Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 7
Глава 1. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНОФОНДА ДИКИХ СОРОДИЧЕЙ
ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ {Triticum aestivum L.) 17
Дикие сородичи мягкой пшеницы, как потенциальные доноры ценных признаков 18
Основные барьеры получения отдаленных гибридов пшеницы
и пути их преодоления 22
1.2.1. Влияние генов Кг на скрещиваемость 23
1.2.2 Естественная и искусственная гибридизация 24
1.3. Пути передачи генетического материала природных сородичей
мягкой пшенице 26
Передача генетического материала от видов с гомологичными геномами 27
Передача генетического материала от видов с гомеологичными
геномами 28
1. 3.2.1. Получение амфидиплоидов, дополненных и замещенных
линий 28
1.3.2.2. Методы получения линий с добавлением чужеродных
хромосом 30
1.3.2. 3. Получение линий с чужеродными замещениями хромосом 35
1.3.2.4. Передача чужеродного материала с помощью индукции
транслокаций и гомеологичной конъюгации 37
1.4. Передача ценных признаков от видов рода Triticum, Aegilops,
Agropyron и Secale 43
1.4.1. Передача ценных признаков от видов рода Triticum 43
1.4 Л. 1. Передача ценных признаков от Triticum timopheevii 44
1.4.2. Передача ценных признаков от видов рода Aegilops 47
1.4.2.1. Передача ценных признаков от Ае. speltoides 50
1.4.3. Передача ценных признаков от видов рода Agropyron 52
1.4.4. Передача ценных признаков от видов рода Secale 58
1.5. Методы идентификации чужеродного генетического материала в
геноме пшеницы 63
Влияние чужеродных хромосом на фенотипические признаки мягкой пшеницы 63
Цитологические методы идентификации чужеродных хромосом в
геноме пшеницы 66
1.5.3. Молекулярные методы идентификации чужеродного генетичес
кого материала в геноме пшеницы 68
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ 74
Характеристика сортов реципиентов и синтетических форм-источников хозяйственно-ценных признаков дикорастущих сородичей..74
Методы передачи и оценки материала по устойчивости к болезням
и другим ценным хозяйственно-биологическим признакам 78
Идентификация и локализация генов устойчивости к листовой ржавчине 81
Цитологические методы исследований 82
2.5.Метод электрофореза глиадина в крахмальном геле 83
2.6. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма ДНК
интрогрессивных линий 84
Выделение геномной ДНК 84
PCR - анализ линий пшеницы 86
Глава 3. СОЗДАНИЕ, ПОДДЕРЖАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ КОЛЛЕКЦИИ
ДИКОРАСТУЩИХ СОРОДИЧЕЙ ПШЕНИЦЫ 87
Глава 4. СИНТЕТИЧЕСКИЕ ФОРМЫ ПШЕНИЦЫ 95
Геномно-добавленные и геномно-замещенные синтетические формы 95
Рекомбинантные синтетические формы 101
Глава 5. ПЕРЕДАЧА ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДИКИХ
СОРОДИЧЕЙ ОТ СИНТЕТИЧЕСКИХ ФОРМ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЕ 107
5.1. Передача генетического материала от геномно-добавленной формы
Т. miguschovae 107
Передача генетического материала Ае. speltoides от геномно-замещенной формы Авродес 116
Передача генетического материала Ae.umbellulata мягкой пшенице через синтетическую форму Авролата 122
Передача генетического материала пырея Agwpyron glaucum в мягкую
пшеницу на основе синтетической формы Аврокум 133
Глава 6. СОЗДАНИЕ СЕРИЙ ЧУЖЕРОДНО-ЗАМЕЩЕННЫХ ЛИНИЙ
С ХРОМОСОМАМИ Ae.umbellulata И Ag. glaucum 140
Идентификация чужеродных хромосом у замещенных линий, выделенных в гибридной популяции (Авролата х Аврора) 140
Идентификация чужеродных хромосом у замещенных линий,
выделенных в гибридной популяции (Аврокум х Аврора) 148
Глава 7. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ УСТОЙЧИВОСТИ
ИНТРОГРЕССИВНЫХ ЛИНИЙ К ЛИСТОВОЙ РЖАВЧИНЕ 154
7.1. Генетический анализ устойчивости к листовой ржавчине линий,
полученных на основе синтетических форм Т. miguschovae и Авродес... 157
Фитопатологический тест 158
Гибридологический анализ 162
Анализ результатов скрещивания устойчивых линий с восприимчивым сортом Аврора 162
Анализ результатов скрещивания между устойчивыми линиями 164
Анализ результатов скрещивания устойчивых линий с тестер-ными линиями, несущими известные эффективные гены 166
7.2. Генетический анализ устойчивости к листовой ржавчине замещен
