Содержание к диссертации
Введение
2. Болезни картофеля и достижения генной инженеррїи в борьбе с ними
2.1. Фитофтороз 10
2.2. Альтернариоз 12
2.3. Ризоктониоз 14
2.4. Рак картофеля 15
2.5. Сухая фузариозная гниль 16
2.6. Обыкновенная парша 17
3. Роль антимикробных белков дефензинов в защите растений от фитопатогенов 19
3.1. Общее строение дефензинов 19
3.2. Экспрессия дефензинов в органах растений 22
3.3. Антимикробная активность дефензинов «. 23
3.4. Получение трансгенных растений с генами дефензинов и их устойчивость к болезням 25
4. Перенос генов в растительный геном с помощью агробактериальной трансформации . 28
5. Материалы и методы 31
5.1. Объекты исследований 31
5.1.1. Растительный материал 31
5.1.2. Векторная конструкция и агробактериальные штаммы 32
5.1.3. Штаммы фитопатогенов
5.2. Место проведения и схема полевого и вегетационного опытов 34
5.3. Метеорологические условия 2002-2003 гг 35
5.4. Микроклональное размножение картофеля в условиях in vitro 36
5.5. Методика выделения ДНК из растительных тканей картофеля и ПЦР-анализа з
5.6. Методы оценки трансгенных растений на устойчивость к болезням 39
5.7. Биохимическая идентификация исходных и трансгенных растений с помощью белковых маркеров 40
5.8. Статистическая обработка данных 41
6. Результаты и обсуждение 42
6.1. Оптимизация методики трансформации картофеля. 42
6.1.1. Анализ чувствительности трансформантов к канамицину 42
6.1.2. Получение трансформированных растений картофеля с помощью штаммов LBA4404 и LGV3850 Agrobacterium tumefaciens.. 43
6.1.3. Получение трансформированных растений картофеля с помощью штамма А4 Agrobacterium rhizogenes 6.2. Оценка трансгенности трансформированных растений картофеля... 54
6.3. Характеристика устойчивости трансгенных линий картофеля к грибным инфекциям
6.3.1. Характеристика устойчивости трансгенных линий картофеля к фитофторозу 58
6.3.2. Характеристика устойчивости трансгенных линий картофеля к альтернариозу 68
6.3.3. Характеристика устойчивости трансгенных линий картофеля к ризоктониозу in vitro 76
6.3.4. Лабораторная оценка устойчивости к раку картофеля
6.3.5. Лабораторная оценка устойчивости к сухой фузариозной гнили 82
6.3.6. Визуальная оценка устойчивости к парше обыкновенной
6.4. Определение урожайности трансгенных растений картофеля 85
6.5. Морфологические и физиологические особенности трансгенных линий картофеля 91
6.6. Комплексная оценка трансгенных линий картофеля 94
6.7. Доказательство соответствия трансгенного и исходного генотипов с помощью белковых маркеров 109
7. Экономическая эффективность выращивания трансгенного картофеля, устойчивого к грибным болезням 111
Выводы 113
Список литературы 1
- Ризоктониоз
- Антимикробная активность дефензинов
- Биохимическая идентификация исходных и трансгенных растений с помощью белковых маркеров
- Характеристика устойчивости трансгенных линий картофеля к ризоктониозу in vitro
Ризоктониоз
Альтернариоз картофеля (ранняя сухая пятнистость, макроспориоз), вызываемый несовершенным грибом Alternaria solani (Ell. et Mart.) Jones et Grout, в последние годы приобрел большую экономическую значимость. Этому способствовало, прежде всего, широкое применение системных препаратов и их смесей с контактными фунгицидами, которые эффективны против фитофтороза, но не действуют на альтернарию (Иванюк, 1991). Кроме того, до настоящего времени не велась целенаправленная селекция картофеля по признаку устойчивости к альтернариозу (Иванюк, Палилова, 1996).
Наиболее интенсивно заболевание развивается в жаркое лето, когда периоды сухой погоды чередуются с непродолжительными, но обильными осадками или ночными росами (Пересыпкин и др., 1989).
