Содержание к диссертации
Введение
1 Характеристика растения томата (обзор литературы) 10
1.1 Классификация и характеристика томатов 10
1.2 Мейотическая рекомбинация и ее значение в селекции на примере растений томата 15
1.3 Влияние абиотических факторов на репродуктивную систему растений томата 21
1.4 Влияние биотического фактора на репродуктивную систему растений томата 23
2 Материал, методики и условия проведения исследований 27
2.1 Характеристика исследуемого материала 27
2.2 Условия проведения опыта 31
2.3 Схема гибридизации 33
2.4 Индуцированный биотический фактор ВТМ 34
2.5 Методика инокуляции растений томата ВТМ 37
2.6 Методика морфологического описания растений 37
2.7 Методика определения фертильности и жизнеспособности пыльцевых зерен растений томата 38
2.8 Методика определения количества пыльцевых зерен в цветке растения томата 38
2.9 Метод электронной микроскопии 39
2.10 Методика определения количества ДНК 39
2.11 Методы статистического анализа экспериментальных данных 40
3 Характеристика мужского гаметофита у гибридов f1 растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов 42
3.1 Морфологическая изменчивость гибридов F1 растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов 42
3.2 Фертильность и жизнеспособность мужского гаметофита у гибридов F1 растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов 57
3.3 Количества пыльцевых зерен у гибридов F1 растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов 62
3.4 Классификация генотипов подвергнутых влиянию разных температур 65
4 Влияние втм на пыльцевое зерно гибридов f1 растений томата 78
4.1 Влияние вируса табачной мозаики на пыльцевые зерна растения томата 78
4.2 Влияние абиотических и биотического факторов на количество ДНК в пыльцевом зерне растения томата 83
Выводы 86
Рекомендации для селекционной практики 88
Список использонной литературы .
- Мейотическая рекомбинация и ее значение в селекции на примере растений томата
- Методика морфологического описания растений
- Фертильность и жизнеспособность мужского гаметофита у гибридов F1 растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов
- Влияние абиотических и биотического факторов на количество ДНК в пыльцевом зерне растения томата
Введение к работе
Актуальность темы исследований.
Основные районы промышленного возделывания томата в России – Краснодарский и Ставропольский края, Ростовская область, Нижнее Поволжье. Большое количество промышленного возделывания этой культуры сосредоточено в странах ближнего зарубежья Молдове, на Украине, в Узбекистане, Азербайджане, Средней Азии (Авдеев Ю. И. и др., 2008).
По данным ФАО (2013), в России в 2013 году произведено 2,13 млн.
тонн томатов на площади 147 тыс. га. Для производства экологичной
продукции данной культуры требуется соблюдение нескольких факторов:
технологии производства, сортового разнообразия, средовых условий и
устойчивости к эпифитотиям. На данный момент экологическим факторам
уделяется второстепенное значение, хотя задачи экологизации
производства постоянно декларируются в документах правительства. С каждым годом увеличивается число выявленных вирусов, заражения которыми вызывает ощутимые потери урожая и заметно ухудшает качество сельскохозяйственной продукции. В южных районах нашей страны поражаемость растений Tobacco mosaic virus (далее ВТМ) повсеместно снижает урожайность плодов томата в 1,3-1,6 раза и более (Авдеев Ю. И., 2004; Жученко А. А., 2008; 2011).
Решение проблемы видится в использовании биоразнообразия генотипов растений томата включающие: культурные, полукультурные сорта, дикорастущие и мутантные формы и т.д. Это позволяет расширить спектр генетической изменчивости, даёт возможность получить нетрадиционные формы растений томата с хозяйственно-ценными признаками, а также наладить производство экологичной овощной продукции овощеводства, путем создания новых устойчивых гибридов растений томата к вирусным болезням.
Цель и задачи исследований. Цель исследований: оценка морфологического и генетического потенциала гибридного материала растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов по качественным и количественным признакам.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:
-
Получить гибриды между культурными сортами, дикорастущими видами и мутантными формами растений томата.
-
Изучить морфологические особенности генотипов растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов.
-
Провести пыльцевой анализ качества и количества пыльцевых зерен у гибридов F1 растений томата.