ных линий, полученных на основе синтетической формы Авролата 168
Глава 8. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ЛИСТОВОЙ
РЖАВЧИНЕ У ПОЛУЧЕННЫХ ЛИНИЙ 172
5 8.1 Моносомный анализ устойчивости к листовой ржавчине у линии
МК377, полученной на основе Т. miguschovae 174
8.2. Моносомный анализ устойчивости к листовой ржавчине у линии
АА688, полученной на основе геномно-замещенной формы Авродес 178
Глава 9. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ГЛИАДИНА
ПОЛУЧЕННЫХ ЛИНИЙ 181
9.1. Идентификация формулы глиадина и оценка по содержанию белка и
клейковины у интрогрессивных линий с генетическим материалом
Т. miguschovae и Авродес 182
9.2. Идентификация формулы глиадина и оценка по содержанию белка и
клейковины у чужеродно-замещенных линий с генетическим материалом
пырея Agropyron glaucum и эгилопса зонтичного Aegilops umbellulata 184
Глава. 10 PCR-АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ ИНТРОГРЕССИВНЫХ
ЛИНИЙ 187
10.1.Анализ интрогрессивных линий пшеницы с материалом синтети
ческих форм Т. miguschovae и Авродес, методом RAPD-PCR 188
10.2. Идентификация генов устойчивости к листовой ржавчине у замещеных
линий с генетическим материалом Ag. glaucum методом PCR-анализа 195
Глава 11. ХОЗЯЙСТВЕННО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПОЛУЧЕН
НЫХ ЛИНИЙ 197
Устойчивость интрогрессивных линий к болезням 198
Характеристика линий по морфо-биологическим признакам 208
Линии, полученные с участием Т. miguschovae и Авродес 209
Линии, с полученные с участием Авролата и Аврокум 212
Продуктивность интрогрессивных линий 216
Технологические качества зерна и муки полученных линий 219
Оценка линий по содержанию белка и клейковины 220
Оценка линий по хлебопекарным качествам 224
11.4.2.1.Линии, полученные на основе синтетических форм T.miguschovae и
Авродес 225
11.4.2.2. Линии, полученные на основе синтетических форм Авролата и
Аврора 227
Глава 12. СЕЛЕКЦИЯ СОРТОВ ОЗИМОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С
«ПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКИХ ФОРМ 230
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 239
ВЫВОДЫ 243
РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ 247
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 249
ПРИЛОЖЕНИЕ 296
Введение к работе
К сожалению, запаса генетического материала самой мягкой пшеницы недостаточно для решения этой проблемы [Feldman, Sears, 1981; Hope et al., 1984; Kimber, 1984;]. Более того, ее генофонд был в значительной степени обеднен из-за широкого распространения однотипных сортов с перекрывающимися родословными. В особенности это касается генов устойчивости к болезням, ограничение разнообразия которых является одним из основных лимитирующих факторов селекции.
Неисчерпаемый резерв хозяйственно-ценных признаков для улучшения
этой главной продовольственной культуры земного шара представляет собой генофонд многочисленных родственных мягкой пшенице видов и родов [Вавилов, 1935; Мигушова, 1973; Чикида Н. А., 2001; Fedak, 1985; Shepherd, Islam, 1988]
Многие из них были с успехом использованы для передачи полезных признаков в мягкую пшеницу [Скурыгина Н.А., 1979; Zeller and Hsam., 1983; Knott, 1987; Jiang et al., 1994]. Так, в настоящее время значительная часть эффективных генов устойчивости к болезням происходит из этого генофонда
8 [Mcintosh et al., 1995b, 1998]. Поэтому первостепенной задачей является поддержание и всесторонняя оценка коллекций дикорастущих сородичей пшеницы и реликтовых форм.
Вовлечение генетических ресурсов диких сородичей в селекционный процесс требует, в свою очередь, поиска наиболее рациональных подходов их использования и сохранения.
Существует лишь небольшое число сородичей пшеницы, чьи хромосомы способны конъюгировать с хромосомами пшеницы и, следовательно, чьи полезные гены могут быть переданы пшенице обычными селекционными методами. Для большинства же необходимо использование специальных приемов геномной и хромосомной инженерии с тем, чтобы их генетическое разнообразие преобразовать в форму, доступную для традиционной селекции [Sears, 1972; Feldman, Sears, 1981; Knott, 1987; Feldman, 1988].
