Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы .
1.1. Морфофункциональные особенности течения патологических процессов в печени при токсическом поражении .
1.2. Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная защита организма
1.3. Общая характеристика нанокомпозитных селенсодержащих материалов
Глава II. Результаты собственных исследований
2.1. Материалы и методы исследований
2.1.1. Определение антиоксидантной активности препарата in vitro
2.1.2. Моделирование токсического повреждения печени
2.1.3. Методы биохимического исследования
2.1.4. Методы исследования острой токсичности
2.1.5. Методы патоморфологического исследования .
2.1.6. Методы статистической обработки результатов исследований
2.2. Оценка биологического действия нанокомпозитного препарата селена на организм животных
2.2.1. Антирадикальная активность нанокомпозитного препарата селена in vitro
2.2.2. Антиоксидантная активность нанокомпозитного препарата селена in vivo .
2.2.3. Исследование острой токсичности нанокомпозитного препарата селена
2.2.4. Морфофункциональная оценка биологического действия нанокомпозитного препарата селена при токсическом поражении печени
Глава III. Заключение
Выводы
Предложения и рекомендации
Список принятых сокращений
Список литературы
Список иллюстрированного материала
Приложения
- Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная защита организма
- Общая характеристика нанокомпозитных селенсодержащих материалов
- Определение антиоксидантной активности препарата in vitro
- Оценка биологического действия нанокомпозитного препарата селена на организм животных
Введение к работе
Актуальность работы.
Функции печени в организме очень разнообразны: в ней вырабатывается желчь, имеющая большое значение для пищеварения, печень задерживает и ассимилирует продукты переваривания, в ней протекает синтез и расщепление пуриновых тел, аминокислот, белков, жиров, накапливаются витамины и микроэлементы. Этот орган способен фиксировать скрытые повреждения, которые проявляются в ближайшие или отдаленные сроки. Огромное значение играют барьерные функции печени – задерживаются или изменяются и выводятся вместе с желчью многие ядовитые вещества эндогенного и экзогенного происхождения. При заболеваниях печени падает её окислительная способность и уменьшается обезвреживающая функции (Кудрявцев А.П., 1984; Зайцев С.Ю., 2004). Значительная роль печени в синтезе и сохранении ферментов. Такв этом органемаксимальная активность фермента глутатионпероксидазы, которая напрямую зависит от обеспеченности организма селеном.
В Иркутской области недостаток селена, так же как и недостаток йода в почве, является эндемической патологией (КудрявцевА.П., 1984; Ильина О.П., 2000). Для предотвращения патологий, связанных с недостатком селена (Se), в животноводстве используют препараты, в которых Se содержится в виде синтетических комплексов селенита натрия или селен-метионина, что часто является причиной селенозов животных (Решетник Л.А., 1999).
Селен (Se) привлекает внимание животноводов как биотический элемент, выполняющий в исчезающее малых количествах важные биохимические функции, а также как высокотоксичный элемент, неорганические соединения которого более ядовиты, чем соединения молибдена, мышьяка и ванадия (Георгиевский В.И., 1979; Синдирева А.В.,2012). Биологическая активность селена обусловлена его участием в регуляции образования антиоксидантов. Существует тесная корреляция между уровнем в организме селена и активностью селен-содержащего фермента глутатионпероксидазы, который является фактором антиоксидантной защиты (Зайцев С.Ю., Конопатов Ю.В., 2004; Георгиевский В.И.,1979; Решетник Л.А., 1999).
В последние годы развивается новый подход к получению терапевтических препаратов, основанный на иммобилизации лекарственных средств на полимерных носителях. Это позволяет улучшить их фармакологические свойства и снизить токсичность.
Одной из важных и актуальных тенденций в развитии фармакологической терапии является создание нанокомпозитных систем направленной доставки веществ в органы и ткани, повышающих эффективность действия лекарственного вещества на организм человека или животных (Зубов В.П. с соавт., 1999; NiemeyerC. M., MirkinC.A., 2004; KubikTeyal., 2005; TorchilinV., 2006; BharadBushan, 2007; EhudG., 2007; ClaudioN., 2008; Ткачук В. А. с соавт., 2008; Цыб А. Ф., 2008; Швец В. И., 2008).
Цель и задачи исследования: изучение действия нанокомпозитного препарата селена на организм животных и его роли в механизмах защиты поврежденной печени.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи
-
Оценка антиоксидантной активности нанокомпозитногопрепарата селена invitro.
-
Установление степени токсичности нанокомпозитного препарата селена.