-
Установить характер проникновения ВТМ в растительную клетку с помощью метода электронной микроскопии.
-
Провести цитофотометрический анализ на количественное содержание ДНК в ядре гибридных растений томата, пораженных ВТМ.
Научная новизна работы. В условиях Краснодарского края впервые
получены гибридные формы растений культурного томата с
дикорастущими видами (L. hirsutum var. glabratum C. H. Mull. и L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh.) и мутантными формами (Mo 393; Mo 628; Mo 755). В результате внутри- и межвидовой гибридизации получено 16 гибридных комбинаций между культурными сортами, дикорастущими видами и мутантными формами растений томата.
Проведена морфологическая идентификация гибридного материла по типу куста, длине междоузлия, высоте растений, типу соцветия, проценту пораженности ВТМ, размеру и окраске цветка, форме и окраске плода.
Впервые выявлен характер действия абиотических факторов, таких как температура и удобрения, а также биотического фактора - поражение ВТМ, на характеристики репродуктивной системы гибридных форм растений томата.
Получены данные о фертильности, жизнеспособности и количестве пыльцевых зерен у 16 гибридных комбинаций растений томата.
Впервые предпринята попытка установить характер действия ВТМ на компоненты растительной клетки на основе данных методов электронной микроскопии и цитофотометрии.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований являются вкладом в изучение репродуктивной системы, гибридных комбинаций, растений томата, содержащих чужеродный генетический материал, данных гибридных форм томата, под влиянием действию различных доз минерального удобрения, температур и действию ВТМ.
Изучены особенности формирования репродуктивной системы растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов Проведен пыльцевой анализ 16 гибридных комбинаций, выявлена зависимость действия указанных факторов на качественные и количественные характеристики пыльцевого зерна, что дало возможность использовать пыльцевой тест как маркерную систему отбора генотипов, устойчивых к действию абиотических и биотического факторов.
Методы, использованные в работе, могут быть востребованы для проведения идентификационных работ по выявлению действия ВТМ на растительную клетку.
В результате проведенных исследований созданы уникальные гибридные комбинации межвидовых и внутривидовых форм растений
томата. Собран иллюстративный материал и коллекция фотообразов пыльцевых зерен гибридных комбинаций растений томата, подвергшихся влиянию абиотических и биотического факторов.
Материалы диссертационной работы используются в Кубанском государственном аграрном университете при преподавании дисциплин «Цитология» и «Генетический мониторинг» для студентов и магистров агрономического факультета и факультета экологии.
Методология и методы исследования. В работе использованы дикие виды, мутантные формы, культурные сорта растений томата, взятые из генетической коллекции ГНУ ВНИИБЗР, созданной академиком РАСХН и РАН А. А. Жученко, а также 16 гибридных комбинаций, полученных непосредственно автором в период 2008-2011 гг. При создании гибридных комбинаций использовалась стандартная методика гибридизации. Пыльцевой анализ гибридных комбинаций растений томата проводили по общепринятым методикам. Исследования с помощью методов электронной микроскопии и цитофотометрии были проведены на базе ВНИИСБ (г. Москва) по модифицированным методикам для данных растительных объектов.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Гибридные формы, с чужеродными геномами дикорастущих видов растений томата, характеризуются устойчивостью к ВТМ по сравнению с другими гибридными комбинациями.
-
Абиотические факторы, представленные различными дозами удобрений и температур, оказывают достоверное влияние на фертильность, жизнеспособность и количество пыльцевых зерен у всех исследуемых генотипов растений томата.
-
Гибридные комбинации F1 растений томата, пораженные ВТМ, качественно различаются по гетерогенности, жизнеспособности и количеству пыльцевых зерен.