В связи с этим разработка и использование эффективных методов сохранения и использования генофонда дикорастущих сородичей в улучшении мягкой пшеницы принадлежит к числу наиболее актуальных проблем генетики и селекции.
Одним из таких методов является создание и использование синтетических геномно-замещенных и геномно-добавленных форм в качестве «мостиков» для передачи генетического материала диких сородичей. Следует также отметить актуальность сохранения генофонда диких сородичей в виде синтетических форм.
Кербер и Дик впервые показали принципиальную возможность замены субгенома D мягкой пшеницы на геномы других видов [Kerber, Dick, 1969]. Опираясь на такую возможность, в лаборатории цитогенетики КНИИСХ под руководством Е. Г. Жирова был разработан оригинальный подход по
перестройке генома мягкой пшеницы. Путем замещения генома твердой пшеницы на геномы ААВВ мягкой были получены тетраплоидные компоненты сортов Аврора, Саратовская 29 и Кальянсона. С использованием
9 тетракомпонентов в конце семидесятых годов были созданы новые синтетические геномно-замещенные формы, у которых геном D мягкой пшеницы был замещен соответственно на геномы Ае. speltoides, Ае. sharonensis, Ае. umbellulata, Ае. uniaristata, S. cereale Ag. glaucum, Т. boeoticum, и Т. sinskajae. Кроме этого были получены геномно-добавленные формы, у которых геном D от Ае. tauschii был добавлен соответственно к геномам AG от Т. militinae и АВ от твердой пшеницы Mutico italicum. (Жиров Е. Г., 1989).
Определение возможностей таких синтетических форм для расширения генетической изменчивости мягкой пшеницы имеет большое практическое и теоретическое значение. Особый интерес представляет создание новых ре-комбинантных синтетиков с уникальными сочетаниями геномов двух диких видов на фоне геномов А и В культурной пшеницы, серий чужеродно-замещенных линий. Такие формы и серии открывают новые перспективы в изучении взаимоотношений геномов культурной пшеницы и ее сородичей, модификации генома мягкой пшеницы.
Всестороннее цитологическое, биохимическое и молекулярное исследование полученных интрогрессивных линий с генетическим материалом от разных видов диких сородичей позволит определить закономерности передачи чужеродной генетической информации мягкой пшенице, наиболее приемлемые пути их использования в селекционной практике. Постоянно актуальными являются идентификация и локализация генов устойчивости у производных линий, изучение и характеристика их в отношении других ценных хозяйственно-биологических признаков.
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования являлось изучение возможности сохранения генофонда дикорастущих сородичей и его использования для расширения генетического разнообразия мягкой пшеницы на основе оригинальных синтетических геномно-замещенных и геномно-добавленных форм.
10 Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:
1. Создать, изучить и сохранить коллекцию диких сородичей мягкой
пшеницы и синтетических геномно-добавленных и геномно-замещенных
форм.
2. Дать характеристику синтетических геномно-добавленных и
геномно-замещенных форм как источников хозяйственно-ценных признаков
для мягкой пшеницы.
3. Создать на основе геномно-добавленных и геномно-замещенных
форм новые рекомбинантные синтетические образцы.
Отобрать цитологически стабильные интрогрессивные линии мягкой пшеницы с генетическим материалом Т. miguschovae, Ае. speltoides, Ае. ит-bellulata и Ag. glaucum.
Установить форму передачи генетического материала Т. miguschovae, Ае. speltoides, Ае. umbellulata и Ag. glaucum мягкой пшенице.
Получить серии чужеродно-замещенных линий с хромосомами Ае. umbellulata и Ag. glaucum.
Изучить наследование и идентифицировать гены устойчивости к листовой ржавчине у полученных линий.
Локализовать гены устойчивости к листовой ржавчине у линий с генетическим материалом синтетических форм Т. miguschovae и Авродес.
Идентифицировать формулы глиадина у изучаемых линий.
10. Провести PCR-анализ с целью изучения полиморфизма ДНК интро-
грессивных линий.
11. Дать оценку интрогрессивным линиям по хозяйственно-ценным
признакам (устойчивости к болезням, компонентам урожайности, содержа
нию и качеству белка, хлебопекарным характеристикам). Изучить линии по
морфо-биологическим признакам.
