Содержание к диссертации
Введение
1 Состав токоферолов семян как селекционный признак
1.1 Биохимия токоферолов 6
1.2 Генетика токоферолов у растений 9
1.3 Селекционное использование мутаций состава токоферолов у подсолнечника 14
1.4 Способы гибридизации подсолнечника 19
2 Условия, материал и методы исследования 22
3 Тест на аллелизм мутаций состава токоферолов 31
4 Гибридологический анализ экспрессивности мутации tphl в различных генотипических средах
4.1 Характеристика родительских форм 34
4.2 Получение гибридов Fj 37
4.3 Наследование состава токоферолов в Fi и F2 45
5 Генетическая коллекция линий по составу токоферолов в семенах
5 1 Константные линии с различной экспрессивностью мутаций состава токоферолов 48
5.2 Идентификация экспрессивности мутации tphl в различных частях растения 51
5.3 Тест на сцепление мутаций tphl и tph2 с геном устойчивости к имидазолиноновым гербицидам 54
5.4 Окислительная стабильность экспериментальных масел 57
Выводы 63
Рекомендации для селекционной практики 65
Список литературы 66
Приложение
- Биохимия токоферолов
- Условия, материал и методы исследования
- Тест на аллелизм мутаций состава токоферолов
- Характеристика родительских форм
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из важных проблем улучшения качества масла подсолнечника является повышение его устойчивости к окислению с целью предотвращения накопления токсичных веществ, образующихся при деструкции липидов
Разработка генетических основ селекции на увеличение окислительной стабильности масла учитывает, что этот признак определяется многими факторами различной природы К числу наиболее значимых эндогенных факторов, наряду с составом жирных кислот, относится наличие естественных антиоксидантов, препятствующих процессу свободнорадикального окисления липидов Токоферолы (витамин Е) являются группой жирорастворимых веществ, препятствующих окислению и синтезируемых растительными организмами
Увеличение содержания сильных в антиоксидантном отношении форм токоферолов селекционными методами представляет собой перспективное направление в улучшении качества масла семян подсолнечника
Известны четыре основные формы токоферолов - а, р, у и 5, в ряду которых увеличивается антиокислительная активность Обычный генотип подсолнечника характеризуется преобладающим содержанием а-формы в составе токоферолов около 95% Генетический контроль признака осуществляется двумя генами Tphl и Tph2 Рецессивные аллели этих генов вызывают в гомозиготе повышенное содержание Р и у-токоферолов соответственно Мутантная дигомозигота приводит к повышеному накоплению 5-формы
Установлено, что мутация tphl обладает стабильным фенотипическим проявлением в различных генотипических средах, тогда как экспрессивность мутации tph2 существенно зависит от генотипической среды
Различная экспрессивность мутации tph2 выражается в варьировании содержания у-формы в токоферольном комплексе от 20 до 95% Уменьшение экспрессивности мутации tph2 приводит у двойной рецессивной гомозиготы к одновременному появлению всех четырех форм токоферолов в одном фенотипе.
Испанские ученые создали новые мутантные линии с наследственно измененным токоферольными профилями в семенах подсолнечника.
Генетическая идентификация полученных в разных странах мутаций состава токоферолов, а также изучение стабильности проявления этого признака в различных генотипических средах является актуальной селекционно-генетической задачей.
Цель и задачи исследований. Цель работы - провести генетическую идентификацию мутаций состава токоферола в семенах подсолнечника
Для этого необходимо решение следующих задач.
-
Провести функциональный и рекомбинационный тест на аллелизм известных мутаций состава токоферолов tphl и tph2 с вновь обнаруженными генотипическими изменениями
-
Изучить наследование экспрессивности tph2 в различных генотипических средах.
-
Создать генетическую коллекцию константных линий с различной экспрессивностью мутаций состава токоферолов
-
Исследовать экспрессивность мутаций в различных органах растения
-
Провести тест на сцепление tphl и tph2 с геном устойчивости к имидазолиноновым гербицидам.
-
Оценить влияние состава токоферолов на окислительную стабильность масел.
7 Разработать эффективный способ гибридизации
подсолнечника Научная новизна исследования.