Распространяется патоген конидиями, сохраняя жизнеспособность при температуре 28-30С ниже нуля (Дорожкин, Вельская, 1979). Кроме картофеля, поражает многие растения из семейства пасленовых, которые также могут быть источником инфекции (Иванюк, 2000).
Решающим фактором возникновения эпифитотий заболевания является преобладание высокоагрессивных рас и штаммов. По агрессивности A. solani рызделены на 3 патотипа: высокоагрессивный (М-30), среднеагрессивный (М-10, М-40, М-78) и слабоагрессивный (М-69). Анализ экологических требований рас дал возможность выявить, что в составе популяции представлены расы, проявляющие высокую жизнеспособность в широких пределах температуры и влажности. Это создает предпосылки для ежегодного поражения всех сортов картофеля альтернариозом независимо от погодных условий вегетационного периода (Иванюк, 1986; Brian et al., 1962).
Трансгенные растения картофеля с включенными генами синтетических катионактивных пептидов рерб, рер7, pepll, рер20, созданных на факультете биологии (университет Колорадо, США) показали высокую устойчивость к ранней сухой пятнистости в условиях in vitro и in vivo, а также повышенную резистентность к Phytophthora infestans и Erwinia carotovora (АН, Reddy, 2000).
На основе двух генов 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатсинтазы ST-ACS4 и ST-ACS5 (Yip et al., 1992; Reddy et al., 1993), созданы генетически модифицированные растения картофеля с высокой устойчивостью к альтернарии и абиотическим стрессам (Schlagnhaufer, Arteca, Pell, 1997).
Созданы трансгенные растения картофеля сорта Рассет Бербанк с геном BN2S, выделенного из бразильского ореха (Bertholletia excela), экспрессирующего защитный белок, богатый метионином (Атре, 1986; Altenbach, 1987). Пептид ингибирует рост грибных гиф и повышает устойчивость к грибным патогенам (Tu, Godfrey, Sun, 1998). В настоящее время ведутся исследования на предмет устойчивости трансгенных линий картофеля к Alternaria solani.
В листьях томата обнаружен фунгицидный ген, способный инактивировать токсин Alternaria и микотоксин фумонизин. В настоящее время ведется работа по встройке гена в растения картофеля, табака и других культур (Brandwagt, 2000).
В листьях лимона обнаружен ген, экспрессирующий эпоксигидролазу. Белковые экстракты угнетали развитие Alternaria alternata и Alternaria solani (Gomi, Yamamato, Akimitsu, 2003). 2.3. Ризоктониоз
По данным М.С. Уткина (1921) ареал ризоктониоза шире зоны распространения фитофтороза. Снижение урожая картофеля в результате поражения растений ризоктониозом в среднем по Российской Федерации достигает 5-10%, а в Северо-Западной, Центральной зонах и Сибири - до 15— 20%. Больше всего поражаются клубни стебли, столоны и корни взрослых растений. На поверхности клубней образуются черные твердые склероции. На ростках и корнях при поражении хорошо заметны несколько вдавленные бурые пятна и язвы диаметром до 1 см и больше (Попкова, Векогон, 1967).
В большинстве же случаев гриб развивает грибницу и склероции на клубнях, поэтому его нередко называют Rhizoctonia solani Kiihn и относят к несовершенным грибам из порядка Mycelia sterilia. Гриб развивается при высокой влажности и температуре от 9 до 27С (оптимум 15-21 С) (Бордукова, 1970).
Rh. solani - факультативный паразит, может находиться в почве на остатках растений. Зимует в виде склероциев на клубнях и в почве. После посадки больных клубней склероции прорастают в грибницу, которая и поражает развивающиеся ростки. Н.А. Дорожкиным и Р.В. Куневичем (1968) установлено наличие нескольких штаммов ризоктонии, отличающимися по морфологическим, культуральным признакам, а также вирулентностью.
