Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы. Значение генетических маркеров генов окраски, полиморфных систем белков сыворотки крови и групп крови в селекции сельскохозяйственных животных
1.1. Актуальность изучения наследования окрасок (мастей) лошадей 11
1.2. История изучения генетической детерминации основных мастей лошадей 13
1.3. Локус Extension (локус рецептора меланоцитостимулирующего гормона - MC1R) в генетике окраски млекопитающих 16
1.4. Локус Albino (локус тирозиназы - Туг) в генетике окраски млекопитающих 20
1.5. Связь окраски (масти) с параметрами жизнеспособности, плодовитостью и селекционно-значимыми признаками 23
1.6. Полиморфизм белков сыворотки крови 29
1.7. Связь генетических маркеров (полиморфных белков сыворотки крови и антигенов систем групп крови) с селекционными признаками и репродуктивными способностями 34
1.8. Характеристика основных заводских типов лошадей орловской рысистой породы 37
ГЛАВА II. Материалы и методы
2.1. Структура исследований 40
2.2. Объект исследований 42
2.3. Материал исследования 45
2.4. Изоляция ДНК из образцов волос гривы лошадей и проведение ПЦР-анализа 47
2.5. Сбор и биохимический анализ образцов крови лошадей 49
2.6. Статистическая обработка результатов 51
ГЛАВА III. Результаты исследований 57
3.1. Гибридологический анализ наследственной детерминации основных окрасок (мастей) шерстного покрова 57
3.2. Влияние различных факторов на репродуктивные способности кобыл 61
3.2.1. Влияние возраста 61
3.2.2. Влияние фенотипа по масти 66
3.3. Изменчивость морфометрических показателей у орловских рысаков пяти заводских популяций 69
3.4. Генетическая структура популяций по локусам пигменто-образования и белков сыворотки крови лошадей орловской рысистой породы 75
3.4.1. Генетическая структура популяций по локусам MC1R (Extension) и Туг {Albino) 75
3.4.2. Генетическая структура популяций по локусу Alb альбумина сыворотки крови 80
3.4.3. Генетическая структура популяций по локусу трансферрина Tf сыворотки крови... 83
3.4.4. Генетическая изменчивость популяций орловских рысаков по системе эстеразы Es сыворотки крови 91
3.5. Сравнительный анализ соответствия генотипической структуры популяций по локусам Extension (MC1R) и Albino {Туг) с фенотипической структурой по масти у орловских рысаков 97
3.6. Дифференциация популяций по средней гетерозиготности локусов пигментообразования и белков сыворотки крови.у лошадей орловской рысистой породы 105
3.7. Связь гетерозиготности по изучаемым локусам с работоспособностью орловских рысаков 106
3.7.1. Характеристика популяций орловских рысаков по работоспособности 106
3.7.2. Связь генетических маркеров с работоспособностью орловских рысаков 109
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов исследования 111
Выводы 117
Предложения 119
Список литературы 120
Приложения 143
- Локус Extension (локус рецептора меланоцитостимулирующего гормона - MC1R) в генетике окраски млекопитающих
- Изоляция ДНК из образцов волос гривы лошадей и проведение ПЦР-анализа
- Изменчивость морфометрических показателей у орловских рысаков пяти заводских популяций
- Сравнительный анализ соответствия генотипической структуры популяций по локусам Extension (MC1R) и Albino {Туг) с фенотипической структурой по масти у орловских рысаков
Введение к работе
Актуальность. Использованию генетических маркеров в селекции посвящено большое количество работ (Дуйсембаев и др., 1970; Котов, 1977; Дубровская и др., 1978; Пономарёва, 1979; Дубровская, Стародумов, 1993; Костомахин и др., 1997).
Актуальность этой темы напрямую связана с проблемой сохранения генофонда уникальных пород с.-х. животных и наиболее эффективной их селекции (Рождественская, 2003).
Сохранение ценного генофонда уникальной породы лошадей отечественной селекции - орловской рысистой - особенно актуальна в настоящее время, в связи с неуклонным сокращением численности и уменьшением генетического разнообразия внутри этой «замкнутой» популяции (Рождественская, 1996).