1 Впервые установлена аллельность известных мутаций состава токоферолов в семенах tphl и tph2 вновь обнаруженным генотипическим вариациям испанских линий Т589 и Т2100 соответственно
2. На основе гибридологического анализа доказано аддитивное действие генов, контролирующих варьирующую экспрессивность мутации tph2 в различных генотипических средах
3 Выраженность мутации tph2 не проявляется в корне, гипокотиле, листе и пыльце, тогда как варьирующая экспрессивность двойной рецессивной гомозиготы идентифицируется только в корне и гипокотиле
4 Обнаружено независимое наследование мутаций состава токоферолов и гена, контролирующего устойчивость к имидазолиноновым гербицидам.
Практическая ценность результатов.
Созданная генетическая коллекция линий подсолнечника с различным составом токоферолов, включающая аналоги селекционных линий, содержит доноры для селекции на качество масла Линия-восстановитель фертильносте пыльцы ВК588 с повышенным содержанием у-токоферола в семенах включена в селекционные программы создания гибридов подсолнечника как отцовская форма Установлено влияние генотипической среды на варьирующую экспрессивность мутации tph2, изменяющую состав токоферолов и оксистабильность масла. Разработан способ получения гибридов подсолнечника на основе фотопериодической мужской самостерильности в условиях камер и теплиц фитотрона
Основные положения, выносимые на защиту.
Характеристика генетической коллекции константных линий подсолнечника с идентифицированными мутациями состава токоферолов tphl и tph.2,
Аддитивный генетический контроль различной экспрессивности мутации tphl
Апробация работы и публикация результатов
исследования.
Результаты работы докладывались на международной научной конференции молодых ученых и специалистов "Актуальные вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур", 28-30 марта 2005 г Краснодар, ВНИИМК, на международных конференциях по подсолнечнику - X FAO 2005 (Нови Сад, Сербия), SUNBIO 2003 (Севилья, Испания) и 2006 (Генгенбах, Германия), на ежегодных отчетно-плановых сессиях ВНИИМК в 2003-2006 гг Работа получила грантовую поддержку регионального конкурса РФФИ с 2006 г (№ 06-04-96633)
По материалам диссертации опубликовано шесть научных статей Кроме того, получены два авторских свидетельства на селекционное достижение и изобретение
Обьем и структура работы. Диссертация изложена на 90 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, выводов, рекомендаций для селекционной практики, списка
литературы, 9 приложений, включает 31 таблицу и 10 рисунков. Список библиографических источников содержит 152 наименований, в том числе 54 - иностранных
Материалы и методы
Исследования проводили на центральной экспериментальной базе (ЦЭБ) ВНИИ масличных культур им ВС Пустовойта (ВНИИМК), г Краснодар в лаборатории генетики в 2003-2007 гг
Почвы опытных полей представлены сверхмощным, слабогумусным, выщелоченным черноземом характеризующегося гумусным горизонтом, достигающим 150-180 см Содержание гумуса в верхних горизонтах колеблется от 4 до 6 %, а на глубине 150-200 см-0,1-1,0%
Средняя сумма осадков за год в зоне Краснодара составляет 643 мм, в летние месяцы их выпадает около 180 мм
Температура воздуха летних месяцев в годы проведения экспериментов была оптимальна для подсолнечника и составляла 25,7С
Материалом исследований служили формы культурного подсолнечника- сорта селекции ВНИИМК Мастер и Фаворит, мутантные инбредные линии генетической коллекции ВНИИМК с измененным составом токоферолов - ЛГ15 {tphltphl), ЛГ17 {tph2tph2), ЛГ24 {tphltphl, tph2tph2\ ЛГ25 , ОЮГ), BK876{tphltphl, tph2tph2, OlOl), селекционные родительские формы - BK464, BK639, BK678, BK580, BK541, BK 175, ВК571, ВК653, ВК591, мутантные испанские образцы с измененным профилем токоферолов - Т589 и Т2100, линия генетической коллекции Департамента сельского хозяйства США, обладающая устойчивость к группе имидозолиноновых гербицидов - НА425