12. Создать на основе полученных интрогрессивных линий новые сорта
озимой мягкой пшеницы.
Научная новизна. Выделено 57 образцов Aegilops, 18 Triticum с комплексной устойчивостью к листовой, желтой ржавчинам и мучнистой росе.
Впервые для передачи хозяйственно-ценных признаков от 71 militinae, Ae. squarrosa, Ae. speltoides, Ae. umbellulata и Ag. glaucum, вместо природных сородичей использованы синтетическая геномно-добавленная Т. miguschovae и геномно-замещенные формы Авродес, Авролата и Аврокум.
Показана ценность этих форм как источников хозяйственно-ценных признаков мягкой пшеницы. Установлено, что синтетические формы на протяжении многих лет остаются константными по своим морфо-биологическим признакам и имеют высокую цитологическую стабильность.
Предложена новая схема передачи полезных признаков диких сородичей в мягкую пшеницу.
Впервые созданы новые, не имеющие аналогов синтетические формы, у которых геном D мягкой пшеницы замещен на смешанный (рекомбинант-ный) геном двух диких видов.
Получены новые мейотически стабильные линии с генетическим материалом Т. miguschovae, Ae. speltoides, Ae. umbellulata и Ag. glaucum. С помощью цитологического анализа показано, что он от синтетических форм Т. miguschovae и Авродес в большинстве случаев передаётся посредством транслокаций, от Авролата и Аврокум - посредством замещенных хромосом.
Впервые созданы неполные серии замещенных по геному D линий сорта Аврора с хромосомами Ae. umbellulata и Ag. glaucum. Определены морфо-биологические изменения у замещенных линий и маркерные признаки замещенных хромосом.
Выделены замещенные линии с высоким содержанием белка и улучшенным его качеством по сравнению с сортом Аврора.
Идентифицированы формулы глиадина, установлен широкий спектр изменений глиадинкодирующих аллелей.
Методом PCR-анализа показан полиморфизм ДНК у изучаемых линий.
Определено, что устойчивость к листовой ржавчине у используемых синтетиков контролируется набором доминантных и рецессивных генов, при этом они могут проявлять свое действие, как в фазу проростков, так и во взрослой стадии.
Исследуемые нами линии различаются между собой как по числу генов устойчивости к листовой ржавчине, так и по характеру их проявления.
Идентифицированы и локализованы новые гены устойчивости к листовой ржавчине. Установлено, что гены устойчивости у линий различаются между собой и отличны от известных эффективных - Lrl9, Lr24 uLr9
. Проведена оценка интрогрессивных линий по хозяйственно-ценным признакам. Выявлено свойство синтетических форм передавать устойчивость одновременно к нескольким грибным болезням (листовая, стеблевая, желтая ржавчины, мучнистая роса, фузариоз колоса).
Выделены линии с высоким содержанием белка и клейковины.
Отобраны линии, сочетающие комплексную устойчивость к трем и более болезням с неплохими морфо-биологическими признаками и хлебопекарными качествами зерна.
Создано четыре новых сорта озимой мягкой пшеницы.
Практическая значимость работы заключается в том, что созданные линии представляют собой ценный исходный материал с широким спектром новых доноров устойчивости к комплексу грибных болезней, повышенного содержания белка и клейковины, улучшенными технологическими свойствами зерна, неосыпаемости его при созревании. Линии, сочетающие хорошие хлебопекарные качества с комплексной устойчивостью к болезням, рекомендованы для испытания на урожайность с целью возможного их использования в качестве сортов. Линии с идентифицированными генами устойчивости к листовой ржавчине могут быть включены в селекционные программы по устойчивости к этой болезни. Многие линии широко используются в селекционных программах КНИИСХ и находятся на
13 различных этапах селекционного процесса. Создано четыре сорта озимой мягкой пшеницы: Жировка, Фишт, Восторг и Евгения.
Отобраны образцы Aegilops и ТгШсит с устойчивостью к комплексу болезней. Новые рекомбинантные синтетические формы представляют интерес как источники модификации генома мягкой пшеницы, открывают новые возможности в изучении взаимоотношений геномов культурной пшеницы и ее сородичей.
Практический интерес представляет методический подход к получению чужеродно-замещенных и транслокационных линий. Коллекция синтетических форм, чужеродно-замещенных и транслокационных линий может быть также использована для молекулярно-генетических исследований.