-
Биотический фактор, представленный вирусом табачной мозаики, оказывает влияние на растительную клетку, меняет структуру пыльцевого зерна, деформирует ее и вызывает изменение количества ДНК в ядре клетки.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на:
Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и
специалистов «Молодые ученые агропромышленного комплекса
Поволжья» (г. Саратов, 2010); Международной конференции молодых
ученых и специалистов, посвященной 145-летию РГАУ – МСХА имени
К. А. Тимирязева (г. Москва, 2010); 6-ой Международной научно-
практической конференции «Биологическая защита растений как основа
экологического земледелия и фитосанитарной стабилизации
агроэкосистем» (г. Краснодар, 2010); Всероссийской научно-практической
конференции молодых ученых «Конкурентоспособная научная продукция
– АПК России» (г. Казань, 2011); Международной научно-практической
конференции «Современные мировые тенденции в производстве и
применение биологических и экологически малоопасных средств защиты
растений «Биологическая защита растений - основа стабилизации
агроэкосистем» (г. Краснодар, 2012); Международной научно-
практической конференции «Наука и образование» и XXI веке» (г. Москва, 2013).
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в т.ч. 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура работы. Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, включает 12 таблиц, 37 рисунков. Состоит из: введения, восьми глав с описанием современного состояния проблемы на основании проанализированных источников литературы, описанием исходного материала и методов, используемых при решении поставленных задач, экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов, рекомендаций для селекционной практики. Список литературы включает 225 источника, в том числе 79 на иностранном языке.
Мейотическая рекомбинация и ее значение в селекции на примере растений томата
Решение проблемы видится в использовании биоразнообразия генотипов растений томата включающие: культурные, полукультурные сорта, дикорастущие и мутантные формы, и т.д. Это позволяет расширить спектр генетической изменчивости, а так же даёт возможность получение нетрадиционных форм растений томата с хозяйственно-ценными признаками. Так же наладить производство экологичной овощной продукции, путем создания новых устойчивых гибридов растений томата к вирусным болезням.
Цель и задачи исследований. Цель исследований: оценка морфологического и генетического потенциала гибридного материала растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов по качественным и количественным признакам.
Для достижения этой цели поставлены следующие задачи: 1. Получить гибриды между культурными сортами, дикорастущими видами и мутантными формами растений томата. 2. Изучить морфологические особенности генотипов растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов. 3. Провести пыльцевой анализ качества и количества пыльцевых зерен у гибридов F1 растений томата. 4. Установить характер проникновения ВТМ в растительную клетку с помощью метода электронной микроскопии. 5. Провести цитофотометрический анализ на количественное содержание ДНК ядре гибридных растений томата, пораженных ВТМ.
Научная новизна работы. В условиях Краснодарского края впервые получены гибридные формы растений культурного томата с дикорастущими видами (L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull. и L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh.) и мутантными формами (Mo 393; Mo 628; Mo 755). В результате внутри- и межвидовой гибридизации получено 16 гибридных комбинаций между культурными сортами, дикорастущими видами и мутантными формами растений томата.
Проведена морфологическая идентификация гибридного материла по типу куста, длине междоузлия, высоте растений, типу соцветия, проценту пораженности ВТМ, размеру и окраске цветка, формы и окраске плода.
Впервые выявлен характер действия абиотических факторов, таких как температура и удобрения, а также биотического фактора поражение ВТМ, на характеристики репродуктивной системы гибридных форм растений томата. Получены данные о фертильности, жизнеспособности и количестве пыльцевых зерен у 16 гибридных комбинаций растений томата.
Впервые предпринята попытка установить характер действия ВТМ на компоненты растительной клетки на основе данных методов электронной микроскопии и цитофотометрии.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований являются вкладом в изучение репродуктивной системы гибридных комбинаций растений томата, содержащих чужеродный генетический материал данных гибридных форм томата, подвергшиеся действию различных доз минерального удобрения, температур и действию ВТМ.
Изучены особенности формирования репродуктивной системы растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов Проведен пыльцевой анализ 16 гибридных комбинаций, выявлена зависимость действия указанных факторов на качественные и количественные характеристики пыльцевого зерна, что дало возможность использовать пыльцевой тест как маркерную систему отбора генотипов, устойчивых к действию абиотических и биотического факторов.
Метод электронной микроскопии позволил установить характер действия ВТМ на растительную клетку, а метод цитофотометрии позволил установить количественное содержание ДНК в ядре клетки пораженного растения ВТМ.
Методы, использованные в работе, могут быть востребованы для проведения идентификационных работ по выявлению действия ВТМ на растительную клетку.
