Содержание к диссертации
Введение
1. Регуляция экспрессии генома эукариот (обзор литературы) 11
1.1 Клеточное ядро: - уровни регуляции экспрессии генома 12
1.1.1 Регуляция экспрессии генома на эпигенетическом уровне 13
1.1.2. Регуляция экспрессии генома на уровне транскрипции 16
1.1.3.Регуляция экспрессии генома на уровне процессинга пре-мРНК...18
1.1.4. Дифференцированный транспорт мРНК в цитоплазму 21
1.2 Цитоплазма: - уровни регуляции экспрессии генома 22
1.2.1 .Поступление мРНК в цитоплазму 23
1.2.2. Цитоплазматические мРНП 24
1.2.3. Компартментализация мРНК в клетке 26
1.2.4. Регуляция экспрессии генома на уровне трансляции 29
1.2.5. Сигнальные системы клеток растений 34
1.3. Смена наборов синтезирующихся белков в ответ на воздействие экзо и эндогенных факторов 38
1.4. Методические подходы к изучению белоксинтезирующего аппарата эукариотических клеток и стабильности мРНК 53
1.5. Методы оценки стрессоустойчивости растений в селекционной практике 55
2. Материалы и методы 58
2.1. Подготовка растительного материала 58
2.2. Визуализация зоны интенсивного деления клеток проростков 58
2.3. Трансляция in vitro в бесклеточной системе из зародышей пшеницы.59
2.4. Трансляция in vitro в лизате из ретикулоцитов кролика 59
2.5. Выделение полирибосом 60
2.6. Введение in vivo радиоактивной метки в мРНК проростков 61
2.7. Воздействие экзогенных фитогормонов 62
2.8.Выделение суммарной РЫК 62
2.9. Нуклеопротеид - целитная хроматография 63
2.10.Аффинная хроматография на поли(У)-сефарозе 64
2.11. Аффинно-адсорбционная хроматография на поли(У)-сефарозе 64
2.12.Электрофоретический анализ РНК 66
3. Разработка молекулярно-кинетического маркера оценки скорости формирования адаптивного ответа сортов зерновых культур при стрессовом воздействии 61
3.1. Эффект стрессиндуцированного изменения трансляционной активности полирибосом (ТАП) 68
3.2. Эффект распада рибосомной РНК in vitro 84
4. Разработка молекулярно-кинетических маркеров оценки стрессоустоичивости зерновых культур на основе механизма, регулирующего изменение функционального состояния и стабильности мРНК 91
4.1. Эффект дифференциального распада поли(А) мРНК in vitro 92
4.2. Метод аффинно - адсорбционного (АА) фракционирования пула поли(А) мРНК растений 99
4.3. Принципы АА фракционирования полинуклеотидов 105
4.4. Функциональные особенности поли(А) мРНК фракций, получаемых в процессе АА хроматографии 107
4.5. "Скрытая" группа поли(А)мРНК 112
4..6. Модель механизма регуляции белкового синтеза у растений при
стрессе 119
Выводы 126
Рекомендации для практики 128
Список публикаций по теме диссертации 129
Список литературы
- Клеточное ядро: - уровни регуляции экспрессии генома
- Визуализация зоны интенсивного деления клеток проростков
- Эффект стрессиндуцированного изменения трансляционной активности полирибосом (ТАП)
- Эффект дифференциального распада поли(А) мРНК in vitro
Введение к работе
Влияние неблагоприятных погодных условий в период вегетации растений является одной из главных причин снижения урожаев зерновых культур. Актуальная задача современной селекции - создание стрессоустойчивых и высокоурожайных сортов. Однако селекционная работа, ведущаяся на этом направлении, сопряжена с определенными сложностями, связанными с тем, что более устойчивые формы чаще всего обладают пониженной продуктивностью. Найдена обратная зависимость между степенью устойчивости организма и интенсивностью обмена веществ, что объясняется уходом растений в вынужденный покой (наиболее распространенный механизм, обеспечивающий неспецифическую устойчивость) [Удовенко и Гончарова, 1982 с. 144]. Кроме того, для Краснодарского края в зимний период характерны резкие колебания температуры, частые оттепели, вызывающие уменьшения глубины вынужденного покоя, и соответственно, снижение уровня неспецифической устойчивости озимых культур, а в весенний период не редки заморозки в первой половине и засуха во второй.