Воспроизводство лошади, как малоплодного вида домашних животных, главным образом ограничено репродуктивными функциями кобыл. Это объясняет выбор их в качестве объекта изучения плодовитости и поиска возможных связей генетических маркеров лошадей с воспросизводительными качествами и жизнеспособностью в настоящем исследовании.
Особенностью разведения лошадей, как малоплодных и высокоценных животных, является большой интервал смены поколений, что обусловливает * необходимость поисков наиболее эффективных (в экономическом и селекционном плане) путей совершенствования пород этого вида животных (Князев и др., 2002). К таким возможностям можно отнести предварительное прогнозирование работоспособности и плодовитости животных на основании результатов типирования их генотипов, то есть использование при селекции лошадей генетических маркеров, связанных с селекционируемыми признаками (Пономарёва, 1978, 1979; Стародумов, Дубровская, 1994).
Последние достижения науки в области молекулярной биологии и биотехнологии призваны решать эти проблемы (Alberts et al., 1995; Seyffert et al., 1998).
Одним из важнейших путей получения информации о генотипе может служить исследование спектров наследственной изменчивости в виде генетического полиморфизма, в том числе антигенов, белков и ферментов (Созинов, 1985).
Генетика масти является одним из интересных в этом плане направлений частной генетики лошади. Известны случаи связи полиморфизма тех или иных локусов окраски с изменением жизнеспособности и плодовитости лошадей (Визнер, Вилл ер, 1979).
В научных трудах, посвященных проблеме наследования окраски у лошадей, продолжает одновременно существовать несколько гипотез. В одной из них главная роль в наследственной детерминации основных мастей отводится локусам Agouti и Extension (Bowling, 1998), по другой (Kraeusslich, 1995), - образование основных окрасок контролирует также локус Black. В целом, тема наследственной детерминации масти имеет немалое практическое значение, учитывая тот факт, что окраска шерстного покрова лошади в некоторых породах является одним из основных критериев отбора. В связи с чем особенно актуальной стала проблема точной идентификации генотипов производителей по локусам детерминирующим окраску для получения потомков определённой масти (Reismann, 1998), а также для широкомасштабной селекции с управлением структурой породы по фенотипам масти.
Перспективен также поиск возможных ассоциаций жизнеспособности и репродуктивных качеств, а также селекционируемых признаков с аллельными вариантами локусов (например, высокополиморфного локуса системы эстеразы Es и трансферрина Tf), контролирующих важнейшие стадии метаболизма или играющими в них важную роль.
Изучение внутрипородной структуры популяции орловских рысаков с помощью методов молекулярной биологии имеет большое теоретическое и практическое значение, кроме того, наряду с наработкой современных методов сохранения генофонда, вносит вклад в раскрытие сущности генетико-селекционных процессов при работе с породами с.-х. животных. Поиск и обнаружение возможных связей генетических маркеров с жизнеспособностью лошадей, а также с основными селекционируемыми признаками (резвостью и плодовитостью), будет способствовать решению проблемы сохранения и увеличения численности племенного поголовья орловской рысистой породы методом чистопородного разведения.
Цель и задачи исследования. Цель работы состоит в поиске связей генетических маркеров с жизнеспособностью, работоспособностью и плодовитостью у лошадей орловской рысистой породы.
Для осуществления этого были поставлены следующие задачи:
Провести уточняющий анализ наследственной детерминации основных мастей лошадей на примере орловских рысаков.
Изучить генетическую структуру пяти заводских популяций лошадей орловской рысистой породы по локусам пигментообразования MC1R (Extension) и Туг (Albino), а также исследовать современную генетическую структуру этих популяций по системам полиморфных белков сыворотки крови Es,AlbnTf.
Изучить возможность предварительного прогнозирования масти жеребят на основании определения генотипов родителей по локусам пигментообразования MC1R и Туг.
Осуществить поиск возможных ассоциаций между изменчивостью частот аллелей и генотипов локусов MC1R, Туг, Es, Alb и Tf с жизнеспособностью, работоспособностью и плодовитостью орловских рысаков.
Новизна. Впервые проведено тестирование по локусам пигментообразования MC1R и Туг с использованием методов молекулярной
биологии племенного поголовья пяти ведущих конных заводов, разводящих лошадей орловской рысистой породы. Осуществлён комплексный анализ особенностей современной генетической структуры заводских популяций по полиморфным системам сывороточных белков крови и локусам пигментообразования, а также выявлены тенденции связей генетических маркеров с жизнеспособностью, плодовитостью и работоспособностью.