В результате проведенных исследований созданы уникальные гибридные комбинации межвидовых и внутривидовых форм растений томата. Собран иллюстративный материал и коллекция фотообразов пыльцевых зерен гибридных комбинаций растений томата, подвергшихся влиянию абиотических и биотического факторов.
Материалы диссертационной работы используются в Кубанском государственном аграрном университете при преподавании дисциплин «Цитология» и «Генетический мониторинг» для студентов и магистров агрономического факультета и факультета экологии.
Методология и методы исследования. В работе использованы дикие виды, мутантные формы, культурные сорта растений томата, взятые из генетической коллекции ГНУ ВНИИБЗР, созданной академиком РАСХН и РАН А.А. Жученко, а также 16 гибридных комбинаций, полученных непосредственно автором в период 2008-2011 гг. При создании гибридных комбинаций использовалась стандартная методика гибридизации. Пыльцевой анализ гибридных комбинаций растений томата проводили по общепринятым методикам. Исследования с помощью методов электронной микроскопии и цитофотометрии были проведены на базе ВНИИСБ (г. Москва) по модифицированным методикам для данных растительных объектов.
Методика морфологического описания растений
Описание диких и полукультурных разновидностей проводилось по книге «Дикие виды и полукультурные разновидности томатов и использование их в селекции» [Жученко и др., 1974].
L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh. – это кистевидный томат. Стебли прямостоячие, восходящие или стелющиеся, покрыты редкими длинными волосками. Листья мелкие или средней величины. Листовая пластинка гладкая, доли листа варьируют от тупоконечных до оттянутых, заостренных. Соцветие средней длины, цветки не большие 1,5-2 см в диаметре, от 12 до 26 штук. Тычиночная колонка длиной 0,6-0,8 см. Плоды мелкие около 12-20 мм в диаметре, вначале плодообразования темно зеленые, в зрелом состоянии становятся темно-красными или желтыми, в плоде от 20 до 50 штук семян. По мнению А.А. Жученко [1973], в селекционной практике наблюдается хорошая совместимость с красноплодными разновидностями вида L. esculentum Mill.
Эта разновидность обладает рядом положительных свойств. Плоды L. esculentum var. racemigerum (Lange) Brezh. содержат большое количество пектиновых веществ. Этот вид обладает сравнительной устойчивостью к почвенной засухе, что является немало важным для создания сортов пригодных для механизированной уборки и транспортировки. Кистевидный томат представляет собой источник устойчивости к альтернариозу, септориозу и фитофторозу. L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull. – это волосистый томат. Обладает мощным, опушенным стеблем, с сильным проявлением антоциановой окраски. Листья у растения удлиненно-овальные по контуру, с псевдоприлистниками у основания, светло зеленые с желтоватым оттенком, средней длины. Дольки листообразной формы, сидячие. Томат L. hirsutum var. glabratum обладает вилкообразным соцветием длиной от 12 до 21 см, на соцветии от 18 до 30 мелких цветков. Тычиночная колонка 0,9 см высоты, столбик превышает ее не более чем на 3 мм. Плоды томата темно зеленого цвета, опушенные длинными белыми волосками несъедобные, горькие на вкус и содержат солонин. Одной из особенности является темно зеленая линия на плоде, которая делит его пополам. Семена темно-коричневые, гладкие [Брежнев, 1955].
Разновидность L. hirsutum var. glabratum C.H. Mull. является донором генов хозяйственно ценных признаков. Так, он содержит ген Tm, обуславливающий устойчивость к ВТМ в условиях естественного заражения, который находится в гомозиготном состоянии и сцеплен с нежелательным фактором, контролирующим пониженную фертильность, с геном, обуславливающим пожелтение листьев и прекращение роста, а также ещё с одним летальным рецессивным геном. У гибридов F1 L. esculentum L. hirsutum var. glabratum гомозигота по гену Tm устойчива даже в условиях искусственного заражения. Вид нетребователен к теплу, переносит длительные понижения температуры до 0- -3 С, а также заморозки до -2 С [Жученко и др., 1973; Бухарова и др., 2008]
Условия проведения опыта Закладка экспериментов проводилась в период 2008 – 2012 гг. в лаборатории «Изучения и поддержания генетической коллекции томата», а также на экспериментальной базе ГНУ ВНИИБЗР (г. Краснодар) (поле, камера искусственного климата). Исследования электронной микроскопии и цитофотометрии были проведены на базе ВНИИСБ (г. Москва).