Для таких условий возделывания необходимы сорта, обладающие повышенной способностью к адаптации, т.е. приспособительными реакциями, связанными с оперативной регуляцией интенсивности физиологических процессов в ответ на изменение внешнего воздействия - так называемой "функциональной устойчивостью" [Ничипорович, 1988; Кумаков, 1995; Маймистов, 2001]. Причем, у сортов зерновых культур повышенная "функциональная устойчивость" может сочетаться с хорошей урожайностью, т.к. высокая интенсивность физиологических процессов является так же основой продуктивности [Ничипорович, 1988; Кумаков, 1995].
Селекционеры в своей работе по созданию стрессоустойчивых сортов вынуждены ориентироваться, как правило, только на конечный результат множества адаптивных реакций, используя в качестве критерия оценки генотипов - количество выживших при стрессе растений и степень повреждения клеток и тканей [Пучков, Набоков, 2001]. При этом вне их поля
5 зрения остается генетически детерминированный вклад отдельных процессов
и механизмов в формирование адаптивного ответа, что не позволяет выявить
лимитирующие стрессоустойчивость конкретного генотипа этапы.
Стрессоустойчивость или способность растений адаптироваться к неблагоприятным условиям представляет собой сложный комплекс функционально связанных биохимических, физиологических и морфологических признаков определяющих устойчивость соответственно - на молекулярном, клеточном, организменном и ценотическом уровнях [Удовенко, Гончарова, 1982; Федулов, 1994].
Безусловно, есть необходимость создания методов подробной диагностики
всех элементов стрессоустойчивости. Созданы диагностические методы,
которые, кроме морфологической оценки, позволяют судить об уровне
стрессоустойчивости растений по изменению физиологических и
биохимических процессов [Сергеева, 1971; Федулов, 1994; Павлов, Стрельцов, 1997]. Эти методы расширяют возможности исследователя в получении информации о своем селекционном материале.
Использование молекулярно-биологических подходов позволяет изучать более высокий уровень регуляции экспрессии генома на пути передачи информации от ДНК к признаку, что открывает возможности разработки принципиально новых критериев оценки генотипов и, вероятно, позволит непосредственно выявлять причины тех или иных фенотипических проявлений.
При отборе генотипов с повышенной "функциональной устойчивостью" необходимо оценивать две основных составляющих этой устойчивости -способность растения своевременно реагировать на воздействие стрессового фактора и осуществлять адаптационные изменения адекватно этому воздействию, перестраивая клеточные обмен веществ и структуру.
Очевидно, что чем раньше произойдет распознавание растениями неблагоприятного воздействия, тем быстрее будет запущен комплекс реакций, направленный на минимизацию негативных последствий от стресса. Этот комплекс однотипных реакций, развивающийся в растительной клетке
независимо от конкретного вида стресса, получил название неспецифический адаптивный синдром [Браун, Моженок, 1987; Пахомова, 1995]. Среди основных составляющих этого комплекса, таких как - накопление свободных аминокислот, увеличение активности окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов, важнейшими являются замедление белкового синтеза и следующее за этим изменение спектра синтезируемых белков.
Создание диагностического метода предназначенного оценить какой-нибудь процесс в динамике, предполагает разработку соответственного маркера, так же являющегося процессом, функцией. Этот тип маркеров получил название молекулярно-кинетических [Плотников, 2001].
Уверенно маркировать на уровне рецепции такой признак, как способность растения своевременно реагировать на воздействие стрессового фактора, представляется достаточно сложным, т.к. информация о нем интегрально воспринимается сразу несколькими сигнальными системами клетки [Тарчевский, 2002. Стр.153.]. Легче это сделать, определяя присущий конкретному генотипу временной интервал от начала стрессового воздействия до появления первых адаптивных реакций, проявляющихся в соответствующих изменениях интенсивности процесса трансляции. Очевидно, что это, в первую очередь, отразится на полирибосомах. Поэтому, изучение изменений, происходящих в препаратах мРНП из стрессированных растений, предшествовало разработке соответствующего маркера и далее -диагностического метода.
