Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Использование биотехнологических методов в селекции ремонтантных форм малины 9
1.1 Характеристика объекта исследований 9
1.2 Микроклональное размножение растений 11
1.3 Регенерация плодово-ягодных растений в культуре in vitro 19
1.4 регуляторы роста растений 24
1.4.1 Биопрепараты на основе симбионтных грибов 29
1.4.2 Регуляторы роста на основе фурфурола 30
1.4.3 Крезацин - новый синтетический препарат 31
1.5. Современные методы исследования генома растений 33
1.5.1 Морфо-фенотипические и биохимические методы 33
1.5.2. Задачи решаемые ПЦР 36
1.6 Использование молекулярных маркеров в изучении генома и селекции малины 38
ГЛАВА 2. Методики и условия окружающей среды 42
2.1 Место проведения и объекты исследований 42
2.2 Методики исследований 47
2.2.1 Методика микроклонального размножения 47
2.2.2 Методика получения регенератов ремонтантной малины 50
2.2.3 Методы по определению генома малины 51
2.2.3.1. Выделение геномной ДНК 52
2.2.3.2 ISSR-PCR 53
2.3 Климатические и почвенно-агротехнические условия проведения исследований 53
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждение 63
3.1 Микроклональное размножение ремонтантных форм малины 63
3.1.1 Введение новых генотипов 63
3.1.2 Сравнение эффективности использования желирующих веществ при культивировании ремонтантной .
малины в культуре in vitro 68
3.1.3 Влияние месторасположения почек на однолетних побегах замещения ремонтантной малины на их
регенерационную способность в культуре in vitro 74
3.1.4 Влияние регуляторов роста на развитие побегов малины в культуре in vitro 78
3.1.5 Адаптация к нестерильным условиям 84
3.2 Регенерация ремонтантных форм малины из листовых эксплантов 89
3.3 Молекулярное маркирование признака ремонтантности у малины при микроклональном размножении. 94
ГЛАВА 4. Экономическая эффективность применения регуляторов роста при микроклональном размножении ремонтантной малины 97
Выводы 99
Рекомендации 100
Список используемой литературы 101
- Характеристика объекта исследований
- Регенерация плодово-ягодных растений в культуре in vitro
- Методика получения регенератов ремонтантной малины
- Микроклональное размножение ремонтантных форм малины
Введение к работе
Актуальность темы. Выращивание сортов ремонтантного типа, наряду с обычными сортами дает возможность создать в условиях средней полосы России конвейер поступления свежих ягод малины в течении 2,5-3 месяцев, начиная с конца июня и до наступления осенних заморозков. При этом реализация ягодной продукции ремонтантных сортов в «несезонное» для малины время по более высоким, чем летом ценам стимулирует расширение насаждений малины во всех категорий хозяйств (Казаков, 2001).
Возделывание ремонтантных сортов малины по типу однолетней культуры снимает проблему зимостойкости стеблей, а их удаление с плантации после скашивания позволяет избавиться от основных болезней и вредителей без применения пестицидов. Использование в производстве сортов ремонтантного типа с неполегающими под тяжестью урожая стеблями создает возможность максимальной механизации по уходу за насаждениями, включая машинную уборку урожая. При этом отпадает необходимость в устройстве дорогостоящей шпалеры, подвязке стеблей к проволоке и их поштучной вырезке после плодоношения (Казаков, 2000).
На Кокинском опорном пункте ВСТИСП с начала 70-х годов прошлого века ведется интенсивная работа по созданию ремонтантных сортов малины, формирующих основной урожай в конце лета - начало осени на однолетних побегах.