Практическая значимость. Результаты исследований демонстрируют особенности процессов динамики фено- и генофонда популяций «закрытой» орловской рысистой породы, которые необходимо учитывать при селекционной работе с ней. Молекулярно-генетический анализ ДНК подтвердил, что локус MC1R гомологичен локусу Extension, известному из классической генетики окраски, что позволяет прогнозировать масть жеребенка на основании типирования генотипов родителей по этому локусу.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XXXVII-й и XLI-й Международных конференциях студентов и аспирантов «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, НГУ) в 1999 и 2003 гг.; на Международных научных конференциях (Новосибирск, НГАУ) в 2000 и 2002 гг., на 50-й и 51-й Конференциях Европейской Ассоциации животноводов в 1999 (Швейцария, Важенинген) и 2000 гг. (Голландия, Хакве), а также на XXVIII Международной конференции по генетике животных в 2002 г. (Германия, Геттинген). По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях.
Положения, выносимые на зашиту.
1. Локус MC1R с аллелями MCIR* и мсте можно рассматривать как
генетический фактор, детерминирующий масть лошадей, в то время как
мутация TyrCt не оказывает влияния на изменение их окраски.
2. На протяжении всего периода племенного использования у рысистых кобыл,
имеющих масть, определяемую мутантными аллелями локусов
пигментообразования, относительно аллелей «дикого фенотипа по масти», наблюдается снижение репродуктивных качеств.
3. Обследованные популяции орловских рысаков, разводимых в различных природно-климатических зонах, характеризуются различной генетической структурой по пяти изученным локусам (MC1R, Туг, Es, Alb и Tf).
Локус Extension (локус рецептора меланоцитостимулирующего гормона - MC1R) в генетике окраски млекопитающих
Согласно современным данным молекулярной биологии локус Extension, определяющий по представлениям классической генетики окраски, синтез пигмента двух типов (красного или жёлтого - феомеланина и чёрного -эумеланина) в организме млекопитающих, гомологичен локусу рецептора меланоцитстимулирующего гормона MC1R. Так, Johansson et al. (1994) сообщили об ассоциации между полиморфизмом по длине рестрикционного фрагмента в MC1R гене и рыжим окрасом. Marklund et al. (1996), используя метод PCR-анализа, изучили образцы ДНК 114 лошадей 12 пород и обнаружили в локусе рецептора меланоцитстимулирующего гормона одиночную замену (83Ser— Рпе) только у особей рыжей масти. На основании этого был сделан вывод, что ген MC1R является главным кандидатом для детерминации рыжего окраса у лошадей и принятия на себя роли локуса Extension.
Фенотипически рыжая масть лошадей похожа на жёлтый окрас мышей и контролируется рецессивным аллелем е локуса Extension (Adalsteinsson, \91А). Как позднее показало картирование ген, обусловливающий рыжую масть лошадей, локализован в хромосомном регионе, гомологичном таковому на хромосоме мышей, крупного рогатого скота и людей (Andersson, Sandberg, 1982).
«Дикий» аллель локуса Extension — Е — является доминантным и кодирует неповреждённый, нормальный рецептор меланоцитстимулирующего гормона {МС1К)У куда может присоединяться меланоцитстимулирующий (МС1) гормон или его антагонист - агути-протеин (Jackson, 1993; Lu et al., 1994; Voisey, et al., 2001), под контролем которых находится количественное соотношение синтеза пигментов эумеланина и феомеланина (Jackson, 1994).
Рецессивный, мутантный аллель «е», возникающий вследствие замены одного нуклеотида (Brash, 1996), у гомозиготных по этому аллелю мышей (Robbins et al., 1993) кодирует рецептор с изменённой функцией. Следствием чего является сдвиг количественного соотношения двух типов пигментов в меланоцитах в сторону преобладания феомеланина (фенотипически - красный или жёлтый цвет волос).