Другой признак - способность адекватно стрессовому воздействию осуществлять адаптивные изменения связан, в широком смысле, с перепрограммированием экспрессии генома на всех уровнях от транскрипции до трансляции и даже посттрансляционной модификации белков [Дубинин, 1989]. Однако особое значение имеет коррекция процесса трансляции осуществляемая на самой начальной стадии стрессового воздействия. Такая коррекция во многом определяет эффективность всего адаптивного ответа, т.к. обычно именно на этом этапе растения получают наибольшие повреждения.
7 Адаптивные процессы в клетке в диапазоне от тонкой настойки до
кардинальных изменений метаболизма модулируются изменениями в спектре
синтезирующихся белков. В свою очередь, качественный состав белков
меняется в результате удаления из процесса трансляции одних видов мРНК
при деградации [Клячко, 1991; Плотников, 1992; Gutierrez et al., 1999] или
потере активности [Stuger et al., 1999] и напротив, вовлечения в трансляцию
других - при их активации [Овчинников и др., 2001].
Очевидно, что существует молекулярный механизм, обеспечивающий изменения в составе транслирующихся мРНК адекватные изменению внешних условий. С определенной долей уверенности можно охарактеризовать некоторые особенности этого механизма. Во-первых - его очень древнее происхождение. Самой возможностью существования и развития эукариотическая клетка обязана способности оперативно реагировать на изменение внешних условий. Во-вторых, управление механизмом осуществляется не ядром, а цитоплазмой, о чем можно заключить по скорости появления стрессовых белков [Войников, 1989; Кулаева, 1997]. В третьих -функционирование механизма должно быть основано на очень простых принципах, т.к. только это может объяснить его высокую надежность при управлении, столь сложной системой, как эукариотическая клетка.
Тем не менее, в настоящее время в мире не существует общепризнанной или хотя бы просто убедительной гипотезы описывающей функционирование такого механизма, поэтому для поиска и разработки молекулярных маркеров, позволяющих выявлять генотипы, обладающие интересующими нас качествами, были проведены глубокие фундаментальные исследования в этой области.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение молекулярных механизмов, принимающих участие в формировании адаптивного ответа у сортов озимой пшеницы и ячменя, поиск молекулярных маркеров и создание на их основе методов, позволяющих диагностировать физиологическое состояние и определять уровень устойчивости растений к
8 различным стрессам. В соответствии с поставленной целью решались
следующие задачи:
изучить влияние различных абиотических стрессов на изменение трансляционной активности in vitro препаратов полирибосом из проростков озимого ячменя и озимой пшеницы;
выявить зависимость между рангом стрессоустойчивое сорта и изменением трансляционной активности in vitro препаратов полирибосом;
-. исследовать вопрос о роли поли(А) последовательностей мРНК в определении стабильности и функциональной активности информационных молекул;
изучить взаимосвязь между изменением физиологического состояния растений и стабильностью мРНК.
разработать диагностический метод оценки стрессоустойчивости сортов зерновых культур.
Научная новизна. В настоящей работе впервые:
- обнаружен эффект стрессиндуцированного изменения трансляционной
активности полисом in vitro. Установлено, что эффект обусловливается
изменением доли "тяжелых" полисом в препаратах мРНП растений.
Предполагается, что эффект отражает реакцию замедления интенсивности
белкового синтеза, универсальную для начальной стадии воздействия
различных видов абиотических стрессов;
- обнаружен эффект дифференциального распада поли(А) мРНК in vitro.
Показано, что эффект связан с наличием ассоциированной с поли(А) мРНК
нуклеазы, очевидно, входящей в состав регуляторного нуклеопротеидного
комплекса локализованного в 3' некодирующей зоне макромолекулы
(З'РНПК);
- установлено, что дифференциальный распад мРНК количественно коррелирует с изменением физиологического состояния растений и рангом стрессоустойчивости сортов;
- разработан метод аффинно-адсорбционной хроматографии на поли(У)-
сефарозе препаратов РНК, позволяющий: специфически фракционировать
9 пул цитоплазматических поли(А) мРНК; количественно разделять поли(А)
мРНК свободных (неактивных) и полисомных мРНП; выявлять популяции
мРНК в составе фракций; изучать, присутствующую в клетках апикальной
меристемы листа, группу поли(А) мРНК не сорбирующихся на поли(У)-
сефарозе без предварительной специфической инкубации;
предложена модель механизма "оперативного" изменения
функционального состояния и стабильности мРНК при стрессе.