Актуальной проблемой при создании таких сортов является оптимизация селекционного процесса. Ремонтантные формы малины сложного межвидового происхождения отличаются низкими коэффициентами происхождения, а отдельные генотипы совсем не образуют корневой поросли. Данная биологическая особенность увеличивает период полевого размножения, и следовательно значительно удлиняет процесс перехода элитных форм к сортоиспытанию. Поэтому для ускорения селекционного процесса актуально использование метода микроклонального
размножения растений. Гибриды сложного межвидового происхождения резко отличаются по реакции на условия культивирования in vitro. Поэтому для новых селекционных форм требуется индивидуальный подбор условий на всех этапах микроклонального размножения. Следует отметить, что некоторые ремонтантные формы обладают низким коэффициентом размножения даже в культуре in vitro, поэтому применение новых препаратов стимулирующего действия является весьма актуальным.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы была оптимизация условий микроклонального размножения новых ремонтантных форм малины, испытание влияния новых регуляторов роста в культуре in vitro. В ходе работы решались следующие задачи:
- определение эффективности использования цитокинина CPPU на
этапе введения в культуру in vitro и при получении регенерантов
ремонтантных образцов малины;
- изучение реакции новых форм малины на условия микроклонального
размножения;
- изучение возможности использования фитогеля в качестве
желирующего вещества при клональном микроразмножении;
- определения эффективности концентраций новых регуляторов роста
растений при стимулирования физиологических процессов протекающих в
растениях ремонтантной формах малины в культуре in vitro;
- проверка сцепления молекулярного маркера с признаком
ремонтантности у новых селекционных форм малины.
Научная новизна исследований. Подобраны условия для культивирования in vitro 52 новых ремонтантных форм малины. Показана высокая эффективность CPPU на этапе введения в культуру новых форм ремонтантной малины, экспланты которых обладают низкой адаптивной
7 способностью к условиям in vitro, а также при стимуляции регенерации
побегов из листовых эксплантов.
Впервые продемонстрирована высокая эффективность новых
регуляторов роста растений негормональной природы при микроклональном
размножении ремонтантной малины.
Практическая значимость. Оптимизированные методики культивирования in vitro активно применяются для размножения новых элитных форм как на этапе первичных отборов, так и подготовки сортов для передачи в сортоиспытание. За время работы в селекционный питомник передано 3772 растений 64 форм. Применение микроклонального размножения позволяет ускорить селекционный процесс на 3-4 года.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены и одобрены на заседаниях кафедры ботаники, физиологии растений и микробиологии, на заседаниях Ученого совета Агроэкологического института и научно-практических конференциях : Международной научно - практической конференции молодых ученых : «Производство экологически безопасной продукции растениеводства и животноводства» (Брянск, 2004), Международной научно - практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых: «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск, 2005); изложены на Всероссийской научно-методической конференции «Состояние и перспективы развития ягодоводства в России» (Орел, 2006).
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и
8
рекомендаций для практической селекции. Работа содержит 18 таблиц и 15
рисунков. Список использованной литературы включает 204 наименования, в
том числе 57 на иностранных языках.
Характеристика объекта исследований
Малина - одна из самых полезных для человеческого организма ягодная культура. Благодаря своему биохимическому составу ягоды малины успешно используют для профилактики и лечения сердечно - сосудистых, желудочных, простудных и других заболеваний. Малина скороплодная и урожайная культура. В оптимальных условиях лучшие ее сорта способны продуцировать 30-35 т/га. Данную урожайность очень сложно получить, так как ни один выращиваемых сортов не обладает надежной адаптацией к ряду отритцательных факторов внешней среды. Растения малины сильно подмерзают в экстремальные зимы, резко снижают продуктивность в жаркие, засушливые периоды вегетации, а болезни и вредители нередко приводят к полной потере товарного урожая (Казаков, 1994).
Одним из путей снижения отрицательного воздействия внешних условий на растения является создание ремонтантных сортов, плодоносящих на однолетних побегах в конце лета - начала осени (Казаков, 1995). Сорта такого типа наиболее полно реализуют потенциал своей продуктивности в результате односезонного цикла формирования урожая и особой низкозатратной технологии их возделывания (Казаков, 1999). Суть этой технологии заключается в том, что после уборки созревшего на однолетних побегах урожая и наступления осенних заморозков всю надземную часть малины скашивают косилкой. С весны следующего года отрастают новые побеги, которые в июле зацветают, а в конце лета - начала осени обильно плодоносят. При наступлении устойчивых осенних заморозков надземную часть растений снова скашивают (Кичина, 1990; Ярославцев, 1990). Выращивание ремонтантных сортов с подзимним скашиванием растений и полным отказом от использования пестицидов обеспечивает им экологическую и экономическую привлекательность.