Действие рецессивного аллеля локуса Extension является видоспецифичным. У различных видов млекопитающих он обусловливает разную степень интенсивности пигментации - у крыс, например, кремовый окрас, у мышей - жёлтый, золотистый - у лабрадоров-ретриверов и красный -у ирландских сеттеров (Vage et al., 1999; Lamoreux et al., 2001; Rieder et al., 2001). Внутри одного вида животных также возможны различные вариации по интенсивности окраски. Например, у рыжих лошадей существуют светлые, тёмные, золотистые или красные варианты оттенков. Таким образом, в дополнение к аллелям is-локуса на тип и количество синтезируемого феомеланина могут оказывать влияние продукты и других локусов (Krauesslich, 1996).
Мутации в MC1R обусловливают различные варианты окраски волосяного покрова у мышей (Robbins et al., 1993; Wada et al., 1999), крупного рогатого скота (Klungland et al., 1995), собак (Events et al., 2000; Newton, et al., 2000), свиней и овец (Kijas et al., 1998; Vage, et al.,1999; Kijas et al., 2001), контролируемые по классической генетике -локусом. У лошадей в настоящее время известно несколько мутаций в локусе Extension: «дикий», нормальный аллель - Е, а также два мутантных - «е» и « » (Bowling, 1996). Последний встречается в некоторых породах лошадей и обусловливает, так называемую «доминантную» вороную масть. Н. Wagner, М. Reissmann (2000) обнаружили у лошадей шварцвальдской тяжеловозной породы ещё один рецессивный аллель в локусе MCJR, названный еа, для которого был характерен простой менделевский тип наследования. Все животные были рыжего окраса различной интенсивности и имели белую или льняного цвета гриву и хвост. При этом никакой связи между различными оттенками масти и обеими мутантными аллелями е, еа не наблюдалось.
В. Kriegesmann et al. (1996) прежде сообщали о полиморфизме, идентичном упоминаемому здесь аллелю е у лошадей, но не указали, что он может быть информативен для окраса, так как, обнаружив его у рыжих и серых арабских лошадей, не учли, что серые прежде могли быть рыжими. Однако, S. Adalsteinsson (1974), а также L. Andersson и К. Sandberg (1982) показали, что тёмно-рыжая масть (chestnut/ sorell group) обусловлена не В-локусом, как это было принято считать прежде, но .Е-локусом. Пигменто-гистологические исследования подтверждают это предположение (Woolf and Swafford, 1988; Sponenberg et al., 1989). Заметим также, что в противоположность этому современные отечественные учебники по генетике, где затрагивается тема наследственной детерминации мастей лошадей, продолжают утверждать (Меркурьева и др., 1983, 1991), что «чёрно-коричневая пигментация обусловлена геном В, Ь, а красно-жёлтая - аллелем гена Y, у». М. Jochansson et al. (1994) сообщает о рестрикционном фрагменте, связанном у лошадей с рыжей мастью, но, как утверждает В. Kriegesmann et al. (1995), не кодирующем MC1R - рецептор. По данным молекулярно-генетического анализа, в отличие от результатов, полученных на мышах, у лошадей, имеющих гомозиготный генотип ее, синтез эумеланина полностью не прекращается (Krauesslich, 1996). Семейство аллелей Extension- локуса входит во вторую группу сцепления генов, исследованных у лошадей (LG-ІГ). Хромосомное положение этой группы точно ещё не известно, но в её состав входят ещё локусы Roan (RN) - чалая масть и ТоЫапо {ТО) - один из вариантов пегого окраса (Bowling, 1996). Лошади большинства пород могут иметь различную масть, в том числе рыжую или вороную, но в некоторых породах ведётся отбор против доминантного аллеля, даже до его полной элиминации и наоборот. Например, во фризской породе (где в производящий состав допускаются лишь вороные лошади без отметин или с незначительными белыми отметинами на голове) и кливлендской гнедой (только гнедые) присутствует только доминантный аллель, очень редко - рецессивный. У суффольков и хафлингеров имеется только рецессивный аллель и соответственно масть у представителей этих пород - рыжая (Bowling, 1996).
Изоляция ДНК из образцов волос гривы лошадей и проведение ПЦР-анализа
Первоначальную денатурацию ДНК проводили при 94 С в течение 3 минут, затем последующие 35 циклов следовали при 94 С за 1 минуту каждый, при 60 С - за 20 секунд и при 72 С - за 30 секунд. Заключительный этап проходил при 72 С в течение 10 минут в амплификаторе Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer Cetus, Freiburg, Germany).