Научно - практическая ценность работы.
- разработан метод оценки скорости формирования адаптивного ответа
сортов озимого ячменя и озимой пшеницы, пригодный для массового
скрининга;
создан метод диагностики физиологического состояния сельскохозяйственных растений, на основе выхода поли(А)мРНК во втором цикле хроматографии;
- разработан метод аффинно-адсорбционной хроматографии РНК на поли(У)-
сефарозе, перспективный для создания на его основе новых способов оценки
стрессоустойчивости сортов зерновых культур;
- созданы предпосылки для разработки технологии комплексной оценки
стрессоустойчивости сортов озимого ячменя и озимой пшеницы.
Основные положения, выносимые на защиту.
- изменение трансляционной активности полисом является универсальной
адаптивной реакцией растений, характерной для начального периода
большинства видов абиотических стрессов;
наличие ассоциированных с мРНК регуляторных нуклеопротеидных комплексов (3 'РНПК), влияющих на организацию всей 3 некодирующей зоны мРНК, специфически отражается на характере фракционирования информационных молекул в процессе аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе;
регуляторные нуклеопротеидные комплексы (З'РНПК) определяют "запрограммированность" пула цитоплазматических мРНП растений на
10 обеспечение перехода клетки в различные стационарные режимы
функционирования;
- диагностические методы, созданные на основе предложенных
молекулярно-биологических маркеров, могут значительно облегчить
селекционерам работу по подбору родительских пар и, в дальнейшем,
выявлению нужных генотипов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 7 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов". Москва, 1990; II симпозиуме "Новые направления биотехнологии растений", Пущино, 1993; 16th International Congress of Biochemistry and Мої. Biology, New Delhi, India 1994; 3 международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" Москва, 1995; II съезде биохимического общества РАН, Москва, 1997; региональной конференции "Перспективы внедрения современных биотехнологических разработок для повышения эффективности сельскохозяйственного производства", Ставрополь, 2003.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 153 страницах, содержит 13 таблиц и 27 рисунков.
Клеточное ядро: - уровни регуляции экспрессии генома
В отличие от прокариотической, в эукариотической клетке генетическая информация находится в нуклеоплазме (за исключением пластидных геномов), отделенной от цитоплазмы двухслойной ядерной мембраной [Franke, 1981]. Для прокариот характерна ситуация, когда на молекуле мРНК, транскрипция которой еще не закончена, формируются трансляционные комплексы и синтезируются полипептидные цепочки, а часто, следом за рибосомами уже продвигается РНКаза гидролизующая информационный транскрипт [Льюин, 1987, С.117]. У эукариот процессы транскрипции и трансляции разделены пространственно. В ядре осуществляется транскрипция, процессинг и сплайсинг мРНК, ее депонирование и/или транспортировка в цитоплазму [Brown, 1981]. Такая сложность структуры и функций эукариотической клетки является необходимым условием обладания геномом, в сотни и тысячи раз превосходящим по объему геномы бактерий [Карпов, 2003]. В свою очередь, величина генома эукариот дает им преимущества в развитии, позволяющие благодаря повышению уровня своей организации осваивать недоступные для прокариотических организмов экологические ниши.
Индивидуальное развитие эукариотического организма - процесс, в ходе которого реализуется программа избирательной экспрессии генов [Войников,1987.С61]. Если учесть, что линейный размер молекулы эукариотической ДНК может достигать нескольких метров [Карпов, 2003], становятся очевидными две проблемы, которые должны решаться клеткой на эпигенетическом (греч. ері - означает над, сверх) уровне - проблема упаковки ДНК в микроскопическом объеме ядра и проблема, в нужный момент и в нужной комбинации, извлечения из ДНК необходимой генетической информации.