Для выращивания рассады томатов семена сначала проращивали в чашках Петри на фильтровальной бумаге, помещая их в термостат при температуре +22-25 С. Перед проращиванием семена обеззараживали перманганатом калия. Через 3-5 суток закладки проросшие семена высаживали в грунт.
Гибридизацию проводили на первых трех кистях, методом кастрации бутонов [Веселовский, 1965]. Один из компонентов для скрещивания выращивали в полевых условиях (L. hirsutum var. glabratum), остальные в камере искусственного климата. Для кастрации отбирали бутоны с зелено-желтыми пыльниками; для получения пыльцы – полностью раскрывшиеся цветки. Удаление пыльников и нанесение свежесобранной пыльцы на рыльце пестика осуществляли пинцетом; опыленные цветки изолировали ватным изолятором, маркировали пергаментными этикетками с указанием комбинации.
Растения F1 выращивали в камере искусственного климата с заданными условиями: освещенность 20 кЛк, температура +25 С, влажность 65 %, световой режим: день 16 часов, ночь 8 часов, в 5 л сосудах по методике постановки вегетационного опыта. Влажность почвы поддерживали на уровне 70-80 % от ее общей влагоемкости, а относительную влажность воздуха контролировали в пределах 45-60 % проветриванием и поливом [Журбицкий, 1968].
Для препаровальных работ в опыте использовали стереоскопический микроскоп (бинокуляр) Olympus SZ61. Цитологический анализ проводили на световом микроскопе Olympus BX41. Готовые препараты анализировали при увеличении объективов 100,25, 400,65. Объекты просматривались в пяти полях зрения.
Возбудитель мозаики - Гобяссо »іш/с v/ras (вирус табачной мозаики, ВТМ) [Migliori et al, 1970; Власов, 1974; Гавриш, 1987; Macias, 1980; Mercer et al, 1982]. Заболевание ВТМ распространено как в условиях открытого, так и защищенного грунтах. Симптомы заболевания варьируются от штамма, фазы заражения растений томата и условий окружающей среды. окружающих условий [Taylor et al., 1961; Власов, 1975; Авдеев, 1987] Плотноупакованные хромосомы представляют собой кристаллическую структуру, образованную белками, содержащими от 50 до 200 аминокисгидрофобных связей. Структура белковых субъединиц такова, что при их сборке образуется спиральный желобок, закрученный вокруг длинной оси стержня, в центре которой находится цилиндрическая полость диаметром примерно 2 нм (рисунок 3) [Воробьев, 1999].
Схема частицы ВТМ из изолированных субъединиц белка оболочки и молекулы РНК вируса [Воробьеву, 1999].
В этом желобке укладывается одна одноцепочечная молекула рибонуклеиновой кислоты (РНК, в которой хранится генетическая информация вируса) длиной 6400 нуклеотидов. Частица BTM имеет длину 300 нм, диаметр 18 нм, наглядно представлена на рисунке 4 [Воробьев, 1999].
Температура инактивации вируса 90–93 С, предельное разведение 1:100 000, потеря инфекционности при выстраивании в соке около 3000 дней. ВТМ принадлежит к группе типичных контактных патогенов и является одним из наиболее распространенных и вредоносных фитовирусов.
Вирус не имеет определенной связи с переносчиком, передается механической инокуляцией, контактом между больными и здоровыми растениями, с семенами томата и перца, не передается пыльцой.
Фертильность и жизнеспособность мужского гаметофита у гибридов F1 растений томата под воздействием абиотических и биотического факторов
Процесс гаметогенеза заканчивается образованием одноядерных пыльцевых зерен [Козлова и др., 1957]. У пыльцевых зерен растений томата спородерма состоит из двух главных слоев — экзины и интины.