Фрагменты рестрикции амплифицированной последовательности MC1R и Туг разделяли электрофорезом в полиакриламидном геле с добавлением этидия бромида. Визуальную идентификацию аллелей по величине дорожек проводили, освещая гель в ультрафиолетовом спектре.
Для локуса тирозиназы Туг ПЦР включала в себя 35 циклов при температуре отжига 56 С. Амплифицировали фрагменты длиной 491 пн, которые затем расщеплялись рестрикционным энзимом BstOI. Пробы крови (в две пробирки от каждой лошади) брали из ярёмной вены в пробирки с антикоагулянтом (40 г цитрата натрия трёхзамещённого, 20 г глюкозы, 10 г лимонной кислоты, 5 г альбуцида, 0,03 г риванола, 1000 мл дистиллированной воды). К антикоагулянту, находящемуся в пробирках в количестве из расчёта Ул объёма пробы крови (1,5-2,5 мл) добавляли кровь (5-Ю мл) и осторожно перемешивали. В лабораторию Всероссийского института коневодства образцы транспортировали в термосумке-холодильнике со льдом.
Типирование образцов сыворотки крови по системам эстеразы, трансферрина и альбумина проводили методом горизонтального электрофореза в крахмальном геле по адаптированной методике Всероссийского института коневодства (Дубровская, Стародумов, 1986) в лабораториях этого же института.
Электрофорез осуществлялся в плексигласовых ванночках на 22 образца. Для приготовления геля использовали гидролизованный крахмал, приготавливаемый также по методике Института коневодства (Дубровская, Стародумов; 1985), который смешивали с буферным раствором из расчёта 10-12 % к объёму буфера. Суспензию буфера и крахмала нагревали в колбе, помешивая до загустения, затем при помощи вакуумного насоса, создававшего разряжение в 1 атмосферу, в течение 30 сек удаляли пузырьки воздуха. Горячий гель заливали в ванночку и оставляли на 1,5-2 часа до загустения при комнатной температуре. Образцы хромотографической бумаги (0,5 х 0,7 см) смачивали в пробах сыворотки крови и помещали в места прокола геля, сделанные при помощи специальной гребёнки на различном расстоянии от края ванночки: для альбумина - 5 см, для эстеразы - 4 см, трансферрина - 2 см. Блок геля накрывали полиэтиленовой плёнкой.
Состав буфера для электролита и для геля различался в зависимости от определяемого белка. Для трансферрина использовали электролитный буфер следующего состава: 11,8 г борной кислоты 1,2 г моногидрата окиси лития в 1000 мл дистиллированной воды, рН=8,5. Буфер для геля содержал 8,67 г трисоксиметиламинометана и 1,33 г лимонной кислоты - всё это растворяли в 1000 мл дистиллированной воды при рН=8,0. При приготовлении 10-%-ного геля 5,25 частей объёма трисцитратного буфера смешивали с 1 частью бората лития.
При определении альбумина использовали следующий электролитный буфер: 17,0 г уксуснокислого натрия и 3,7 г трилона «Б», растворённые в 1000 мл дистиллированной воды при рН=5,4-5,6. В анодной электрофоретической ванне этот буфер разбавляли в пропорции 1:1 дистиллированной водой. Для приготовления 12-%-ного геля применяли в четыре раза разведённый буфер электролита.
При определении эстеразы использовали следующий электролитный буфер: 37,0 г борной кислоты, 0,5 г едкого натрия в 1000 мл дистиллированной воды при рН=5,0. Приготовление 12-%-ного геля происходило при использовании смеси двух растворов - «А» и «Б». Раствор «А» состоял из 10,5 г лимонной кислоты, растворённой в 1000 мл дистиллированной воды, а раствор «Б» - 23,0 г трисоксиметиламинометана, растворённого в 1000 мл дистиллированной воды. 26 мл раствора «А» и 10 мл раствора «Б» доводили до 175 мл дистиллированной водой при рН=6,18.
Электрофорез для системы «трансферринового» буфера проходил в течение 2,5 часов при силе тока 120 тА и напряжении до 600 V, для системы «альбуминового» буфера — в течение 4 часов при силе тока 120 тА и 250-300 V, а при определении эстеразы - в течение 3-4 часов при силе тока 45 тА и напряжении 400 V.