Растения выращивались как в полевых опытах на делянках при расстановке 70 х 35 см, так и в камерах фитотрона Самоопыление и гибридизацию проводили общепринятыми методами
Состав токоферолов определяли тонкослойной
хроматографией с окрашиванием по методу Эммери-Энгеля, т е по продуктам, которые образуются при восстановлении токоферолами трехвалентного хлористого железа и последующего взаимодействия двухвалентного атома железа с а, а- дипиридилом
Общее содержание токоферолов в масле определяли колориметрическим способом
Оценку состава жирных кислот в масле проводили в виде их метиловых эфиров с помощью газожидкостной хроматографии Для этого использовался хроматограф Хром-5 с пламенно ионизационным детектором и интегратором
Содержание свободных жирных кислот в масле, характеризуемое величиной кислотного числа, определяли стандартным титриметрическим способом
Окисление масел проводили на приборе Rancimat 743 при 120С, который управлялся персональным компьютером Оценочный алгоритм программы определяет точку перегиба кривой и индукционный период автоматически
Проверка соответствия экспериментальных расщеплений в F2 теоретическим моделям проводилась с помощью %2 критерия Пирсона Полученные результаты обрабатывали с использованием компьютерной программы STATISTICA 6 0 (основные описательные статистики) и программы Excel
Биохимия токоферолов
Химическое строение. Токоферолы - витамины группы Е - относятся к природным производным хромана и представляют собой ряд веществ сходного строения, различающихся числом и положением метальных групп при фенольном кольце молекулы, а- форма (5,7,8 триметилтокол) отличается от (3- (5,8 диметилтокол) и у- (7,8 диметилтокол) форм, являющихся изомерами, одной метальной группой и от б-формы (8 метилтокол) - двумя метальными группами (рис. 1.1) [5, 95]. Всего известно восемь форм токоферолов, обладающих витаминной активностью, причём если ранее витамином Е считали только наиболее активный а-токоферол, то позднее этим термином стали обозначать всю группу природных и синтетических токоферолов, обладающих в различной степени активностью а-токоферола [15,45,46].
Локализация. Токоферолы широко распространены в природе, но синтезируются только растениями [60, 96, 113]. Много токоферолов содержится в фотосинтезирующих клетках [100, 112], где а-токоферол локализован в мембранах тилакоидов хлоропластов [4,8,128]. В растениях токоферолы сопутствуют маслам, поэтому в запасающих липиды тканях плодов они обнаруживаются в большом количестве [61, 76, 88, 121]. Так, например, зародыш в зерне кукурузы, содержащий запасающие масло клетки составляет только 12% массы. Но в нем находится более 90 % токоферолов всего зерна [110,135].
Животные витамин Е синтезировать не могут, и в организм токоферолы попадают только из пищи. У животных витамин Е содержится в органах, в мышцах, а также и подкожной жировой ткани [96]. Причем в клетках млекопитающих и птиц встречается почти исключительно а-токоферол, хотя в растительной пище, хиломикронах лимфы и липопротеидах плазмы крови присутствуют все формы витамина Е. Объясняют это явление селективным действием токоферол-связывающего белка в клетках печени [115, 123].
Функции. Токоферолы являются сильными естественными антиоксидантами, препятствующими перекисному окислению липидов путем инактивации свободных радикалов жирных кислот [18, 94, 98]. Это свойство лежит в основе разнообразных функций токоферолов: антиоксидантной в растительных маслах [63, 67, 126] и животных жирах и витаминной (биологической) в организмах животных и человека [1, 49, 133]. Токоферолы защищают липидные структуры органоидов клеток покоящихся семян от разрушения [128]. С уменьшением содержания витамина Е понижается всхожесть семян. Кроме того, предполагается, что токоферолы могут стабилизировать биологические мембраны путем физико-химического взаимодействия между их фитильной боковой цепью и остатками ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов [43, 48, 60].