По большей части, обозначенные проблемы решаются благодаря хроматину - чрезвычайно сложному и динамичному комплексу, в состав которого входят ДНК и белки. Белковый компонент у всех эукариот представлен преимущественно гистонами - НІ, Н2А, Н2В, НЗ, Н4 [Kornberg, 1974]. Молекула каждого гистона состоит из центрального структурированного трехспирального домена (одного длинного и двух коротких а-спиральных участков, соединенных петельным сегментом, так называемая гистоновая укладка) и двух неструктурированных N- и С- "хвостов" [Карпов, 2003]. Спиральные домены гистонов взаимодействуют друг с другом, в результате чего образуются гетеродимеры НЗ-Н4 и Н2А-Н2В. Эти димеры, в свою очередь, образуют тетрамер (Н3)г-(Н4)2 и два димера Н2А-Н2В, формируя гистоновый октамер. На этот октамер, как на катушку, наматывается ДНК, образуя от 1,75 оборота (по 80 п.н. в каждом обороте), до 2-2,5 оборотов [Lager et al. 1997]. Такая структура получила название нуклеосома. Между нуклеосомами находится еще до 60 пар оснований, с которыми, в зависимости от физиологического состояния клетки, может взаимодействовать гистон HI, обеспечивая упаковывание ДНК в еще более плотные структуры [Kornberg, 1974].
Особую роль в эпигенетическом контроле экспрессии генома играют N- и С- "хвосты" гистонов. Суперспираль ДНК в нуклеосоме закручена таким образом, что обеспечивается выход "хвостов" гистонов на поверхность нуклеосомы. "Хвост" гистона НЗ простирается далеко от места выхода на поверхность и фиксируется межнуклеосомными контактами. "Хвост" гистона Н4 имеет много контактов с поверхностью димера Н2А-Н2В соседней нуклеосомы. "Хвосты" гистонов выходят на поверхность хроматиновой фибриллы, участвуют в межнуклеосомном взаимодействии, очень подвижны и подвергаются многочисленным модификациям. Среди последних -ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, убиквитинирование и АДФ-рибозилирование [Jenuwein & Allis, 2001]. Эти модификации приводят к изменению заряда, гидрофобности и других свойств поверхности белковых глобул. На долю гистоновых "хвостов", располагающихся над поверхностью хроматиновой фибриллы, приходится до 25-30% массы индивидуальных гистонов, обеспечивая с помощью различных заряженных групп мозаичное "раскрашивание" поверхности монотонного хроматина. Кроме того, специализированные для гистоновых "хвостов" модифицирующие ферменты могут вызвать комбинаторное изменение этой мозаики. Таким образом, формируется сложная матрица для узнавания ее другими регуляторными белками, внешними сигналами. Более того, поскольку концевые домены гистонов участвуют и в межнуклеосомном взаимодействии, модификации влияют и на упаковку хроматиновой фибриллы, разрыхляя или уплотняя ее [Карпов, 2003].
Визуализация зоны интенсивного деления клеток проростков
Исследование адаптации растений к неблагоприятным факторам внешней среды имеет особое значение для отечественной селекции, поскольку из-за расположения в зоне рискованного земледелия сельскохозяйственному производству необходимы сорта, сочетающие повышенную стрессоустойчивость, т.е., в частности, холодоустойчивость и засухоустойчивость с высокой урожайностью. При этом, безусловно, одним из важнейших адаптивных признаков для отечественных сортов озимых культур является холодоустойчивость [Федулов, 1994].
Динамичный и многокомпонентный характер холодоустойчивости следует принимать во внимание при выборе лабораторных методов оценки этого признака. Существующие лабораторные методы оценки холодоустойчивости можно разделить на прямые, когда растения непосредственно подвергаются воздействию повреждающего фактора в специально создаваемых, контролируемых условиях, и косвенные, позволяющие установить корреляцию между отдельными показателями и устойчивостью растений.
Прямые методы диагностики холодоустойчивости В первую очередь, к прямым методам оценки холодоустойчивости растений относятся "полевой" и "лабораторно-полевой" методы. "Полевой" метод заключается в том, что после суровых зим определяют количество выживших растений, той или иной линии зерновых культур, с единицы площади посевов. Суть "лабораторно-полевого" метода в том, что в течение зимы периодически отбираются образцы и определяется степень их жизнеспособности [Соколова, 1981].