Особенно большой ущерб заболевание приносит в период прорастания клубней и появления всходов, так как гриб, развиваясь на ростках, вызывает их загнивание и отмирание. При поражении корневой системы водоснабжение в растении нарушается, что приводит к потере тургора (Гросс, 1985). При развитии гриба в сосудистых пучках стебля нарушается отток углеводов из листьев в клубни; в пазухах листьев наблюдается образование мелких воздушных клубней (Захарова, Михеева, 1975).
Глубокая посадка и запаздывание с уборкой картофеля ведут к увеличению пораженности клубней черной паршой. На песчаных почвах заболевание развивается несколько сильнее, чем на суглинистых (Куневич, 1974; Капустина, 1994).
Созданные с помощью метода генетической инженерии трансгенные растения табака и картофеля, экспрессирующие ген эндохитиназы бобов, имели устойчивость к Rhizoctonia solani, обусловленную действием фермента на изменение ультраструктури и химии клеток гриба (Benhamou et al., 1993).
Ингибирование роста Rhizoctonia solani на корнях также наблюдали Vierheilig et al. (1993) на трансгенных растениях картофеля и душистого табака, экспрессирующего ген хитиназы табака.
Антимикробная активность дефензинов
Поскольку большинство белков этой группы было выделено из семян, где они присутствуют в достаточно большой концентрации, можно предполагать, что функция этих пептидов состоит в защите семян от различных фитопатогенов. Эксперименты по изучению Rs-AFP белков из семян редьки показали, что когда семенная кожура прорвана корешком прорастающего зародыша или при помощи скальпеля, вокруг семян образуется зона подавления грибного роста. Хотя Rs-AFP белки были найдены в эндосперме, семядолях и гипокотиле, они были наиболее обильны в клеточных стенках обкладки на периферии этих органов. Это значит не только клеточно-специфическую регуляцию экспрессии, но также полярность отложения на субклеточном уровне. Внешние клеточные стенки эндсперма, семядоли и гипокотиля первыми намокают, когда семена начинают впитывать влагу, чем и можно объяснить нахождение здесь дефензинов, которые сразу могут противостоять атаке патогена (Terras et ah, 1992, 1995).
Помимо семян эти белки экспрессируются в растительных тканях. Так в листьях редьки с помощью антител на Rs-AFPl белок было найдено 2 пептида массой 5 кД в низкой концентрации. Эти пептиды накапливались в листьях инфицированных Alternaria brassicola, а также - в неинфицированных листьях в низкой концентрации. Два Rs-AFP гомолога из зараженных листьев (Rs-AFP3, Rs-AFP4) были очищены, и оказалось что 90% их аминокислотной последовательности имеют сходство с белками Rs-AFPl и Rs-AFP2 из семян. Эти листовые белки также способны вызывать морфологические изменения у грибных гиф (Terras et al.,1995).
Первыми дефензинами, обладающими антимикробной активностью были две изоформы растительных дефензинов, выделенных из семян редьки: Rs-AFPl и Rs-AFP2 (Terras et al., 1992). Основываясь на антимикробном эффекте этих пептидов, полученном на грибах, их можно разделить на две группы: "морфогенные" и "неморфогенные". "Морфогенные" дефензины способны уменьшать удлиннения гиф с сопутствующим утолщением в гифовых разветвлениях, тогда как "неморфогенные" дефензины только замедляют удлиннение гиф, но не индуцируют их заметные морфологические изменения.
Фунгицидная активность уменьшается вследствие увеличения ионной силы на среде, где наблюдается рост грибов. Антагонизм, как было выяснено, обусловливается катионами, причём двухвалентные (Са , Mg , Ва24") на порядок мощнее, нежели одновалентные (К+, Na+) (Terras et al., 1992; 1993).
Также антагонистический эффект катионов зависит от гриба и типа растительного дефензина. К примеру, на приготовленной картофельной среде с добавлением 1мМ СаС12, 50 мМ КС1, дефензии Ah-AMPl, выделенный из семян конского каштана был активным против Leptosphaeria maculans с 6 мкг/мл, но не подавлял Fusarium culmorum. Однако дефензин Hs-AMPl никак не влиял на развитие первого гриба и ингибировал рост фузариума, в концентрации 3 мкг/мл. Этот факт свидетельствует о селективности растительных дефензинов.