Имеются многочисленные доказательства токоферольной защиты от окисления полярных липидов мембран хлоропластов в фотосинтезирующих клетках [8, 124, 138] и масле, извлеченного из семян растений [62, 126, 104], то есть в тех случаях, когда токоферолы и жирные кислоты непосредственно контактируют друг с другом [137, 139]. Так как токоферолы синтезируются и накапливаются в пластидах, а запасаемое масло депонируется в сферосомах, то пространственная разобщенность этих веществ в клетке может привести к тому, что токоферолы не смогут вносить вклад в антиоксидантную защиту жирных кислот запасных триглицеридов в семенах [58, 64, 100].
Еще в 1951 г. E.L.Hove пытался объяснить межвидовую изменчивость содержания токоферолов в маслах 15 - видов растений и жирах 7 видов животных с позиции биологической целесообразности, как результата положительной корреляции общего содержания токоферолов с концентрацией полиненасыщенной линолевой кислоты [118].
Изменение химического строения токоферолов, сопровождающееся перераспределением плотности электронных связей в гетероциклической части молекулы, приводит к существенному воздействию на свойства токоферолов. Как результат, в ряду а-, 3-,у- и 5 токоферолов происходит инверсия витаминной и антиоксидантной активностей, оцениваемая в следующих отношениях 1.00/0.40/0.08/0.01 и 1.0/1.3/1.8/2.7 соответственно [60,62,132].
Обычная смешанная диета, используемая в питании человека, содержит достаточное количество витамина Е (около 12- 25 мг в день). При нормальном питании авитаминозы и гиповитаминозы Е возникают редко [60].
Плоды возделываемых масличных растений содержат в различных соотношениях четыре основные формы токоферолов: а, р, у и 5, при размахе варьирования общего количества токоферолов в масле от 160 до 1100 мг/кг [77]. Для подсолнечника, сафлора и маслины характерно преобладание в составе а-, для клещевины - 5-, а для остальных масличных растений - у-формы. (3- токоферол присутствует в небольшом количестве или не обнаруживается [88, 97, 115, 130]. Содержанием (3- формы в токоферольном комплексе отличается только масло из зародышей пшеницы [61].
Изучение внутривидовой, в частности, межпопуляционной изменчивости состава токоферолов в семенах масличных растений [152] показывает незначительные отклонения этого признака от видоспецифической нормы у различных сортов подсолнечника, горчицы, льна. В сортах масличного подсолнечника размах варьирования а-формы в составе токоферолов - от 81 до 97%, р+у- изомеров - от 3 до 10%, у льна 5-формы - от 0 до 9% [76] при общем содержании токоферолов около 700 мг/кг масла [34, 70, 71].
Наиболее полные данные получены при изучении онтогенетической изменчивости состава токоферолов, рассматриваемой в двух аспектах. Во-первых, при созревании семян на фоне постоянного накопления токоферолов обнаруживается закономерное увеличение доли максимально метилированной а- формы в составе токоферолов, например, у подсолнечника с 74 до 92% [76] и у конопли - с 37 до 65% [14]. Это явление расценивается как подтверждение биосинтеза а- формы из других токоферолов, доля которых при созревании семян уменьшается [105]. Во-вторых, при прорастании семян и образовании побегов наблюдается аналогичное изменение признака в сторону увеличения доли а- формы, поэтому независимо от состава токоферолов семян в листьях подсолнечника, сои, люпина, пшеницы [136] и календулы [119] преобладает а- форма.
Известна также и модификационная изменчивость состава токоферолов. Так состав токоферолов в масле семян позднеспелых сортов кукурузы [99, 103, 134] и образцов конопли, выращенных в южных районах бывшего Советского Союза [14], характеризовался повышенным содержанием а- формы. Вероятно, этот факт объясняется влиянием температуры в период созревания семян и биосинтеза токоферолов. Например, в контролируемых условиях среды камер фитотрона доля а- формы и общее содержание токоферолов в листьях календулы положительно коррелировали с температурой выращивания в пределах от 20 до 29 С [111, 119].
В семенах сортов, инбредных линий, коллекционных образцов ВИР, а также дикорастущих видов подсолнечника токоферольный комплекс включает а-, Р- и у- формы с явным преобладанием а-токоферола. Содержание а-формы, в среднем, около 96% с пределами варьирования от 89 до 99%. б-токоферол при тонкослойной хроматографии не наблюдался [26].