Данные сорта продлевают сезон потребления свежих ягод до первых заморозков. Недостатком большинства зарубежных сортов является то, что для полного созревания урожая требуется безморозный период 150-160 дней и сумма активных температур не менее 3000С, а для Брянской области она обычно составляет 2100-2300С. Потенциальная урожайность из-за этого реализуется только на 15-20%(Казаков, 1994).
Плодотворная работа по созданию сортов малины ремонтантного типа, проводится на Кокинском опорном пункте ВСТИСП, где собрана многочисленная коллекция ремонтантных сортов и форм. Ежегодно из тысяч сеянцев, полученных благодаря межвидовой и внутривидовой гибридизации малины, отбирают генотипы, которые выделились по каким-либо хозяйственно- ценным признакам: по размеру, вкусовым качествам и плотности ягод, по устойчивости к болезням и вредителям, по срокам плодоношения дружности созревания урожая, по возможности механизированной уборки урожая, по типу формирования урожая и высоте побегов. Лучшие образцы используют в селекции, а некоторые внедряют в производство (Попова и др., 1997; Бычков, Кротов 1980; Куминов и др., 1981; Лукин, 1981; Кудасова, 1981; Кольцова, 1983; Бургомистров, 1985; Ярославцев, 1987; Зотова, 1987; Протасов, Утков, 1987; Соколова, 1987; Стрекач, 1987; Прохоров, Горобец, 1992).
Ряд ценных отборов сложного межвидового происхождения отличаются очень низким коэффициентом размножения, а отдельные генотипы совсем не образуют корневой поросли (Казаков, 1994,1995). Это свойство является следствием физиологических особенностей ремонтантных форм, у которых метаболизм всего растения направлен на формирование урожая на побегах текущего года, а основной объем ассимилятов потребляется молодыми растущими побегами и развивающимися плодоэлементами. Из-за этого формирование корневых отпрысков резко замедляется, следовательно и вегетативное размножение ремонтантных форм намного ниже, чем у обычных гибридов.
Решить проблему размножения генетически ценного материала и ускорить селекционный процесс возможно, применяя метод клонального размножения. Этот метод широко используется на многих плодовых и ягодных культурах, в том числе и на малине, для получения большого количества высококачественного посадочного материала за короткое время (Высоцкий, 1995, 1996; Стахеева, 1998).
Микроклональное размножение - это метод вегетативного размножения, который заключается в получении в условиях in vitro растений генетически идентичных исходному. Этот способ позволяет полнее всего реализовать потенциал растительного организма к размножению (Высоцкий, 1986; Yeoman, 1986; Lowe etal., 1996).
В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму. Благодаря этому появляется возможность достигнуть некоторых преимуществ по сравнению со стандартными способами размножения (Бутенко, 1979; Шевелуха, 1998; Стрыгина, 1990): - получение генетически однородного материала; - освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры; - высокий коэффициент размножения (в течении одного вегетационного периода имеется возможность получить тысячи и даже десятки тысяч растений из одной меристемы);
Регенерация плодово-ягодных растений в культуре in vitro
Большой прогресс, достигнутый в разработке способов генетической трансформации высших растений, открывает совершенно новые перспективы для целей практической селекции. Важнейшим ограничивающим фактором является проблема регенерации целых растений из трансформированных тканей (Schuerman, 1993).
Дифференцировка тканей экспланта и характер морфогенеза зависит от генотипа исходного растения, эпигенетической характеристики экспланта и внешних условий (Лутова, 1994; Бутенко, 1999).
Регенерация растений из культуры тканей может происходить следующими путями: соматический эмбриогенез и органогенез (Тиссера, 1989).
Соматический эмбриогенез представляет собой процесс формирования зародышеподобных структур из соматических клеток. Соматический зародыш - это независимая двухполюсная структура, физически обособленная к ткани, из которой происходит. Такие зародыши в дальнейшем могут развиваться и прорастать в регенераты через стадии, соответствующие тем, которые наблюдаются при развитии зиготического зародыша. При формировании растений - регенерантов путем органогенеза сначала индуцируется образование и рост побегов из каллуса, а затем проводится их укоренение на соответствующих питательных средах. При культивировании листьев пробирочных растений существует методика, обеспечивающая высокую скорость размножения многих видов растений без возникновения генетических нарушений. При этом чаще наблюдается путь регенерации побегов, при котором вначале образуется каллус, на котором на этой же или другой среде дифференцируются почки (Nishi, 1973).