Строение этих двух слоев, так же как и их толщина, является важным признаком, характеризующим пыльцевые зерна растений. Интина, в данном случае представляет собой внутренний слой оболочки пыльцевого зерна. Она облегает его содержимое и служит материалом, образующим в дальнейшем пыльцевую трубку. Химический состав интины неоднороден. Наружный слой образован преимущественно пектином. В состав внутреннего слоя – эктины, входят, главным образом, целлюлоза и пектин (рисунок 26.3). Эктина у пыльцевых зерен томата состоит из двух основных слоев — эктэкзины и эндэкзины. Эктэкзина представляет собой наиболее устойчивую часть экзины и отличается исключительным разнообразием строения [Тертяк, 1981; Schleif, 1993].
В густо окрашенных, созревших пыльцевых зернах было обнаружено вегетативное ядро (рисунок 26.1). При большом увеличении митохондрии яйцевидной формы (рисунок 26.2). Клеточная мембрана имела гладкую поверхность (рисунок 26.3). Эндоплазматический ретикулум расположен вблизи генеративного и вегетативного ядер (рисунок 26.4). Большое количество вакуолей различной формы, часто угловатой формы, особенно там, где они сосредоточенны около вегетативного и генеративного ядер (рисунок 26.6). Вегетативные ядра были сферической формы и обычно содержали одно и более ядрышек. Другие органеллы были скрыты в густой цитоплазме. Рисунок 26 - Пыльцевое зерно в пыльнике растений томата при электронной микроскопии: 1 - вегетативное ядро; 2 - митохондрия; 3 - клеточная мембрана (интина); 4 - эндоплазматический ритикулум; 5 - поры; 6 -вакуоли.
Для пыльцевого зерна гибрида F1 Мо 393 L. hirsutum var. glabratum пораженного ВТМ характеризовалось маленькими вакуолями, хотя они похожи на нормальные, но большинство из них были сжаты. Эндоплазматический ретикулум был разрежен. Митохондрии имели форму от сферической до яйцевидной, пузырьки в многочисленных местах, мембрана пыльцевого зерна деформирована (рисунок 27а).
Пыльцевое зерно, пораженное ВТМ, гибрида F1 Гаидас L. hirsutum var. glabratum имело ядро с неправильными очертаниями и ядрышко сферической формы. Рисунок 28 – Гибрид F1 Гаидас L. hirsutum var. glabratum: а) пораженное пыльцевое зерно, стрелкой указано ядрышко неправильной формы, с нечеткими очертаниями; б) нормальное пыльцевое зерно, стрелкой указано ядрышко с четкими контурами.
Эндоплазматический ретикулум не просматривался (рисунок 28а).
У незараженной формы ВТМ растений томата пыльцевое зерно содержало эндоплазматический ретикулум, который представляет собой систему плоских дисковидных замкнутых цистерн, располагающихся одна над другой в виде стопки. В цитоплазме содержатся хорошо развитые митохондрии. Ядро заключено в матрикс (рисунок 28б).
В пораженном пыльцевом зерне гибрида F1 Marglob L. esculentum var. racemigerum, большинство органелл были повреждены, имели неправильную форму. Стрелкой на рисунке 29а отмечены липоиды зерна неправильной формы. В не зараженном пыльцевом ядре гибрида F1 растения томата хорошо выражены генеративное и вегетативные ядра, хорошо развиты митохондрии, большое количество вакуолей (рисунок 29б).
Рисунок 29 – Гибрид F1 Marglob L. esculentum var. racemigerum: а) пораженное пыльцевое зерно, стрелками указаны липоиды зерна неправильной формы; б) нормальное пыльцевое зерно: 1 – генеративное ядро, 2 – вегетативное ядро.
В пораженном пыльцевом зерне гибрида F1 Мо 755 L. hirsutum var. glabratum мембрана была повреждена и пронизана многочисленными порами, плазменная мембрана отходила от стенок пыльцевого зерна, наличие вакуолей, эндоплазматический ретикулум был разрежен, митохондрии от сферической до яйцевидной формы, пузырьки в многочисленных местах, (рисунок 30а).