Окрашивание пластин геля при определении трансферрина и альбумина проводили в течение 10 минут насыщенным раствором нигрозина в промывной жидкости, состоящей из метанола, дистиллированной воды и ледяной уксусной кислоты в соотношении 5:5:1. После окрашивания (примерно через 15 минут) пластины промывали чистой отмывочной жидкостью.
При определении эстеразы фореграммы окрашивали трис-малеиновым буфером, состоящим из 160 мл 1 М NaOH (40 г на 1000 мл дистиллированной воды), 24,2 г трисоксиметиламинометана и 23,2 г малеиновой кислоты. Всё это доводитлось до 1000 мл дистиллированной водой. Краситель готовили непосредственно перед окрашиванием: 250 мг красителя растворяли в 250 мл метилового спирта, добавляли 250 мл трис-малеинового буфера, растворённого в 5 мл ацетона, и 100 мг а-нафтилацетата. Расшифровку фореграмм проводили визуально при дневном освещении.
Изменчивость морфометрических показателей у орловских рысаков пяти заводских популяций
Все исследованное поголовье кобыл пяти конных заводов имело большее, чем в среднем по породе, а также по конным заводам (кроме хреновской популяции), значение обхвата пясти. Величина четырёх основных индексов (формата, компактности, обхвата груди и костистости) у кобыл различных заводских популяций также значительно варьировали (табл. 14).
Наименьшим значением индекса формата или растянутости характеризовались кобылы новотомниковской популяции, а наибольшим -пермской. Соответственно наибольшее значение индекса компактности было характерно для кобыл новотомниковской, а наименьшее - для кобыл пермской популяции.
При этом кобылы Шадринского конного завода по значению индекса формата были ближе к новотомниковским, то есть обладали более укороченными формами, нежели представители остальных выборок. Средние значения индекса формата туловища кобыл алтайской и хреновской популяций были сходными. В то же время кобылы Алтайского конного завода отличались наибольшим значением индекса массивности, а наименьшим - представительницы шадринской популяции. Наименьшим значением индекса костистости характеризовались кобылы алтайской популяции, а наибольшим -шадринской. Таким образом, представительницы шадринской заводской популяции по своим морфометрическим показателям представляют собой более низкорослых, менее растянутых и массивных животных, чем в среднем по племенному ядру породы и даже в целом по породе, при этом отличаются значительным превосходством значения обхвата пясти и, соответственно индекса костистости. Кобылы пермской популяции обладают самыми длинными формами среди представительниц прочих конных заводов, при этом они характеризуются также довольно значительной величиной обхвата груди и средним - обхвата пясти. Соответственно они отличаются наименьшей компактностью. Представительницы алтайской популяции являются самыми высокорослыми и «глубокими» при средней растянутости, но относительно беднокостными. Соответственно им характерны наибольшее значение индекса массивности и наименьшее - костистости. Штатные матки новотомниковской популяции при относительно меньшей, чем у прочих, высоте в холке и длине туловища характеризуются средним значением обхвата пясти. Это соответствует наименьшему значению индекса формата и наибольшему - индекса компактности. Кобылы хреновской популяции на фоне относительно средних значений всех основных четырёх промеров характеризуются недостаточным развитием костяка. В целом результаты анализа морфометрических показателей представительниц различных конных заводов соответствуют общепринятым словесным характеристикам эколого-заводских внутрипородных типов, что наглядно подтверждает существование в породе фенотипической дифференциации на отдельные заводские популяции. Аллели Е и е гена Extension (MC1R) являются основным фактором, детерминирующим тёмные и светлые окраски шерсти млекопитающих (Robbins et al., 1993). Молекулярно-генетические исследования с использованием PCR-анализа и специфических праймеров позволили установить (Marklund et al., 1996) гомологию вышеназванных аллелей Е и е с аллелями MC1R Е и MC1R е (С — Т, 83Ser -» Phe), на основании чего они используются в настоящей работе как синонимы. Результаты настоящей работы (рис. 15) показывают, что концентрации аллелей значительно различаются во всех пяти выборках. Кроме того, ни в Ф одной из них не обнаружены