В меньшей степени растительные дефензины эффективны против бактерий. В свою очередь пептид Ct-AMPl из семян Clitoria ternatea активен против Bacillus subtilis, а дефензин из клубней картофеля является ингибитором Pseudomonas solanacearum и Clavibacter michiganensis (Osborn etal.,1995).
Спектр фунгицидной активности даже у белков одного растения может быть разным. Так дефензин редьки Rs-AFPl ингибирует 4 из 17 исследуе мых грибов при концентрации не превышающей 100 мкг/мл, a R.S-AFP2 - 11 из того же спектра патогенов при той же концентрации белка (Terras et al., 1995).
К настоящему времени нельзя наверняка сказать о точном механизме ингибирования дефензинами патогенной микрофлоры. К примеру, защитные пептиды Rs-AFP2 и Dm-AMP 1 не влияют на проницаемость гиф Neurospora crassa,. если не увеличить концентрацию дефензина в десятки раз по сравнению с минимальной концентрацией, требующейся для замедления роста этого патогена (Thevissen et al., 1996).
Дефензин редьки Rs-AFP2 оказывает ингибирующее действие на Bacillus megaterium (ІС5о=200 мкг/мл), а против таких бактерий как Alkaligenes eutrophus, Azospirillum brasilense, Erwinia carotovora, Pseudomonas solanacearum, Sarcina lutea он не эффективен даже в концентрации 500 мкг/мл (Broekaert et al., 1993).
В ответ на воздействие микробных патогенов растения способны индуцировать экспрессию PR генов, связанных с патогенезом. Накопление в растении PR белков совпадает с повышением устойчивости растений в ответ на взаимодействие с патогеном (Chiang et al., 1991). Это явление известно как системная устойчивость. Салициловая кислота, жасминовая кислота и газообразный растительный гормон этилен играют важную роль в проведении сигнала, приводящего к системной устойчивости. Так в результате изучения индукции гена дефензина из листьев Arabidopsis было показано, что данный ген транскрибируется при обработке метил-жасмонатом, так же как и в результате заражения при помощи Alternaria brassicola. При обработке салициловой кислотой белок не экспрессировался (Penninckx et al., 1996; Epple, Apel, Bohlmann, 1995). Гены дефензинов редьки не активируются при обработке растения салициловой кислотой, но воздействие метил-жасмоната и этилена приводит к их экспрессии (Terras et al., 1998).
Биохимическая идентификация исходных и трансгенных растений с помощью белковых маркеров
О способности агробактерий вызывать образование корончатых галлов (бактериальный рак) или "бородатых корней" было известно очень давно, однако не были известны причины, вызывающие образование этих морфологических изменений, так как тщательные исследования показали, что они могут в дальнейшем развиваться в стерильных условиях и не содержать этих агробактерий. Фактор, вызывающий развитие корончатых галлов или бородатых корней, долгое время оставался неизвестным, и его называли "опухолеобразующая причина" (tumor inducing principle) (Ooms et al., 1981; Дрейпер, 1991).
Инфицированные агробактериями клетки начинают быстро и бесконтрольно делиться и синтезировать аналоги аминокислот (опины), являющиеся для них источником углерода и азота (Tempe, Goldman, 1982).
Было установлено, что причиной всех этих изменений является встраивание части огромных кольцевых молекул ДНК (плазмид) этих агробактерий (Ti-ппазмиды [от англ. tumor inducing - индуцирующие опухоль] Agrobacterium tumefaciens и Ri-плазмиды [от англ. root inducing -индуцирующие корень] A. rhizogenes), так называемой Т-ДНК (transfer DNA), в хромосомы клеток растений (Klee et al.„ 1982; Tinland, 1996; Pan et al., 1997). Встраиваемая часть плазмидной ДНК агробактерий несет кроме генов синтеза опинов также гены синтеза фитогормонов и некоторые другие гены, наличие которых и придает этим трансформированным клеткам способность независимо делиться по типу раковых клеток. Таким образом, эти агробактерий являются естественным переносчиком генов в клетки растений (Albright et al., 1987). В настоящее вермя Ri-плазмиды рассматриваются как более перспективные векторы (Шевелуха и др., 1998).