Главным недостатком "полевых" методов является невозможность поддержания оптимального для селекционного отбора "стрессового фона". Этот недостаток преодолевается благодаря широкому использованию в селекционной практике метода "искусственного промораживания", когда растения, посеянные в ящики, помещаются в климатические камеры в которых моделируется действие повреждающих факторов [Пучков, Набоков, 2001].
Косвенные методы диагностики холодоустойчивости По характеру диагностических признаков косвенные методы делят на две группы: - анатомо-морфологические и гистохимические; - физиолого-биохимические и биофизические.
К анатомо-морфологическим и гистохимическим методам относятся, в частности, определение холодоустойчивости по глубине покоя тканей и клеток [Генкель, Окнина, 1954], гистохимическое определение крахмала и жиров [Генкель, Окнина, 1964], определение прироста каллусов в культуре тканей [Кравцов, 1988].
К физиолого-биохимическим методам относятся, в частности, определение содержания активных регуляторов роста [Кефели, 1974], определение активности и изоферментного спектра РНКазы [Новиков, 2000], люминисцентные методы [Федулов, 1994], определение электрических параметров тканей [Федулов, 1994], определение изменений пигментной системы озимых культур в условиях перезимовки [Федулов, 1994] и т.д.
Многочисленные косвенные методы подкупают своей простотой и экспрессивностью. Однако, представляется, что слабым местом большей части методов в стремлении оценить сложный, многокомпонентный, динамичный признак в целом. Поэтому, как правило, сфера применения этих методов ограничена узким кругом объектов, для которых корреляции со стрессоустойчивостью были установлены. У разных объектов, или даже у одного и того же объекта в разном физиологическом состоянии, пути адаптации к стрессовому фактору могут существенно различаться, что, соответственно, отражается на проявлении тех показателей, которые легли в основу морфологических, физиологических или биофизических методов. Вероятно, косвенные методы можно использовать в качестве дополнения к прямым методам оценки приспособительных реакций растений в процессе адаптации.
Представленные в данной работе методы и методы, которые еще только будут созданы на основе разработанных молекулярно-кинетических маркеров, претендуют на объективную оценку отдельных компонентов процесса адаптации растений к резким изменениям внешних условий, так называемой "функциональной устойчивости". В разных климатических зонах вклад "функциональной устойчивости" в стрессоустойчивость организма сильно различается. Очевидно, что в Краснодарском крае значение именно этой составляющей стрессоустойчивости первостепенно и информация, содержащая оценку отдельных компонентов "функциональной устойчивости" селекционного материала, будет очень полезна для практиков в их работе по созданию стрессоустойчивых и высокоурожайных сортов.
Работа проведена в лабораториях молекулярной биологии и биотехнологии Краснодарского НИИСХ им. П.П.Лукьяненко в период с 1986 по 2007 год.
Исследования проводили на четырехсуточных проростках озимых и яровых сортов пшеницы (ТгШсит aestivum L.) и ячменя (Hordeum vulgare L.), а также на зерне кукурузы (Zea mays L.) линии Висконсин 64А. Сорта пшеницы и ячменя были ранжированы селекционерами по морозоустойчивости в полевых условиях.
Эффект стрессиндуцированного изменения трансляционной активности полирибосом (ТАП)
При воздействии различных стрессовых факторов растение отвечает комплексом реакций, направленных на поддержание гомеостаза и переживания неблагоприятного периода. Очевидно, что высокая скорость формирования растением адаптивного ответа на стрессовое воздействие позволяет минимизировать негативные последствия. При стрессе наряду со специфическими реакциями в растительной клетке развивается комплекс однотипных, не зависящих от конкретного вида воздействия, процессов, получивший название "неспецифический адаптивный синдром" [Браун, Моженок, 1987; Пахомова, 1995]. Среди основных составляющих этого комплекса - увеличение активности окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов, накопление свободных аминокислот, замедление белкового синтеза с одновременным изменением спектра синтезируемых белков.