Регенерация адвентивных побегов растений рода Rubus была показана на листьях (Swartz, 1981, 1987, 1990), черешках (Cousineau, 1991), листовых дисках и участках междоузлий (Меркулов, 1993; Муратова, 2003, семядолях (Fiola, 1986,1990) и зрелых зародышах (Fiola, 1989).
Молодые листья малины, изолированные с верхушек растений, обладают большей частотой регенерации и образуют большее количество побегов на эксплант в сравнении с листовыми пластинками нижних ярусов (Туровская, 1993).
Естественной реакцией на повреждение целостности растительного организма является включение регенеративных процессов (Юсуфов, 1982). Механические повреждения позволяют увеличить количество растений -регенерантов. Так, для сорта малины Скромница надрезание пластинки листа вдоль центральной жилки позволило увеличить частоту регенерации в два раза, тогда как для сорта Бабье лето, механическое повреждение тканей экспланта не отражалось заметным образом на регенерационных процессах (Хамукова, 1994).
Из химических обработок эксплантов в культуре in vitro может применятся выдерживание их в концентрированном растворе 2,4-Д (Хамукова, 1994). Изменение органогенного потенциала листовых эксплантов для двух гибридов Rubus удалось добиться с помощью предварительной культивации исходных растений на среде с тидиазуроном (Swarz, 1990).
По результатам исследований ряда авторов оптимальные инкубационные условия заключаются в выдерживании эксплантов в течении двух недель в темноте с последующим переносом на свет. Исследователи две недели выдерживали листья в темноте, поместив их адаксиальной поверхностью к среде, что позволило повысить регенерацию до 56% (Swarz, 1990). В тоже время по результатам американских ученых, обработка темнотой была неблагоприятна для регенерации ежевики, при этом ауксины в питательной среде отсутствовали (Fiola, 1990).
Решающим фактором при получении регенерантов является присутствие экзогенных гормонов. На ранних этапах исследований по регенерации малины в качестве источников цитокининов использовали 6-БАП, однако процент регенерации редко превышал 20% (Fiola, 1990). Увеличение количества регуляторов роста выше 3-5 мг/л не приводило к повышению частоты регенерации (Хамукова, 1994).
В последнее время в качестве цитокинина используют тидиазурон. Он более эффективен, чем 6-БАП, при стимулировании процессов каллусообразования (Высоцкий, 1992), а также при пролиферации и регенерации адвентивных побегов из листьев некоторых древесных пород (Kerns, 1986; Read, 1992). Тидиазурон также более эффективен при получении регенерантов малины (Cousineau, 1991).
Тидиазурон хорошо себя зарекомендовал при получении регенерантов из меристематических тканей, а также из семядолей малины и ее гибридов (Hall, 1986). На различных генотипах была получена регенерация из листовых и стеблевых тканей (Graham, 1990, 1995). Для проявления наибольшего регенерационного потенциала малины хорошо себя зарекомендовал тидиазурон в концентрации 1 мг/л. (Fiola, 1990).
Методика получения регенератов ремонтантной малины
При оптимизации условий регенерации использовали листья укорененных пробирочных растений ремонтантной малины, которые предварительно были получены из апикальных меристем и размножены в лаборатории биотехнологии БГСХА. Пробирочные растения культивировались на питательной среде следующего состава: МС (Murashige and Skoog., 1962). Состав среды приведен в таблице 1. Среды готовили из концентрированных растворов макросолей (20 х), микроэлементов (100 х), Fe-хелата (200 х) и витаминов (100 х), добавляли инозит, сахарозу, агар (Difco), стерилизовали автоклавированием (1,2 атм, 20 мин.). рН среды доводили раствором NaOH. 6-БАП и ИМК добавляли перед автоклавированием. Посуду стерилизовали прокаливанием 25 минут или автоклавированием. Тидиазурон и антибиотики добавляли непосредственно перед использованием. Клональное микроразмножение проводили в присутствии 6-БАП 2 мг/л, укоренение побегов ИМК 0,5 мг/л. При приготовлении растворов гормонов использовали 96 % С2Н5ОН.
В опытах по регенерации изучали влияние гормональных факторов (тип цитокинина и его концентрация), влияние фотопериода, а также физиологических факторов на проявляемую регенерационную способность.