Достижения последнего десятилетия привели к модификации естественно происходящего процесса переноса почвенными бактериями Agrobacterium tumefaciens и A. rhizogenes генов в растения. Были созданы так называемые "разоруженные" векторы и плазмиды, которые используются в настоящее время (Bevan,1984; Bevan, Flavell,.Chilton, 1983; Fraley etal, 1983; Shaw et al., 1984). В этих векторах многие гены заменены на маркерные и хозяйственно полезные. Использование этих векторов позволяет переносить чужеродные гены в клетки растений и затем регенерировать нормальные фертильные растения, в большинстве случаев через стадию образования каллуса или соматических зародышей при дальнейшей регенерации из них растений. Эти стадии являются в значительной степени генотипически зависимыми (Melchers et al.,. 1989; Картель, 1989).
При использовании же для агробактериальной трансформации сформировавшихся меристем появляется возможность получать трансгенные растения независимо от генотипа, так как регенерация растений из меристем является намного более простым приемом по сравнению с их регенерацией из каллуса или соматических зародышей (Caplan et al., 1983; Klee et al., 1985).
Во многих случаях при обработке эксплантов агробактериями наблюдается некроз тканей, что снижает частоту трансформации и требует разработки методов снижения этого некроза. Доказано, что использование соединений, блокирующих ионные каналы или способных ингибировать биосинтез простагландинов, при агробактериальной трансформации винограда снижает частоту некрозов и повышает частоту трансформации (Perl et al., 1998). Развитие некрозов снижалось также при предкультиви-ровании эксплантов на твердой или в жидкой среде, при использовании ПВП, аскорбиновой кислоты, тиосульфата серебра культивировании эксплантов в темноте на первых этапах селекции трансформированных клеток (Keinonen-Mettala, Weissenberg, 1998).
При агробактериальной трансформации обычно используют один штамм, несущий определенный ген(ы), которым инокулируют различные типы эксплантов. Поэтому если требуется внесение нескольких генов, находящихся в разных конструкциях, то получают трансгенные растения с одним геном, а затем проводят повторную трансформацию штаммом с. конструкцией, в которой находится другой ген(ы) (Кучук, 1997; Левенко, 2000). Таким образом, использование трансгенных технологий является новым и весьма перспективным направлением в области селекции картофеля на устойчивость к болезням. Применение метода генной инженерии в культуре картофеля имеет как большое научное, так и практическое значение и заслуживает внимания в сортоулучшении и создании новых сортов. Исходя из вышенаписанного, нами была поставлена цель исследований по получению трансгенных растений картофеля, устойчивых к грибным болезням, с помощью гена антимикробного пептида дефензина редьки путём агробактериальнои трансформации.
Характеристика устойчивости трансгенных линий картофеля к ризоктониозу in vitro
Как видно из табл. 10 трансгенных растений меньше, нежели трансформантов, устойчивых к канамицину. Предположительно это может объясняться следующим. Во-первых, регенерация побегов на экспланте может проходить из клеток каллуса, находящихся в разных точках. Поскольку канамицин в тканях распределяется по градиенту, то его концентрация может быть различной. Во-вторых, каллус представляет собой неорганизованную пролиферирующую ткань, состоящую из дедифферинцированных клеток (Шевелуха и др., 1998), что может привести к возникновению устойчивых к канамицину клеток в силу эпигеномной изменчивости и хромосомным абберациям, обусловливающих генетическое разнообразие каллусных клеток. В-третьих возможен разрыв связи целевого гена rs и маркерного npt/I, что могло обусловить встраивание генов независимо друг от друга. 6.3. Характеристика устойчивости трансгенных линий картофеля к грибным инфекциям
Все из выбранных нами сортов имели низкую или среднюю резистентность к фитофторе. Как упоминалось ранее (раздел 3) редечные дефензины в большинстве случаев активнее воздействуют на грибные патогены, поэтому мы предположили, что трансгенные растения с геном rs будут устойчивее, чем контрольные трансформированные сорта.