достоверные отклонения по распределению частот генотипов от уравнения Харди-Вайнберга (табл. 16). В изученных выборках сложилось соотношение частот, при котором генотипы, имеющие доминантный аллель, преобладают по частоте над генотипами, гомозиготными по рецессивному аллелю (рис.15). При этом изучаемые выборки, как оказалось после вычисления стандартного критерия неоднородности, не принадлежат к одной генеральной совокупности, ни по частотам аллелей (%2= 19,46; Р 0,001), ни по частотам генотипов (х2= 19,87; Р 0,01). При этом абсолютное количество гомозиготных генотипов (численность особей с таким генотипом) по доминантному аллелю значительно варьирует между популяциями: от/ =59 - в хреновской, до/ =17 — в новотомниковской (что само по себе интересно, учитывая географическую близость мест обитания данных популяций). Максимальная численность особей с гетерозиготным генотипом наблюдается в случае в шадринской популяции -/ =45, минимальная -/ =12, в пермской (эти две популяции также географически наиболее близко расположены друг ко другу из всех сравниваемых в настоящем исследовании). Диапазон разброса частот гомозиготных генотипов по рецессивному аллелю е - также значителен: от/ =3 — в хреновской, до/ =11 — в шадринской популяциях, хотя все три остальные выборки имеют среднюю частоту рецессивных гомозиготных генотипов, равную 5,40. Данная достоверная неоднородность по частотам генотипов, возможно, является следствием случайных генетических процессов, таких как дрейф генов, когда использование жеребцов-производителей, или же реже конематок, 4ns рождённых в других конных заводах, выравнивает баланс генотипов в некоторых значительно удалённых друг от друга популяциях, в то время как близкорасположенные заводские популяции, некоторое время не обменивавшиеся производителями, генотипически дифференцируются. В случае с локусом Туг имеет место несколько иная ситуация. Локус тирозиназы (Туг) с аллелями С и С (мутация, представляющая собой замену в первом экзоне, вызывающая синтез Ser вместо Pro, по Reissmann et al., 2000) также как локус MC1R имеет важное значение в регулировании синтеза пигмента. Во всех пяти популяциях генотипы, гомозиготные по доминантному "ь нормальному аллелю С, строго преобладают (табл. 17) по частоте над генотипами гетерозиготными и гомозиготными по рецессивному мутантному ал л елю С . Крайние варианты частот генотипов также как и по локусу MC1R, достаточно отстоят друг от друга. Наибольшая численность особей гомозиготных if І =13) по доминантному аллелю наблюдается в хреновской популяции, а наименьшая iff =31) - в пермской. Данные группы лошадей географически находятся достаточно далеко друг от друга, а также различаются и по генеалогическому составу.
Сравнительный анализ соответствия генотипической структуры популяций по локусам Extension (MC1R) и Albino {Туг) с фенотипической структурой по масти у орловских рысаков
Проблема сохранения ценного генофонда уникальной породы лошадей отечественной селекции - орловской рысистой - остро ощутима в настоящее время, в связи с неуклонным сокращением численности и генетического разнообразия (Рождественская, 2003) внутри этой «замкнутой» популяции. Это обусловливает особую актуальность поиска новых путей эффективной селекции, а также подробного изучения генетических особенностей ограниченных по численности заводских популяций.
Проведённое исследование распределения фенотипов по селекционируемым признакам и генотипов по пяти локусам свидетельствует о дифференциации поголовья орловских рысаков на своеобразные внутрипородные заводские популяции, несмотря на периодический обмен производителями между ними и происходящее обеднение генеалогической структуры породы в целом. Действительно, если в 1960-х годах прошлого столетия жеребцы-производители племенного ядра породы относились к 9 линиям, а матки - к 20, то к началу XXI века в производящем составе вследствие «давления ипподромов три самые скороспелые линии жеребцов Пиона, Болтика и Пилота стали самыми распространёнными» (Рождественская, 2003, С. 132). Длительное преобладание производителей этих линий в породе привело к тому, что в маточном составе представители линий Отбоя, Пилота и Болтика также составляют более половины всего поголовья, особенно в конных заводах. Таким образом, генофонд очень сузился (Рождественская, 2003).