В 1983 году при самоопылении растений сорта ВНИИМК 8931ул. обнаружен в гетерозиготе мутантный рецессивный аллель гена, обозначенного TphJ, приводящий в гомозиготе к скачкообразному увеличению содержания Р-формы в составе токоферолов. Фенотип полученной инбредной линии ЛГ15, гомозиготной по мутантному аллелю tphl, около 50% а- и 50% Р-токоферола [22, 29, 78].
Условия, материал и методы исследования
Исследования проводили на центральной экспериментальной базе (ЦЭБ) ВНИИ масличных культур им. B.C. Пустовойта (ВНИИМК), г. Краснодар в лаборатории генетики в 2003-2007 гг. Почвы опытных полей института представлены сверхмощным, слабогумусным, выщелоченным черноземом, который характеризуется гумусным горизонтом, достигающим 150-180 см. Содержание гумуса в верхних горизонтах варьирует от 4 до б %, а на глубине 150-200 см - 0,1-1,0% [9, 81, 97]. Средняя сумма осадков за год в зоне Краснодара составляет 643 мм, в летние месяцы их выпадает около 180 мм (здесь и далее представлены данные метеостанции "Круглик"). В период вегетации растений подсолнечника часто наблюдаются засухи. Температура воздуха летних месяцев в годы проведения экспериментов была оптимальна для подсолнечника и составляла 25,7С [10]. ЦЭБ ВНИИМК расположена в центральной части Краснодарского края, относящейся к зоне неустойчивого увлажнения. Поэтому здесь основным фактором внешней среды, лимитирующим продуктивность подсолнечника, является дефицит влаги. В мае-июне 2003 г. отсутствие влаги компенсировалось ее избытком в июле, но уже в августе опять отмечалась засуха. В целом погодные условия можно охарактеризовать как удовлетворительные. Условия 2004, 2005 и 2006 гг. были благоприятные по увлажнению. Недостаток влаги в эти годы отмечался только в мае и сентябре, а также в августе 2006 г. В течение лета, то есть когда подсолнечник более требователен к влажности почвы, количество выпавших осадков составило 206-207 мм. Опыты располагались на полях селекционного севооборота ВНИИМК. Предшественником подсолнечника во все годы исследований была озимая пшеница. Удобрения в дозе ИбоРбо вносили под предшествующую культуру. Посев подсолнечника проводили ручными сажалками, гнездовым способом, с размещением гнезд 70 х 35 см. В одно гнездо помещали по две - три семянки. Каждый рядок включал в себя по 25 гнезд. В течение вегетации проводили две междурядные культивации и ручную прополку в течение всего сезона [29]. Материалом наших исследований служили формы культурного подсолнечника: - сорта селекции ВНИИМК Мастер и Фаворит; - мутантные инбредные линии генетической коллекции ВНИИМК с измененным составом токоферолов - ЛГ15 (tphltphl), ЛГ17 (tph2tph2), ЛГ24 {tphltphl, tph2tph2), ЛГ25 {tph2tph2, OlOl) и BK%76(tphltphl, tph2tph2, 0/0/); - селекционные родительские линии - BK464, BK639, BK678, BK580, BK541, BK 175, ВК571, ВК653 и ВК591; - мутантные инбредные линии генетической коллекции Института полевых культур, Кордоба, Испания с измененным составом токоферолов -Т589,Т2100; - линия генетической коллекции Департамента сельского хозяйства США, обладающая устойчивость к группе имидазолиноновых гербицидов-НА425.
Во время вегетации определяли сроки полных всходов и начала цветения и проводили фенологические наблюдения.
Принудительное самоопыление и гибридизацию подсолнечника осуществляли общепринятым методом [17]. Родительские растения изолировали в фазе появления краевых цветков из-под обертки стандартными изоляторами из синтетического волокна «Спанбонд». Данные о растении, номер делянки, дату изоляции записывали на этикетке, которая привязывалась к растению при помощи шнура. В дальнейшем, при обмолоте этикетка вкладывалась в пакет с полученными семенами. Самоопыление выбранных растений проводили через день, при этом на рыльца пестиков изолированных растений принудительно наносили собственную пыльцу.