При оценке in vitro для искусственного заражения использовали листочки пробирочных растений 3-4-недельного возраста размером 10 мм. Отделенные листочки по 10-20 шт. раскладывали в чашки Петри на увлажненную фильтровальную бумагу. Заражение проводили высоковирулентной сложной расой (1.2.3.4.) Phytophthora infestans в концентрации 10-15 конидий в поле зрения микроскопа при увеличении 120. Степень поражения также определяли через 2-3 дня по 9-балльной шкале и вычисляли средний балл.
Для оценки in vivo искусственное заражение проводили высоковирулентной сложной расой (1.2.3.4) Phytophthora infestans с инфекционной нагрузкой суспензии в концентрации 10-15 конидий в поле зрения микроскопа при увеличении 120. Для заражения от каждого образца брали по 3 листа со среднего яруса и закладывали во влажные кюветы с увлажненной марлей и фильтровальной бумагой. После нанесения пипеткой по одной капле суспензии (0,1 мл) на каждую дольку листа, кюветы закрывали стеклами неплотно, чтобы влажность в них была на уровне 90%. Ежедневно стекла в течение дня снимали на 1ч для предотвращения загнивания листьев. Учитывали пораженность листьев на 3-й и 5-й день после инокуляции и оценивали по 9-балльной шкале. Расчет среднего балла по каждому образцу проводили по результатам поражения 3-х листьев при последнем учете. В качестве сортов-стандартов, устойчивых к фитофторозу по листьям использовали сорта Удача, Никулинский, Луговской со средней устойчивостью - Голубизна, Невский, с низкой устойчивостью - Жуковский ранний, Ильинский.
Для оценки методом искусственного заражения на устойчивость к фитофторозу по клубням промытые и обработанные 70%-ным спиртом клубни над пламенем горелки разрезали на ломтики толщиной 10 мм каждый и по три сдвоенных ломтика закладывали в чашку Петри с верхним увлажненным и нижним сухим фильтрами. Заражение проводили нанесением на нижний ломтик капли суспензии, после чего его накрывали другим ломтиком, что обеспечивало равномерное распределение суспензии по всей поверхности среза. Для заражения ломтиков применяли суспензию Phytophthora infestans (раса 1.2.3.4.5.6+0.7.8.10.1 l.xyz) концентрации 20-25 зооспорангиев в поле зрения микроскопа при увеличении 120. Учет поражения при инфицировании ломтиков проводили на 8-10 день. При подсчете среднего балла оценивали интенсивность проникновения гриба в паренхиму клубня по проценту некротизированной площади и интенсивность спороношения по распространению мицелия на площади среза по 9-тибалльной шкале. Рассчитывали отклонение от стандарта и оценивали по НСР.
В качестве устойчивого к фитофторозу по клубням брали сорта Луговской и Никулинский, со средней устойчивостью - Голубизна, Жуковский ранний, Ильинский, неустойчивый - Бронницкий (Сорта картофеля селекции ВНИИКХ, 2000).
Помимо оценок методами искусственных заражений оценивали проявление фитофтороза в полевых условиях по ботве во время эпифитотии в 2003 году. Результаты визуальной оценки в поле в дисперсионный анализ не входят.
В табл. 11-16 приводятся характеристика устойчивости трансгенных линий к фитофторозу по листьям и клубням. Как видно, линия Л13 показала наивысшую устойчивость как к фитофторозу по листьям (в среднем 8,2 - по оценкам с помощью искусственных заражений листьев и 5-7 баллов по визуальной оценке в год эпифитотии), так и по клубням (8,0 - с помощью искусственных заражений клубней).
Трансгенная линия Л9 показала результат по устойчивости к фитофторозу по листьям и клубням ниже Лорха-стандарта, исходя из визуальной оценки и оценок с помощью искусственных заражений листьев и клубней.