Источником эксплантов служили апикальные листья и черешки изолированные от укорененных in vitro растений. На изолированные листовые пластинки наносили поранения в области центральной жилки и помещали на питательную среду в пробирки Флоринского. Для повышения выхода регенерантов экспланты первые 10 дней выдерживали в темноте с последующим переносом на свет. После образования первых регенерантов периодически проводили учет вновь образующихся морфогенных структур. Спустя 1,5-2 месяца определяли конечное число образовавшихся побегов и их количество на эксплантах.
Выделение растительной ДНК по методу Дорохова и др., 1996. 1. Свежую растительную ткань в виде фрагмента листа (около 60 мг) или 1-2 листовых высечек, полученных при закрывании крышки пробирки типа Eppendorf объемом 1.5 мл (в этой пробирке проводили дальнейшее выделение ДНК), 2. Интенсивно гомогенизировали при комнатной температуре с использованием ручного тефлонового пестика в течение 30-40 с в 400 мкл экстракционного буфера (200 мМ трис-HCl, рН 7.5; 250 мМ NaCl; 25 мМ EDTA; 0.5% SDS). Гомогенизацию заканчивали интенсивным встряхиванием на Vortex в течение 5 секунд. 3. Пробирки помещали на водяную баню и проводили экстракцию 15 мин при 65С, периодически осторожно перемешивая содержимое пробирки. 4. После экстракции в пробирки добавляли по 200 мкл 5 М ацетата калия (предварительно охлажденного), тщательно перемешивали содержимое пробирки и инкубировали на ледяной бане 10 мин. 5. Пробирки центрифугировали при 16000 g 20 мин при комнатной температуре. 6. Осторожно отбирали 500 мкл супернатанта (следя за тем, чтобы не захватить частицы осадка) и переносили в чистую пробирку типа Eppendorf объемом 1.5 мл и добавляли 500 мкл изопропанола, тщательно перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 3-5 мин. На этой стадии можно наблюдать дисперсный осадок ДНК или образование, небольшой "медузы". 7. Содержимое пробирок центрифугировали при комнатной температуре при 16000 g в течение 10 мин. 8. Осадок промывали 65%-ным этанолом, охлажденным при -20С, и центрифугировали при 16000 g 10 мин. Последнюю процедуру проводили дважды. 9. Осадок ДНК подсушивали на столе, открыв крышки пробирок и растворяли в 100 мкл стерильной бидистиллированной и деионизиро-ванной воды.
Модифицированный метод выделения ДНК на основе вышеприведенной методики по Дорохову и др. 1. Свежую растительную ткань в виде листовой высечки, полученной при закрывании крышки пробирки типа Eppendorf объемом 1.5 мл, растирали тефлоновым пестиком в микропробирке объемом 1,5 мл и интенсивно гомогенезировали при комнатной температуре в 400 мкл экстракционного буфера (200 мМ Трис- НС1; рН 7.5; 250 мМ NaCl; 25 мМ ЭДТА; 0,5 % SDS; 0,1% 2-меркаптоэтанол; 2% поликлар AT; 50 мг/л о-третбутилоксианизол). 2. Экстрагировали на водяной бане при 65 С 15 минут. 3. После экстракции добавляли по 200 мкл 5 М КАс, инкубировали на ледяной бане 15 минут. 4. Центрифугировали 10-15 минут при 16000 оборотов в минуту. 5. Отбирали 400 мкл супернатанта и переносили в новую пробирку, 6. Добавляли 1 объем 20 % ПЭГ и оставляли при -20С в течении 5 минут.
Микроклональное размножение ремонтантных форм малины
Селекционная практика свидетельствует, что на создание нового сорта с учетом всех этапов его формирования в лучшем случае требуется 12-15 лет. При этом не учитывается время на дальнейшее размножение этих сортов в питомнике, откуда они должны поступить к потребителю.
Еще более длительным оказывается путь создания сортов малины с использованием межвидовой гибридизации, нередко необходимой для радикального совершенствования исходного материала. В этом случае часто приходится преодолевать трудности, связанные с плохой скрещиваемостью родительских форм, низкой фертильностью потомства, бесплодием. Требуется немало времени для подбора оптимальных экотипов и форм для гибридизации, проведений серий возвратных скрещиваний, неоднократного пересева семян от малоплодовитых гибридов, использование мутагенеза и других приемов.