Для получения материнских линий использовали ручную кастрацию. В течение 4-5 дней, утром у раскрывшихся трубчатых цветков пинцетом удаляли пыльники. После кастрации каждого растения, пинцет и руки тщательно промывали водой. К опылению подготовленных материнских растений приступали после 10 часов утра. Пыльцу с отцовских растений на материнские формы наносили ежедневно. В некоторых случаях, при неблагоприятных условиях погоды, достаточно больших различиях скрещиваемых форм по срокам цветения пыльца с отцовского растения собиралась в пергаментный пакет и хранилась в бытовом холодильнике при + 5-7С до семи дней. Получали гибриды Fi от прямых и от обратных скрещиваний, а также F2.
Обмолачивали каждое растение вручную отдельно от других. Полученные семена помещали в пакет, на который переносилась информация о растении.
В осенне-весенний период систему скрещиваний продолжали в камерах фитотрона с использованием стандартных методов гибридизации и разработанного нами метода гибридизации на основе фотопериодической мужской стерильности. Растения выращивали в сосудах с почвенно-песчаной смесью (по два растения в сосуде), при фотопериоде во время вегетации 16 ч/день и 8 ч/ночь [44], и 24ч/день 0 ч/ ночь во время цветения.
В случае необходимости, период покоя семян преодолевали путём проращивания недозрелых двухнедельных зародышей семян сначала на фильтровальной бумаге, а затем - в стаканчиках с почвено-песчаной смесью, или 16 часовой обработкой водным раствором кампозана в концентрации 50 мг/л свежеубранных, подсушенных семянок [80].
Одной из главных задач генетического изучения исходного материала является создание и пополнение идентифицированных генетических коллекций. Работа включала следующие этапы: создание признаковых коллекций; выявление генотипических различий по изучаемым признакам между лучшими образцами- источниками; изучение генетического контроля признаков и определение числа пар селекционно-ценных аллелей; идентификация селекционно-ценных аллей; формирование идентифицированных генетических коллекций [54].
Тест на аллелизм мутаций состава токоферолов
Изучение различной степени экспрессивности мутации tph2 как отдельно, так и в сочетании с мутацией tphl в двойной гомозиготе включало отбор константных генотипов с различным содержанием у- токоферола и проведение гибридологического анализа.
На основе индивидуального отбора с оценкой по самоопыленному потомству продолжено ведущееся в лаборатории генетики создание двух сублиний ВК175, гомозиготных по мутации tph2. Максимальная экспрессивность этой мутации, или " + " вариант, характеризуется почти 100% содержанием у-формы в токоферольном комплексе. Минимальная экспрессивность, или " - " вариант, обладает снижением содержания у-формы, в среднем, до 34% и увеличением доли а-формы до 66% (табл. 4.1). Тем не менее, этот фен остается мутантным, т.к. нормальное содержание а-токоферола превышает 95%.
Также на основе индивидуального отбора с оценкой по самоопыленному потомству продолжено создание двух сублиний ВК876, гомозиготных по мутациям tphl и tph2 одновременно. Максимальная экспрессивность мутации tph2, или " + " вариант, характеризуется на фоне дирецессива, в среднем, около 72% у- формы, 28% 8-формы при отсутствии а- и 3-токоферолов. Минимальная экспрессивность, или " - " вариант, обладает снижением содержания у- формы до 27% при увеличении доли 5 -формы до 36% и появлении а- и )3-токоферолов до 11 и 26%, соответственно. Следовательно, мутантный фен с минимальной экспрессивностью содержит все четыре формы токоферолов в значительных количествах и качественно отличается от фена с максимальной экспрессивностью, содержащего только две формы - у и - 8 (табл. 4.2).
Отобранные растения сублиний ВК175 и ВК876 с различной экспрессивностью мутации tph2 были включены в систему скрещиваний в камере фитотрона весной 2005 г. Семена F] от скрещивания сублиний ВК175 (min х max) и ВК876 (max х min) получены с использованием разработанного метода гибридизации на основе фотопериодической мужской самостерильности (табл. 4.3).