-
Определение концентрации факторов перекисного окисления липидов (ПОЛ): диеновых конъюгатов (ДК), малоновогодиальдегида (МДА) на модели токсического гепатита и на фоне введения нанокомпозитного препарата селена.
-
Определение факторов антиоксидантной защиты (АОЗ): супероксиддисмутаза (СОД), антиоксидантная активность (АОА), глутатионпероксидаза(GSH), витаминов А и Е.
-
Установлениесаногенетического эффектананокомпозитного препарата селена на морфологическую структуру печени.
Научная новизна исследования
Установлено, что нанокомпозитный препарат селена (наноразмерныйSe в решетке арабиногалактана) в выбранной нами дозе 2мг/100гр массы животного не оказывает повреждающего действия на организм животных, а оказывает выраженное протекторное действие на печень. Проявляет антиоксидантную активность, о чем свидетельствует снижение уровня маркеров ПОЛ и повышение активности глутатиона. Доказано, что применение нанокомпозитного препарата селена в экспериментальной профилактике отравления тетрахлорметаном способствует уменьшению метаболических и морфологических нарушений.
Таким образом установлено, что Se, взятый в наноразмерном состоянии, не проявляет повреждающего действия на организм животных. Нанокомпозитный препарат селена, благодаря сродству арабиногалактановой матрицы к асиалогликопротеиновым рецепторам (с мембранотропными свойствами) гепатоцитов, макрофагов, ретикулоцитов позволяет изучаемому данному терапевтическому средству внедрять Se в эти клетки путем рецепторно-обусловленного эндоцитоза. На основании анализа литературных данных и собственных исследований разработана концептуальная схема протекторного действия нанокомпозитного препарата селена при интоксикации тетрахлорметаном, важнейшим элементом которой является ингибирование активности ПОЛ.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные экспериментальные данные являются доклиническим обоснованием применения нанокомпозитного препарата Se для профилактики и лечения заболеваний животных, вызванным недостатком этого микроэлемента, особенно в недостаточных по селену зонах. А так же для защиты печени от повреждающего действия эндо- и экзотоксикантов.
Предложенная концептуальная схема является доклиническим обоснованием для дальнейшего изучения действия нанокомпозитного препарата селена на организм животных.
Препарат может применяться в экспериментальной и ветеринарной практике для профилактики и лечения редокс-зависимых заболеваний.
Апробация работы
Основные результаты исследования представлены на международной Байкальской научно – практической конференции по проблемам ветеринарной медицины «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» Иркутск, 15-16 марта 2011г.; на региональной научно – практической конференции «Актуальные проблемы АПК» Иркутск, 20-22 апреля 2011г.; в I Международной научно-практической конференции «Перспективы развития научных исследований в 21 веке» г.Москва 2013 г.; на международной научно-практической конференции молодых ученых «научные исследования и разработки к внедрению в АПК» 17-18 апреля 2013 г; международной научно-практической конференции, посвященной 60 летию аспирантуры ИрГСХА 3-5 декабря 2013 г.; в семинаре «Научно-практические аспекты применения лекарственных растений в производстве пищевых продуктов 19-20 декабря 2013 г., Казахстан, г. Семей.
Внедрение результатов научных исследований в практику
Материалы по экспериментальному исследованию нанокомпозитного препарата селена используются в учебном процессе и научной работе ФГБОУ «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» при чтении дисциплин «Ветеринарная патофизиология» и «Ветеринарная экология» на кафедре анатомии, физиологии и микробиологии (протокол №2 от 23.09.2013 г);используются в учебном процессе и научной работе на кафедре патанатомии и гистологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана» (протокол №19 от 11.12.2013); используются в учебном процессе по курсу «Внутренние болезни животных», «Токсикология», «Фармакология» ФГБОУ ВПО Алтайский государственный аграрный университет (протокол №11 от 17.12.2013); используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе кафедры патологии, морфологии и физиологии, факультета ветеринарной медицины и зоотехнии ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет» (протокол №4 от 16.12.2013); приняты к внедрению в производство или к использованию в разработках на кафедрах института ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина (от 18.12.2013); приняты к использованию в учебном процессе кафедры анатомии, патологической анатомии и хирургии, а также используются в научно-исследовательской работе Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медицины КрасГАУ (протокол №6 от 27.11.2013); используются в учебном процессе кафедры «Внутренние незаразные болезни и акушерство» ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет» (протокол №4 от 15.12.2013); приняты к внедрению в учебный процесс и научную работу кафедры морфологии и физиологии животных Сельскохозяйственного института ФГБОУ ВПО «Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова» (протокол №6 от 27 декабря 2013г).Получена приоритетная заявка на изобретение «Антиоксидантное средство с гепатопротекторным эффектом на основе наноструктурированного селена и способы его получения и применения»: заявление от 30.12.2013; регистрационный № 2013159311.
