превышает среднемноголетний показатель. В остальные месяцы вегетационного периода количество выпавших осадков было меньше по сравнению со среднемноголетними показателями.
Получение семян моркови при индуцированном апомиксисе
Использование эмбриокультуры для получении регенерантов моркови на искусственной питательной среде, может быть альтернативным способом сохранения маложизнеспособных, абортивных зародышей, которые появляются при отдаленной гибридизации, самонесовместимости и апомиксисе (Ильенко И.И., Белоус В.Е., 1987; Лукьянюк С.Ф., 1983; Селиванов А.С, 1983).
В результате проведенных опытов по культивированию незрелых недоразвитых семян и зародышей тыквы, полученных от межвидовых скрещиваний С. maxima х С. moschata в условиях in vitro, получены растения - регенераты (Ситникова О.И., 2008). При проведении исследований во ВНИИССОКе, культивирование апо-миктичных зародышей моркови было получено 30 линий, две из которых были выделены в качестве перспективных форм для дальнейшей работы (Тюкавин Г.Б., 2007; Тюкавин Г.Б., Тимин Н.И., Валеева З.Т., Буракова И.А., 1988). Как известно, успешное культивирование апомиктичных зародышей зависит от стадии развития зародышей и степени их дифференцировки на момент изоляции (Поляков А.В., 2000). В своих исследованиях А.В. Поляков (2000) отмечал, что культивирование 8-ми суточных зародышей льна было не целесообразно. Наиболее эффективным было извлечение апомиктичных зародышей на глобулярной и начальной сердечковидной стадих из 10-ти суточных семян, гак как в этом случае формировалось большее число жизнеспособных эксплантов и большее число почек. При опылении стерильных линий моркови пыльцой сельдерея вероятность того, что оплодотворение прошло успешно, очень мало. В наших опытах полученные семена часто были невсхожими. Увеличить процент выхода апомиктичных растений можно с помощью эмбриокультуры. Для изучения эффективности эмбриокультуры моркови в культуру in vitro вводили 10, 20, 30, 40, 50 суточные апомиктичные зародыши, полученные от опыления стерильных линий моркови 1238 П и Г-67 пыльцой сельдерея сорта Белоснежный . Проведенные нами исследования показали, что при культивировании на питательной среде MSm, содержащей 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л, 10 суточные зародыши не прорастали, а их жизнеспособность сохранялась в течение 3-х - 4-х недель. Количество жизнеспособных апомиктичных зародышей в зависимости от линии составило от 18,0%) до 19,2%) (табл. 11). Зародыши, изолированные в возрасте 20 - ти - 30 суток также не прорастали, но количество жизнеспособных апомиктичных завязей увеличивалось. У 20 - ти суточных их доля составляла от 30,4%о до 31,2%, а у 30 - ти суточных - около 33,3%о (табл. 11). Жизнеспособность 20 - ти и 30 - ти суточных зародышей сохранялась в течение 5 - ти недель. У 40 и 50 суточных апомиктичных зародышей моркови жизнеспособность была на уровне 30,0 - 35,7%о, а у 50 - ти суточных от 31,3% до 43,3%. Прорастание 40 суточных зародышей линии 1238 П составило 3,3%. а 50 - ти суточных - 6,7%) (табл. 11). У линии Г-67 прорастание апомиктичных зародышей отмечено только в возрасте 50 суток и составило 3,1% Ряд авторов отмечает, что успех культивирования in vitro недоразвитых незрелых зародышей во многом зависит от состава питательной среды (Тю-кавин Г.Б., 1993; Бурдасов В.М., 1979; Щеглов Н.И., 1979; Яковлев СП., Кожин А.В., Луткова Е.Н. и др., 1979). В своей работе мы использовали среды, широко применяемые для культуры незрелых зародышей: MSm (Masuda К., Kikuta Y., 1981), Norstog (Norstog К., 1973). Monnier (Monnier M., 1978) и Gamborg B5 (Gamborg O.L., 1984). При культивировании апомиктичных зародышей моркови на различных питательных средах в наших опытах наибольший процент пролифери-рующих эксплантов отмечен на среде MSm. Так, у линий 1238 П и Г - 67 он был равен 26,3% и 30,6% соответственно, а у линии 1585 П - 35,0% (табл. 12). В зависимости от линии влияние питательной среды было различно. Так, у линии 1238 П морфогенетическая активность апомиктичных зародышей на среде Monnier была на 6,3% меньше, чем на MSm. На среде Gamborg В5 она была на уровне 11,9%. У линии Г - 67 морфогенетическая активность на средах Norstog, Monnier, и Gamborg не сильно различалась и составила 23,8%; 22,2%о и 25,0 соответственно. При культивировании апомиктичных зародышей моркови в культуре in vitro немаловажное значение имеет подбор регуляторов роста. В своей работе мы изучали влияние 2,4-Д, в концентрации: 0,2 мг/л, 0,5 мг/л, 1,0 мг/л; 2 ip - 0,5 мг/л, 1,0 мг/л, 2,0 мг/л и тидиазурона - 0,5 мг/л, 1,0 мг/л. Проведенные исследования показали что наибольшее количество про-лиферирующих апомиктичных завязей (11,6%) и (15,2%) на линии 1238 П было получено в вариантах при использовании 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л и 2ір в концентрации 2,0 мг/л (табл. 13). При использовании тидиазурона в концентрациях 0,5 мг/л и 1,0 мг/л доля растущих зародышей составляла от 7,1% до 9,5%, соответственно. У линии Г - 67 наибольшее количество растущих апомиктичных завязей - 19,2%, так же отмечено при использовании 2,4-Д в концентрации 0,2 мг/л что на 3,3% и 1,9% больше, чем при использовании 2 ір в концентрации 1,0 мг/л и тидиазурона 1,0 мг/л, соответственно.