По 16 растений линиИ ВК876 и ВК175 выращивали в сосудах с почвой (по два растения в сосуде) в обычных условиях до начала и после окончания цветения. При этом использовали светильники типа Фотос.4 с лампами ДРИ-2000-6 и освещенность 25 килолюкс при фотопериоде 16 ч/день и 8 ч/ночь. На время цветения корзинок на период шесть дней с 7 по 12 мая устанавливался 24-ти часовой световой день при среднесуточной температуре воздуха около 25 С. Для получения пыльцы и самоопыления восемь растений каждой линии были перенесены во время цветения в соседнюю камеру с обычным фотопериодом.
Разработка этого эффективного способа получения гибридных семян, на который имеется положительное решение о выдаче патента от 9.01.2007 по заявке №2005135841/13(040039), была начата летом 2004 г.
Растения константной селекционной линии подсолнечника с генетически измененным составом жирных кислот и токоферолов ВК876 выращивали в 16 сосудах с почвой (по одному растению в сосуде) в теплице фитотронно-тепличного комплекса ВНИИМК при естественном освещении стандартным методом. С началом цветения корзинок 12 растений были перенесены в камеру фитотрона с 24-ти часовым световым днем на период семь дней. Использовались светильники типа Фотос.4 с лампами ДРИ-2000-6, обеспечивающие освещенность 25 килолюкс при среднесуточной температуре воздуха около 32 С.
Четыре растения линии ВК876 были оставлены в теплице для получения пыльцы, самоопыления и контрольных наблюдений за процессом цветения при естественной долготе дня около 16 ч. и температуре воздуха около 40 С днем и 26 С ночью. Пыльца линии ЛГ28 с обычным составом жирных кислот и токоферолов собиралась с растений, выращенных в полевых условиях. После пребывания в камере с постоянным освещением во время цветения растения были перенесены обратно в теплицу. Гибридизацию осуществляли путем нанесения пыльцы на рыльца пестиков при использовании внутренней стороны сорванных листочков обертки.
Для всех 12-ти растений линии ВК876 в камере фитотрона с постоянным освещением наблюдали нарушение процесса цветения трубчатых цветков. Это проявлялось в виде отсутствия явления протерандрии для концентрической зоны последующего за экологическим воздействием дня цветения, заключающемся в отсутствии выхода пыльниковой трубки с пыльцой из венчика за счет полного отсутствия роста тычиночных нитей (табл. 4.4). Длина венчика и длина пыльниковой трубки достоверно не изменились. При этом наблюдали обычный рост пестика с последующим раскрытием двух лопастей рыльца без выноса пыльцы. Искусственное вскрытие венчиков этих морфологически женских однополых цветков показало, что нормально развитые пыльниковые трубки содержали обычное количество пыльцы. Фотопериодически детерминированная морфологическая женская однополость появлялась только у цветков зоны цветения, находившейся под предшествующим воздействием 24-ти часового светового дня. Циркадная зональность цветения корзинки при этом не нарушалась, что свидетельствует об эндогенном характере этого биологического ритма в условиях постоянного освещения и температуры. Контрольные растения, оставленные в теплице при естественном фотопериоде, характеризовались нормальным протерандрическим цветением с выталкиванием пыльцы из предварительно проросшей пыльниковой трубки сомкнутыми лопастями рыльца пестика (рис. 4.2,4.3 и 4.4).
Характеристика родительских форм
В случае необходимости получения пыльцы с материнского растения для его самоопыления или использования в качестве отцовской формы, следует перейти на 16-ти часовой фотопериод, что приведет к обычному типу цветения оставшейся части корзинки с выходом пыльников из вновь распустившихся цветков и выталкиванием пыльцы из пыльниковой трубки лопастями рыльца пестика. При этом не вышедшие из венчика пыльники предыдущих концентрических зон цветения уже не прорастают. Так два растения линии ВК876, находившиеся первые два дня цветения под непрерывным освещением и обладающие ФМС, были помещены в условия обычного 16-ти часового фотопериода, показав при этом обычный тип цветения оставшейся части корзинки и завязав 37 и 56 семян от самоопыления при диаметре корзинок 5 см.