Публикации результатов исследований.
По материалам диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикации результатов диссертации на соискание степени кандидата наук, и получена 1 приоритетная заявка на изобретение РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав, включающих обзор литературы, собственные исследования, обсуждения полученных результатов, выводов, предложений и рекомендаций, и списка литературы и приложений; иллюстрирована 8 таблицами и 23 рисунками. Указатель литературы включает 179 источников, из них 118 работы отечественных и 61 – зарубежных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Новый нанокомпозитный препарат селена в экспериментах invitro обладает антиоксидантным действием.
-
В исследованиях invivo изучаемый препарат достоверно снижает негативные эффекты перекисного окисления липидов, усиливает систему антиоксидантной защиты.
-
В условиях эксперимента при токсическом повреждении, обеспечивает более раннюю регенерацию клеток печени и меньшее повреждение в данном органе.
Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная защита организма
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) является неотъемлемой частью жизни организма, его гомеостаза. Именно благодаря ПОЛ происходит обновление липидов биомембран, митогенез, окислительное фосфорилирование в митохондриях, перенос электронов, восстановление железа и др. (Болдырев А.А., Биомембранология: учеб. пособие/ Петрозаводск: Изд-во Кар. НЦ РАН, 2006. 226с.). Постоянно протекающие реакции пероксидации в клеточных мембранах способствуют обновлению их липидного состава и поддержанию активности липидзависимых ферментов. Активация ПОЛ необходима для неспецифической адаптации организма в окружающей среде (Величковский Б.Т. Свободнорадикальное окисление как звено срочной и долговременной адаптации организма к факторамокружающей среды // Вестн. РАМН. 2001. № 6. С.45–52). Доказана роль ПОЛ в различных физиологических процессах, таких как физические тренировки, когда во время тренировок наступает гипоксическая активность с целым рядом негативных аспектов кислорода, то есть наступление окислительного стресса (Стаценко Е.А. Окислительный стресс в дозировании физических нагрузок // Физиотерапия, бальнеология и реабилитация. 2009. № 4. С.33–36; Powers S.K. Influence of exercise and fiber type on antioxidant enzyme activity in rat skeletal muscle // Amer. J. Physiol. 1994. Vol.266. P.375–380); холодовые адаптации (Саяпина И.Ю. Количественный анализ функциональной активности семенника крыс при окислительном стрессе, индуцированном адаптацией к низким температурам // Вестник новых медицинских технологий. 2011. Т.18, №2. С.155–157; Spasic M.B. Effect of term exposure to cold on the antioxidant defense system in the rat // Free Rad. Biol. Med. 1993. № 3. P.291–299); пищевые адаптогенов и диеты, oбoгащенные жирными кислотами (Сазонтова Т.Г. Адаптация к периодической гипоксии и диета с ПНЖК щ-3-класса, обладающие кардиопротективным действием, повышают устойчивость Са-транспорта саркоплазматического ретикулума миокарда к свободнорадикальному окислению // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1995. № 7. С. 42–45); гипобарическая тренировка, обладающая мембраностабилизирующим эффектом в обычном и адаптационном режиме (Киселев С.О. Механизм действия ГБО на организм // Гипербарическая физиология и медицина. 2002. № 2. С.3–7); важное значение имеет оксидативный баланс для нормального течения беременности (Ванько Л.В., Сафронова В.Г., Матвеева Н.К. Значение оксидативного стресса в развитии осложнений беременности и послеродового периода // Акушерство и гинекология. 2010. № 2. С.7–11; Колесникова Л.И. [и др.] Изучение состояния процесса липопероксидации у женщин различных этнических групп с угрозой прерывания беременности // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2010. № 6 (76). С.31–33).