Метод микроклонального размножения позволяет получить в сравнительно короткий срок необходимое количество генетически идентичных растений. Сроки создания и оценки новых ремонтантных форм можно сократить в 1,5-2 раза, размножив в течении года до необходимого количества и высадить на участок. В зависимости от генотипа срок размножения элит в полевых условиях может занять до 5 лет. По трем урожаям этой посадки дается оценка испытываемых форм в сравнении со стандартом и выделяются элиты для представления их в качестве нового сорта. Именно таким путем удается на 4-5 лет сократить сроки создания и подготовки к передаче в госсортоиспытание ряда межвидовых форм малины.
В таблице 18 показана возможная сравнительная эффективность закладки новых питомников ремонтантной малины на примере сорта Геракл. Исследуются производственные затраты при использовании стандартной методики микроклонального размножения и оптимизированной с применением регуляторов роста.
Как видно из представленной таблицы методики микроклонального размножения не рентабельны. Применение новых регуляторов роста в данном случае приводит только к уменьшению затрат. Отрицательная рентабельность, в данном случае, является не производство посадочного материала на реализацию, а ускорение селекционного процесса. Рентабельность будет положительной, если учесть сокращение затрат на выведение нового сорта и экономической эффект от его внедрения.
Показана высокая эффективность применения новых регуляторов роста негормональной природы (Эмистим, Цитрон, Кавказ, Крезацин) в процессе микроклонального размножения ремонтантной малины. Они стимулируют укореняемость растений в 1,5-2 раза и увеличивают коэффициент размножения на 20-50 %. Действующая концентрация препаратов на несколько порядков ниже, чем обычно используемые регуляторы гормональной природы и составляет 0,0003-0,0015 мг/л.
Применение хлорфенилпередилмочевины (CPPU) обеспечивает высокую приживаемость фрагментов почек при введении новых форм ремонтантной малины в культуру in vitro, свыше 90% даже для форм плохо приживающихся в присутствии TDZ. Оптимальная концентрация CPPU 0,2-1 мг/л.
Использование в качестве цитокинина CPPU при регенерации листовых эксплантов побегов ремонтантной малины обеспечивает повышение регенерации в 2-3 раза по сравнению с TDZ. Оптимальная концентрация CPPU 1 мг/л, что на порядок выше оптимальной концентрации TDZ.
Замена агар-агара на фитогель при культивировании ремонтантной малины в культуре in vitro нецелесообразна. Фитогель вызывает угнетение корнеобразования и значительную гибель растений на этапе размножения.
Потенциальная способность почек ремонтантной малины к размножению в культуре in vitro зависит от месторасположения почки на однолетних побегах замещения. С 1 по 5-7 почку наблюдается значительное увеличение коэффициентов размножения (примерно в 2 раза у сорта Бриллиантовой и на 30% у Геракла). После этого происходит небольшое снижение коэффициента в центральной части побега и начиная с 13-15 почки коэффициент размножения снова существенно возрастает до максимальных значений.
На 20 новых формах ремонтантной малины была подтверждена сцепленность признака ремонтантности и молекулярного маркера -межмикросателитного фрагмента длиной около 270 п. н. Введено в культуре in vitro и размножено 52 новых образца ремонтантной малины. В процессе работы выращено и передано на селекционный питомник 3772 растения малины адаптированных к почвенному субстрату. Рекомендации Препараты Эмистим, Цитрон, Кавказ в концентрации 0,0003-0,0015 мг/л рекомендуются использовать при микроклональном размножении на стадии укоренения побегов ремонтантной малины совместно с ИМК 0,5 мг/л. Препараты Крезацин, Цитрон, Кавказ в концентрации 0,0003 0,0015 мг/л рекомендуются использовать при микроклональном размножении на стадии размножения побегов ремонтантной малины совместно с БАП 2,0 мг/л. Рекомендуется использовать CPPU при введении в культуру in vitro эксплантов пазушных почек в концентрации 0,2-1 мг/л. Для стимуляции регенерации из листовых эксплантов рекомендуется использовать CPPU в концентрации 1 мг/л.