Вероятно, на основе любой из перечисленных выше реакций можно с большей или меньшей эффективностью разработать молекулярно-кинетический маркер, позволяющий оценить такой признак, как скорость формирования адаптивного ответа. Но нам представлялось целесообразным сосредоточить свое внимание на процессе изменения интенсивности белкового синтеза в условиях стресса на том основании, что синтез белка является центральным процессом в клетке и адаптивные изменения на уровне трансляции предшествуют и обусловливают изменения биохимических и физиологических процессов, т.е. являются "первичными" по отношению к ним.
Особый интерес в этом плане представляла работа с препаратами полирибосом. Предполагалось, что трансляция in vitro препаратов полирибосом из подвергнутых стрессу проростков позволит в какой-то мере охарактеризовать изменения функционального состояния белоксинтезирующего аппарата клеток стрессированных растений.
Нами было показано, что под воздействием пониженной температуры (рис. 2 а, б), солевого (рис.2 в.) и водного (рис.2 г.) стрессов, а также при тепловом шоке (рис.2 д.; е.), in vivo с полирибосомами происходят определенные изменения, проявляющиеся in vitro в изменении их трансляционной активности (ТАП). Во всех случаях, увеличение ТАП in vitro наблюдалось на начальном этапе стрессового воздействия, с последующим ее снижением.
Нужно отметить, что реакция проростков озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 (рис.2 б.) на влияние низкой температуры оказалось менее интенсивной, чем на солевой, водный и тем более на тепловой шок. Это проявилось в том, что максимум трансляционной активности in vitro препаратов полисом из, подвергнутых холодовому воздействию, проростков достигался во временном интервале от 5 до 8 часов, в то время как на воздействие 2% раствора NaCl и 12% - ПЭГ, пик ТАП in vitro наблюдали через 1 и 2 часа соответственно (рис.2 в.), (рис.2 г.), а при тепловом шоке - через 15 минут (рис.2 д.; е.).
Можно предположить, что исследуемая реакция, кинетическим маркером которой служит изменение ТАП, имеет универсальный для любого неблагоприятного абиотического воздействия характер, являясь составляющей процесса адаптации.
Обнаруженный эффект оказался сортоспецифичным. Тепловой шок является одним из наиболее "жестких" абиотических стрессов, при котором происходит диссоциация полисом [Stuger et al., 1999]. Однако мы показали, что на начальном этапе воздействия теплового шока, для проростков также характерно увеличение ТАП, как и в случае других стрессов, но реакция осуществляется в более узком временном интервале. У контрастных по холодоустойчивости сортов озимой пшеницы Краснодарская 39 и Безостая 1, на другие виды стрессового воздействия, в частности теплового шока, реакция оказалась также контрастной, что проявлялось в разном времени необходимом для достижения сортами максимума ТАП in vitro (рис. 2 д.; е.). Через 15 минут после начала гипертермического воздействия (42С), сортом Краснодарская 39 максимум ТАП был уже пройден, а сорт Безостая 1 достигал его только через 45 минут.
Эффект дифференциального распада поли(А) мРНК in vitro
Сложности, возникающие при работе с мРНК, связаны, как с низким ее содержанием в препаратах суммарной РЬЖ, так и с тем, что мРНК в большей степени, чем другие молекулы, подвержены разрушению различными факторами. Считается, в частности, что Mg , присутствующий в растворах суммарной РНК способствует деградации РНК, катализируя реакцию разрушения, протекающую через образование 2 ,3 - циклического фосфата [Баршевская и др., 1987].. Многие исследователи предпочитают избавляться от этого катиона еще на стадии экстракции РНК из биологического материала и последующих стадиях ее очистки, используя соответствующие буферные системы и методические приемы [Хеймс и Хиггенс, 1987. С.268].