В настоящее время любой патологический процесс в организме рассматривается с точки зрения перекисного окисления липидов. При патологических состояниях в организме баланс в системе ПОЛ-АОЗ изменяется, приводя к развитию «окислительного стресса» или нарушению прооксидантно-антиоксидантного баланса в пользу прооксидантных факторов, которые могут вызвать потенциальные повреждения (Балаболкин М.И., Креминская В.М., Клебанова Е.М. Роль окислительного стресса в патогенезе диабетической нейропатии и возможность его коррекции препаратами а-липоевой кислоты // Проблемы эндокринологии. 2005. Т.51, № 3. С.22–33; Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса // Вопросы медицинской химии. 2001. Т. 47, вып. 6. С.561–581; Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты. М.: МАИК Наука, 2001. 343 с.; Колесникова Л.И., Осипова Е.В., Гребенкина Л.А. Окислительный стресс при репродуктивных нарушениях эндокринного генеза у женщин. Новосибирск: Наука, 2011. 116 с.; Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. Свободнорадикальное окисление как универсальный компенсаторно-приспособительный механизм // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные и клинические аспекты. Новосибирск, 2002. С.304–305; Sies H. Оxidative Stress: Oxidants and antioxidants // Academic Press, London. 1991. P.15–22; Betteridge D.J. What is oxidative stress // Metabolism. 2000. Vol.49. P.1865–1874). Окислительный стресс проявляется усилением процессов ПОЛ, о чем говорит характерное увеличение содержания хотя бы одного из его продуктов. Причем данные о содержании продуктов ПОЛ несут информацию о степени и глубине патологического процесса. Маркерами ПОЛ являются такие интермедиаты, как диеновые конъюгаты (ДК), малоновый диальдегид (МД), наличие двойных связей (Дв.св.), общая антиокислительная активность (АОА), супероксиддисмутазы (СОД), содержание окисленного (GSH) и восстановленного (GSSG) глутатионов и их соотношение.
В организме образуются промежуточные и побочные продукты восстановления молекул кислорода – активные формы кислорода, такие как супероксидный (О2-), гидроксильный (НО), пергидроксильный (НО2), пероксильный (RO2) и алкоксильный (RO) радикалы, оксид азота (NO), пероксинитрит (ONOO-), гипохлорит (HOCl), перекись водорода (H2O2) и др. Помимо продуктов восстановления О2, к АФК относят также озон (О3) и синглетный кислород 1О2, то есть кислород, находящийся в возбужденном (синглетном) состоянии (Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестн. РАМН. 1998. № 7. С.43–51; Осипов О.А., Азизова Ю.А., Владимиров Ю.А. Активные формы кислорода и их роль в организме // Успехи соврем. биологии, 2003. Т. 31. C.180–208; Титов В.Н. Основы патогенетической классификации форм артериальной гипертонии // Российский кардиологический журнал. 2009. № 2 (76). С.79–95) и образующийся в ходе процессов, связанных с транспортом электронов по дыхательной цепи. В обычных условиях на генерацию АФК расходуется от 1 до 5% потребляемого кислорода. Однако эта величина может существенно возрастать при изменении кислородного баланса организма – при гипероксии или гипоксии. В результате последовательного восстановления молекулярного кислорода происходит образование супероксидного аниона, перекиси водорода, гидроксильного радикала.
Обладая исключительно высокой реакционной способностью, АФК подвергают окислительной деструкции многие компоненты клеток (нуклеиновые кислоты, белки, углеводы), но особое значение для поддержания гомеостаза имеет свободнорадикальное перекисное окисление липидов, что обусловлено решающей ролью биомембран в обеспечении функционирования живого организма (Владимиров Ю.А., Арчаков В. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. 252 с.; Ланкин В.З., Тихадзе А.К., Осис Ю.Г. Моделирование каскада ферментных реакций в липосомах, включающих свободнорадикальное окисление, восстановление и гидролиз полиеновых ацилов фосфолипидов для исследования влияния этих процессов на структурно-динамические параметры мембраны // Биохимия. 2002. Т.67, № 5. С.679–689).
Среди кислородных свободных радикалов наибольшее значение отводят супероксидному анион-радикалу (О2-), поскольку именно он считается родоначальником многих других активных форм кислорода. Супероксидный радикал (СОР) образуется при присоединении одного электрона к молекуле кислорода в основном состоянии (Chen R., Warden J.T., Stonken J.A. Microdialysis sampling combined with electron spin resonance for superoxide radical detection in microliter samples // Anal. Chem., 2004. Vol.76. P.4734–4740). СОР активно восстанавливает железо из трехвалентного в двухвалентное состояние в присутствии ионов негемового железа. Поскольку двухвалентное железо играет важную роль в образовании агрессивных липидных и гидроксильных радикалов, это свойство СОР имеет большое значение (Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестн. РАМН. 1998. № 7. С.43–51).