Пыльцевое зерно у незараженной ВТМ формы растений томата было правильной формы, содержащее генеративное и вегетативное ядра, вакуоли, которые были распределены по всей цитоплазме, хорошо развиты митохондрии (рисунок 30б).
Таким образом, выполненный цитологический анализ пыльцевых зерен с помощью электронной микроскопия позволил показать разнокачественность пыльцы по основным органоидам, которая является причиной гетерогенности пыльцы у гибридных форм томата.
Отклонениями в строении пыльцевых зерен, пораженных вирусом ВТМ у гибридных комбинаций растений томата являлись: деформация клеточной мембраны, изменение структуры органелл (митохондрий, вакуоли, эндоплазматический ретикулум, а также ядрышек). Наличие повреждений структуры митохондрий, что было выявлено при пыльцевом анализе, дает объяснение снижения жизнеспособности пыльцевых зерен и соответственно обуславливает уменьшение репродуктивного потенциала, пораженных вирусом гибридных комбинаций растений томата.
В нашей работе количество ДНК определяли методом быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.
Методика определения количества ДНК в клетке заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча, при прохождении через него в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки [Агроскин и др., 1976].
Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клеточной стенки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением цитометрии [Хачатуров 1980].
Методом цитофотометрии исследовалось генеративное ядро 2-х клеточной пыльцы гибридов F1 Гаидас L. hirsutum var. glabratum и Marglob L. esculentum var. racemigerum подвергнутых воздействию ВТМ.
Полученные данные показывали увеличение содержания ДНК в генеративном ядре зрелой пыльцы у этих гибридов, что свидетельствует о нестабильности генома гибридных комбинаций растений томата. Объяснение этому процессу может быть связано с тем фактом, что при создании гибридной формы в ядре сочетаются хромосомы обоих родителей, относящихся к разным генотипам, которые при прохождении процесса мейоза неравномерно расходятся к полюсам в стадии анафазы I. При прохождении мейоза у отдаленных гибридов возможны генетические изменения структуры хромосом, вызванные хромосомными [Pound, 1955; Yarwood, 1963]. Известно, что пыльце гибридов F1 растений томата свойственна гетерогенность, наличие стерильной и фертильной пыльцы, различие по размерам пыльцевых зерен.
Рисунок 31 - Количество ДНК в ядре гибридов растений томатов: a) F1 Гаидас L. hirsutum var. glabratum и б) Marglob L. esculentum var. racemigerum. Ряд 1 - количество ДНК зараженного растения томата; Ряд 2 -количество ДНК здорового растения томата; кл – градация деления количества ДНК в приборной школе.
Вместе с тем, ядра стерильной пыльцы гибридов содержат меньшее количество ДНК, чем ядра фертильной пыльцы. В то же время размер пыльцевых зерен коррелирует с уровнем плоидности. Возможно, сочетание этих особенностей и приводит к различию по содержанию ДНК. Количественные данные свидетельствуют, о том, что в опыте c гибридом F1 Гаидас L. hirsutum var. glabratum, зараженного ВТМ, содержится большее количество ДНК, чем в контроле (рисунок 31а, Ряд 2). В опыте с гибридом F1 Marglob L. esculentum var. racemigerum, наоборот количество ДНК меньше, чем в контроле (рисунок 31б, Ряд 2).
Если посмотреть распределение ДНК, то можно отметить, что во всех вариантах количество ДНК варьирует от 1С до 1,5 и 2С. Причем, количество ДНК зараженных растений гибридов F1 Гаидас L. hirsutum var. glabratum уменьшается до 1С ДНК и возрастает до 1,5С ДНК. В то же время количество ДНК F1 Marglob L. esculentum var. racemigerum увеличивается 1С и 1,5 ДНК и снижается 2С ДНК.
Это можно объяснить более стабильным геномом гибрида F1 Гаидас L. hirsutum var. glabratum по сравнению F1 Marglob L. esculentum var. racemigerum.
Существует несколько предположений о действии вируса ВТМ на клеточные структуры. По мнению ряда авторов C.E. Yarwood [1960], репликация ВТМ происходит только в цитоплазме. Однако, некоторые данные, полученные при цитологических и цитохимических исследованиях, позволяют предполагать, что первичным местом репликации РНК этого вируса является, вероятно, ядро.