Таким образом, в предлагаемом способе получения гибридов Fj выход ФМС-растений после 24-ти часового фотопериодического воздействия на самофертильные растения составил 100%, степень гибридизации - 100% при полном отсутствии самоопыления материнских растений.
В целом, полученные результаты являются экспериментальным подтверждением теории эколого-генетической мужской стерильности у растений [31], основы которой были заложены Ч. Дарвином [18] и развиваемой во многих исследованиях, в том числе с подсолнечником [1]. Согласно этой теории в онтогенезе растений формируется относительно меньшее количество женских гамет, чем мужских. Это эволюционно делает женские гаметы более устойчивыми к генетическим и средовым флуктуациям. Поэтому обычной реакцией растений на изменение условий выращивания является взаимопереход мужской фертильности и стерильности. Наряду с многочисленными факторами, вызывающими модификационную стерильность растений подсолнечника известен способ получения фертильных растений линии с гомозиготной генной мужской стерильностью при выращивании этой линии в условиях одновременно более короткого светового дня, низкой освещенности и низкой температуры [69].
Известно, что явление отсутствия выхода нормально развитых пыльников с пыльцой из венчика трубчатых цветков во время цветения корзинки подсолнечника было отмечено для образца декоративного подсолнечника ВИР95. Эта морфологическая стерильность обозначена как тип М [2]. Описаны аналогичные аномалии в цветении подсолнечника при его выращивании в измененных фотопериодических условиях искусственного климата [12]. Однако специального исследования этого явления, включая возможность его использования в разработке метода гибридизации, не проводилось.
С физиологической точки зрения вызванное постоянным освещением полное отсутствие роста тычиночных нитей, в норме происходящего со скоростью около 4 мм за два часа, может объясняться недостатком фитогормонов роста типа ауксина при отсутствии темного времени суток. Известно, что лист является органом, воспринимающим фотопериод, а ауксин синтезируется в апикальных меристемах и молодых листьях, откуда он транспортируется в другие части растения, вызывая растяжение клеток. Нормальный рост пестика в этих условиях указывает на большую устойчивость гинецея к колебаниям экологических факторов. При этом физиолого-биохимические показатели пестика и пыльцевых трубок различны, в частности, в последних отмечено более высокое содержание ауксина [51].
Эксперименты с линиями ВК876 и ВК175 подтвердили появление фотопериодической мужской самостерильности (ФМС) при 24 часовом освещении. Получение семян с этих линий, возможно только при нанесении пыльцы с соответствующих мужски фертильных растений. В целом, количество гибридных семян с одной корзинки, полученных от скрещивания сублиний с масимальной и минимальной экспрессивностью мутаций состава токоферолов, варьировало с 33 до 97 (табл. 4.3) при диаметре корзинки от 4 до 6 см в условиях камеры фитотрона.
Извлеченные из корзинок 12-ти дневные семена F] были проращены в термостате на фильтровальной бумаге при температуре 25С, затем высажены в стаканчики. В полевых условиях 2005 г. от выращенных растений были получены семена F2. В этом опыте также получены семена родительских линий и гибридов Fi.
Сублинии ВК175 с минимальной и максимальной экспрессивностью мутации tph2 достоверно различались содержанием у-токоферола 26 и 69%, соответственно. Наследование признака в Fi носило эффект частичного доминирования при среднем значении 45%. При этом степень доминирования h/d равнялась -0,12. В F2 наблюдалось континуальное варьирование без дискретных фенотипических классов и очень высоким CV, равном 95%, что наряду с относительно небольшим объемом выборки не позволяет обоснованно установить число и взаимодействие сегрегирующих генов (табл. 4.7). Кроме того, три величины - среднее значение признака в Fj 45%», в F2 42%) и арифметическое среднее между родителями (т) 48% достоверно не различались между собой. Это указывает на аддитивность действия генов, контролирующих различие в содержании у-токоферола между сублиниями ВК175.
Похожие диссертации на Генетическая идентификация мутаций состава токоферолов в семенах подсолнечника