Во всех изученных выборках орловских рысаков наблюдается преобладание частот доминантных гомозигот MC1RE/ MC1RE и Tyrc/Tyrc над частотой рецессивных гомозигот и, соответственно, количественное преобладание (среди рысаков не серых мастей) гнедых и вороных лошадей над рыжими. При этом отмечено, что все «несерые» лошади с генотипом MClRee обладают рыжей мастью. Полученное распределение генотипов полокусу MC1R не отклоняется от установленных ранее (Robbins et al., 1993; Marklund et al., 1996) закономерностей. Генотипическая характеристика обследованного производящего состава пяти конных заводов выявила дифференциацию также и по распределению фенотипов масти. Обнаруженное специфическое соотношение генотипов по локусам пигментообразования, при котором наблюдается количественное преобладание гомозигот над генотипами, имеющими хотя бы один рецессивный аллель, может быть следствием косвенного искусственного отбора против мутантных рецессивных гомозигот по локусам MC1R и Туг, видимо оказывающих неблагоприятное повреждающее влияние на селекционно-значимые параметры рысаков. Такой отбор, очевидно, может осуществляться в популяциях, хотя его действие не всегда обнаруживается стандартными статистическими методами, в частности из-за недостаточной численности выборок. Косвенный отбор может быть связан с большей жизнеспособностью, лучшими приспособительными качествами, а также с большим соответствием критериям отбора в производящий состав лошадей, имеющих в своём генотипе доминантные аллели обоих локусов. Не исключается также обусловленность обнаруженного соотношения генотипических частот и случайными факторами (генетико-автоматическими процессами).
Сравнение распределения генотипов по локусу Туг с распределением фенотипов по масти в данном исследовании подтвердило, что мутация Туга, проявляя своё действие на молекулярном уровне, не оказывает влияния на изменение окраски у орловских рысаков. Напротив, локус MC1R с аллелями Е и е можно рассматривать как генетический фактор, детерминирующий масть лошадей, так как дифференциация генотипической структуры по этому локусу по законам классической генетики окраски соответствует распределению мастей в изученной выборке (табл. 29-32). Наше заключение хорошо соотносится с данными, полученными на лошадях других пород (Robbins et al., 1993; Reissmann, 1998).
Выявленная статистически значимая неоднородность генотипического и аллельного разнообразия изучаемых популяций орловских рысаков, наряду с нарушением генетического равновесия в некоторых популяциях по двум полиаллельным системам - системе эстеразы Es и системе трансферрина свидетельствует о непосредственной вовлеченности этих систем в искусственный и естественный отбор, осуществляющиеся в орловской рысистой породе. Вполне вероятно, что определённые численно преобладающие генотипы, например EsG/I, по локусу эстеразы, имеют меньшую общую приспособленность, чем генотипы, несущие аллели EsF/1. В целом наше исследование полиморфизма по системе эстеразы показало, что в орловской рысистой породе существует чёткая межпопуляционная дифференциация по частотам генотипов.
Для существования породы и успешной селекционной работы с ней фенотипическая и генотипическая дифференциация популяций по изученным параметрам имеет большое практическое значение. В результате постоянно действующего естественного отбора по плодовитости и адаптивным качествам маток в производящем составе остаются животные, успешно размножающиеся в различных эколого-географических условиях, вместе с тем соответствующие стандарту селекции породы по основным критериям (работоспособности, экстерьеру и типу). Например, при изучении воспроизводительных способностей кобыл различных фенотипов по масти отмечена тенденция наиболее длительного использования в производящем составе конного завода кобыл гнедой масти, с генотипами, детерминируемыми «нормальными» аллелями локусов пигментообразования. При этом кобылы серой масти, преобладающей в орловской рысистой породе вследствие повышенного спроса на «нарядных» лошадей, имели менее продолжительный срок и эффективность использования в штате маток. Данное предположение о предпочтительности гнедой масти для естественного отбора подтверждается обнаруженной связью серой масти со сниженной рождаемостью жеребят у кобыл этого фенотипа (табл. 10-12).
Литературные данные также свидетельствуют в пользу этого предположения. Генетически обусловленное ослабление пигментации нередко сопровождается заболеваниями, которые снижают хозяйственно-полезную ценность домашних животных или даже полностью лишают её (Визнер, Виллер, 1979). Выделяют большую группу аномалий репродуктивной функции, выражающуюся в снижении или полной потере плодовитости при осветлении пигментации (Хатт, 1969).