Влияние абиотических и биотического факторов на количество ДНК в пыльцевом зерне растения томата
У межвидовых гибридов F1 растений томата проявление фенотипических признаков, таких как: тип куста, длина междоузлия, высота растений, тип соцветия, процент пораженности ВТМ, базовые характеристики цветка и плода проявляются в соответствии с генотипом отцовской формы, в качестве которого выступают дикорастущие виды томатов.
Полученные межвидовые Гибриды F1: Мо 393 L. hirsutum var. glabratum, Мо 628 L. hirsutum var. glabratum, Мо 755 L. hirsutum var. glabratum, Marglob L. hirsutum var. glabratum, Гаидас L. esculentum var. racemigerum характеризовались устойчивостью к вирусу табачной мозаики, процент поражения составлял от 40 до 45 %.
Достоверно показано при изучении влияния абиотических факторов на репродуктивную систему гибридных комбинаций растений томата, что наибольшее влияние на фертильность пыльцевых зерен у всех исследуемых генотипов оказали температура и совокупность факторов – температуры и удобрения. Доля дисперсии соответственно составила 61,3 % и 27,3 %.
Установлено, что вклад различий генотипов исследуемых комбинаций по признаку жизнеспособность пыльцевых зерен крайне мал и не превышал одного процента. Для этого показателя превалировала роль средовых факторов – температурного режим а и дозы удобрений. Так, вклад различия температур составил – 40,2 %, а удобрений - 19,5 %. Вклад различий совместного влияния температур и фонов минерального питания также был велик и составил 28,5 %. Влияние генотипа оказалось незначительным, как по отдельному признаку (0,9 %), так и по совместному (1,6 %; 0,3 %; 0,8 %).
Установлено статистически достоверное влияние генотипа на количество пыльцевых зерен (11,6 %). На взаимодействие факторов температуры и минерального удобрения приходится 16,7 %, а генотипа и температуры – 10,9 % от общей изменчивости.
В результате статистической обработки материала выявлено, что оптимальной температурой для процесса микроспорогенеза у гибридных комбинаций является температура 25С, так как при этом отмечаются достоверно высокие качественные (фертильность пыльцы 48,5 %, жизнеспособность 3,6 %). и количественные показатели пыльцы (количество пыльцевых зерен 5,7 тыс. шт).
Доказана с помощью метода электронной микроскопии разнокачественность и гетерогенность пыльцы у гибридных форм растений томата.
Выявлено, что к общим отклонениям в строении пыльцевых зерен, зараженных ВТМ у гибридных комбинаций растений томата относились: деформация клеточной мембраны, изменение структуры органелл (митохондрий, вакуоли, эндоплазматический ретикулум, а также ядрышки).
Показано, что распределение ДНК в ядре зараженных растений ВТМ варьирует, во всех вариантах количество от 1С до 1,5 и 2С. По показателю количества ДНК, выявлено, что ВТМ в ядре клеток гибридных комбинаций растений томата не обнаруживается, по всей видимости, он доходит до ядра клетки у растений томата, но внутрь не проникает.
Межвидовые гибриды F1: Мо 393 L. hirsutum var. glabratum, Мо 628 L. hirsutum var. glabratum, Мо 755 L. hirsutum var. glabratum, Marglob L. hirsutum var. glabratum, Гаидас L. esculentum var. racemigerum могут быть рекомендованы для дальнейшей селекционной практики так как, они отличались устойчивостью к вирусу табачной мозаики.
Гибридные комбинации, содержащие геномы диких видов растений томатов: Мо 755 L. esculentum var. racemigerum, Мо 755 L. hirsutum var. glabratum, Marglob Мо 628, Гаидас Мо 755, Marglob L. hirsutum. var. glabratum, Marglob L. esculentum var. racemigerum, Гаидас L. hirsutum var. glabratum, Гаидас L. esculentum var. racemigerum могут быть использованы в дальнейшей селекционной работе как перспективные по показателям фертильности и количеству пыльцевых зерен в пыльнике при оптимальных и повышенных условиях выращивания (+25 C и +30 C), что актуально для климатических условий Краснодарского края.