Выделение полиаденилированной мРНК из препаратов суммарной РНК, как правило, осуществляется методами аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе и олиго(дТ)-целлюлозе [Хеймс и Хиггенс, 1987. С.272-273]. Этот процесс может затрудняться тем, что в результате потери Mg++, поддерживающего третичную структуру рибосомных частиц [Ашмарин, 1977. С. 145-146], цепи рРНК разворачиваются и приобретают способность неспецифически адсорбироваться на колонке с аффинным носителем. Количество неспецифически сорбировавшихся молекул, многократно превышает количество поли(А) мРНК. Чтобы уменьшить долю неспецифической адсорбции при хроматографии таких препаратов колонки перед элюцией поли(А) мРНК промывают пятикратно разбавленным буфером для нанесения и/или после элюции проводят еще один или несколько циклов хроматографии [Aviv & Leder, 1972]. В своей работе мы осуществляли экстракцию суммарной РНК в присутствии ионов Mg++ буфером, применяемым при выделении полирибосом [Larosche & Horkins, 1987], после чего препараты депротеинизировали смесью фенол/хлороформ. В препаратах суммарной РНК, выделенных таким образом, рибосомные РРЖ сохраняют "компактную" структуру препятствующую их неспецифической сорбции на поли(У)-сефарозе, что позволило упростить процесс хроматографической очистки и, более того, количественно оценивать содержание поли(А) мРНК, т.е. использовать метод аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе не только в препаративных, но и в аналитических целях. Благодаря этому, при двуцикличной аффинной хроматографии препаратов суммарной РНК из проростков озимой пшеницы и озимого ячменя выделенных с Mg"1 , удалось обнаружить эффект уменьшения выхода мРНК во втором цикле (рис.14), количественно коррелирующий с изменением физиологического состояния растений (Табл. 5) и рангом стрессоустойчивости сортов (Табл. 6; 7; 8). 1 - поли(А) мРНК элюированная в первом цикле хроматографии; не сорбировавшаяся РНК - не сорбировавшаяся при повторном нанесении; 2 - поли(А) мРНК элюированная во втором цикле хроматографии. Фитофизиологи, основываясь на многолетних эмпирических наблюдениях, отмечают противоположную реакцию на свет у озимой и яровой пшениц [Шайн, I960]. В наших экспериментах озимая и яровая пшеницы также имели противоположную реакцию на свет - у озимой пшеницы освещение приводило к снижению, а у яровой к увеличению выхода поли(А) мРНК во втором цикле хроматографии (Табл. 5).
Таблица 5 - Влияние освещения на выход во втором цикле хроматографии поли(А)мРНК (поли(А) ++ мРНК) сортов озимой и яровой пшеницы
Поли(А)++мРНК в% Сорта без освещения освещение в часах "0"-"К" часов контроль( К !) опыт ("0") Зчаса 12 30 Краснодарская 39 75±2 25±0,6 17 ±0,4 16 ±0,5 -50 (озимая) Безостая 1 41±1,1 33±0,3 29 ±0,8 30 ±0,9 -8 (озимая) Дружина Б 37±0,9 47 ±1,0 - - 10 (яровая) Спектр 36±0,9 36 ±0,3 - - 0 (яровая) В таблицах 6 и 7 представлены результаты диагностики холодоустойчивости сортов озимой пшеницы и озимого ячменя. В графе "ранг устойчивости" показана относительная холодоустойчивость сорта по данным многолетних полевых испытаний селекционеров. Диагностику проводили по изменению разницы выхода поли(А)++ мРНК из растений, выращиваемых в течение 5 часов при 4С, и растений выращиваемых при 20С ("О" - "К"). Перед закладкой опытов все растения выращивали на свету не менее 12 часов и опыт проводили при освещении.
Как видно из таблиц 6 и 7 изменения выхода поли(А)++ мРНК кореллируют с ранжированностью по холодоустойчивости сортов как озимой пшеницы, так и озимого ячменя. Однако реакция на холод у этих культур противоположна.
Наиболее холодоустойчивый сорт озимого ячменя Радикал в наших экспериментах имел отрицательную разницу между опытом и контролем, по выходу поли(А) мРНК во втором цикле хроматографии. Однако эта отрицательная величина убывает по мере снижения холодостойкости сортов, становится нейтральной для сорта двуручки (Янус) и только затем сорта ячменя имеют положительное изменение доли прироста поли(А) мРНК под действием холода. Наиболее высокое значение по нашим данным имеет сорт ярового ячменя (Мамлюк), обладающий наименьшей холодоустойчивостью (Табл.7).
Эти данные подтверждают многочисленные наблюдения фитофизиологов и селекционеров, отмечающих противоположную реакцию на холод у озимой пшеницы и озимого ячменя.