Из 4 праймеров, используемых в RAPD-PCR анализе, отобраны 2- рб и р8, как выявляющие наибольший полиморфизм ДНК исследуемых линий.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Результаты оценки коллекционных образцов Aegilops и ТгШсит по устойчивости к листовой, желтой ржавчинам и мучнистой росе. Лучшими в этом отношении являются виды Ae. speltoides (геном S), Ae. triaristata (UMr), Ae. recta (UMrN), Ae. caudata (С). Определена положительная связь на эти признаки геномов U, S и С, и отрицательная - генома D.
Синтетические геномно-замещенные и геномно-добавленные формы позволяют существенно реконструировать геном мягкой пшеницы, упрощают сохранение и использование генофонда ее природных сородичей.
Создание новых рекомбинантных синтетических форм и неполных серий, замещенных по геному D линий сорта Аврора с хромосомами Ае. umbellulata и Ag. glaucum
4. Синтетические формы Т. miguschovae, Авродес, Авролата и
Аврокум-ценные источники полезных признаков Т. militinae, Ae. squarrosa,
Ae. speltoides, Ae. umbellulata и Ag. glaucum. Полученные на их основе
интрогрессивные линии отличаются генетическим разнообразием, обладают
14 целым рядом ценных признаков и представляют большой интерес для селекции.
5. Характеристика сортов, созданных с использованием полученных линий.
Апробация работы. Исследования проведены в соответствии с планом научно-исследовательских работ КНИИСХ, по теме Н.01.01. «Разработать, усовершенствовать и применить методы геномной и хромосомной инженерии для улучшения и создания ценного селекционного материала», номер государственной регистрации 01.200.1. 15506. Соискатель является научным руководителем проводимых работ.
Основные результаты исследований ежегодно докладывались на ученых советах КІіИИСХ с 1993 по 2005 год, а также на научно-пракических конференциях:
Всесоюзной научно-технической конференции молодых ученых «Современные проблемы генетики и селекции сельскохозяйственных растений», Одесса, 1991;
Всесоюзной конференции «Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды», Иркутск, 1991;
На IX Всесоюзном совещании по иммунитету растений к болезням и вредителям, Минск, 1991;
На научно-координационном совещании по проекту «Доноры и генколлекции растений» ГНТП России «Перспективные процессы производства сельскохозяйственной продукции», Санкт-Петербург, 1992;
На II Российском симпозиуме «Новые методы биотехнологии растений», Пущино, 1993;
На 9-ой конференции европейского общества по анеуплоидам пшеницы, Гетерслебен, 1994;
Пятой Международной конференции по пшенице, Анкара, 1996;
На научной конференции «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 1996;
На 7-ой Международной конференции «Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда», Москва, 1997;
На Совместном заседании проблемного Совета по качеству зерна и секции селекции озимой пшеницы отделения растениеводства РАСХН, Краснодар, 1998;
На 11-ой Конференции европейского общества по анеуплоидам пшеницы, Новосибирск, 2000;
Международном симпозиуме «Улучшение пшеницы по устойчивости к фузариозу», Китай, 2000;
Научно-практической конференции «Зеленая революция П.П. Лукьяненко», Краснодар, 2001;
На Международной конференции «Проблемы интродукции растений и отдаленной гибридизации», Москва, 1998;
Международной научно-практической конференции «Пути повышения и стабилизация производства высококачественного зерна», Краснодар, 2002;
На первой Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям, Санкт-Петербург, 2002;
На Международной научно-практической конференции «Генетические ресурсы культурных растений», Санкт-Петербург, 2001;
На третьем Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» Москва, 2004;
Международной научно-практической конференции «Безостая 1 - 50 лет триумфа», Краснодар, 2005;
На заключительной конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и администрации Краснодарского края, Краснодар, 2005.
Публикации. Основные положения диссертации изложены в монографии, в 40 опубликованных научных работах и подтверждены 3 авторскими свидетельствами на сорта озимой мягкой пшеницы.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 320 страницах машинописного текста, состоит из введения, 12 глав, выводов, рекомендаций, списка литературы, содержит 76 таблиц и 33 рисунка. Список литературы содержит 464 источников, из них - 117 отечественных и 347 зарубежных.
Работа посвящена светлой памяти Жирова Евгения Григорьевича-основоположника исследований по цитогенетике пшеницы в КНИИСХ. Автор выражает глубокую благодарность и признательность всем соавторам, коллективу лаборатории биотехнологии, д.с.-х.н. члену-корреспонденту РАСХН Л.А.Беспаловой, д.с.-х.н. А.А. Романенко за помощь и поддержку в проведении настоящего исследования.