Общая характеристика нанокомпозитных селенсодержащих материалов
Нанотехнологии в медицине приобретают все большую популярность. Они позволяют достоверно определять такие биомаркеры как ДНК, белки, метаболиты в целях диагностики заболеваний и контроля за процессом лечения. Дают возможность проводить визуализацию патологических процессов в организме с помощью селективных контрастных агентов на основе наночастиц, диагностировать инфекционные и вирусные заболевания человека и животных при помощи биочипов и тест-систем нового поколения (Нанотехнологии. Азбука для всех / под. ред. Ю. Д. Третьякова. М.: Физматлит, 2008. 368 с). Для медицины созданы нанороботы для коррекции клеточных и молекулярных дефектов в организме. Так, для наилучшей и более точной доставки лекарственных веществ в клетки-мишени (в частности в опухолевые клетки) разработан наноробот (это генно-модифицированная бактерия сальмонелла, которая «тянется» к опухолям посредством хемотаксиса). В сальмонелле находится наноробот, выпускающий капсулу с лекарственным веществом, как только бактерия достигнет опухоли (Корейцы сделали наноробота для борьбы с раком [Электронный ресурс] / Режим доступа: http://www.nanonewsnet.ru/news/2014/koreitsy-sdelali-nanorobota-dlya-borby-s-rakom . 8.01.2014). Стоит обратить внимание на тот факт, что наноробот все же содержит лекарственное вещество, т.е. химический элемент, обладающий противоопухолевой активностью, а, вероятно, и токсическим действием на организм.
Всё больше встречается разработок адресной доставки лекарственных веществ в клетки и ткани с помощью наночастиц, вирусных частиц, липосом и молекулярных моторов (Конструирование наночастиц для адресной доставки терапевтических средств в клетки и их органеллы / Ткачук В.А. и [др.] / С.191; Ламажапова Г П. Морфология органов иммуногенеза нерпы байкальской и эксперементальная оценка эффективности её липидов при разных патологиях: автореф. дис. д-ра биол. наук: 06.02.01 / Галина Петровна Ламажапова. Улан-Удэ, 2011. 290 с.).
Вопросам диспергирования в фармацевтической технологии придается особое значение. Известно, что с уменьшением размера частиц резко увеличивается поверхностная энергия диспергируемого лекарственного вещества. При тонком измельчении лекарственные вещества лучше растворяются, значительно изменяют свои химические свойства и реакционную способность. Диспергирование может существенным образом влиять на терапевтическую активность лекарственных веществ вследствие изменения процессов их всасывания. Это происходит при изменении растворимости лекарственных веществ, при этом скорость растворения прямо пропорциональна площади поверхности и обратно пропорциональна величине частиц вещества (Технология лекарственных форм: учеб. под ред. Т.С. Кондратьевой. М.: Медицина, 1991. Т.1. 496с). Уменьшение размера частиц вещества до десятка нанометров и ниже приводит к тому, что свойства вещества начинают определяться не только и не столько его химическим составом, сколько размером. (Наноразмерные пленки антител на основе полиэлектролитов для целей высокочувствительной иммунодиагностики / Евтушенко Е.Г. [и др.] // Российские нанотехнологии : электронный журнал. 2007. Т.2, №1-2. С.145-153. Режим доступа: http://nanorf.ru/science.aspx?cat_id=4353&d_no=4405. 11.02.2013; Олейников В.А., Суханова А.В., Набиев И.Р. Флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы в биологии и медицине // Российские нанотехнологии: электронный журнал. 2007. Т.2, №1-2. С.160-173. http://nanorf.ru/science.aspx?cat_id=4353&d_no=4405. 11.02.2013; Garnett M.C., Kallinteri P. Nanomedicines and nanotoxicology: some physiological principles // Occupatinal Medicine-Oxford. 2006. P.307-311). В отличие от «классических» частиц, доля поверхностных атомов у наночастиц значительно больше и растет с уменьшением частицы (Сеземин И.А. Наноматериалы: перспективы антибактериального применения в ветеринарии [Электронный ресурс] // Ветеринарная медицина: сайт. – Режим доступа: http://veterinarua.ru/stati-i-issledovaniya/1147-nanomaterialy-perspektivy-antibakterialnogo-primeneniya-v-veterinarii.html. 11.11.2013; Лен, Ж.–М. Супрамолекулярная химия: Концепции и перспективы. Новосибирск: Наука, 1998. 334с). Поскольку фармакологический «ответ» на лекарственное вещество прямо пропорционален его концентрации в требуемой области и ряду других параметров, а распределение молекул в организме определяется их физико – химическими свойствами (и они не всегда обладают необходимой аффинностью к поврежденной области), то зачастую для эффективного лечения требуется введение в организм значительно больших количеств лекарственных веществ, чем необходимо для данной патологии органа и ткани. Такое экстенсивное применение приводит к проникновению лекарственных веществ в здоровые органы, ткани и клетки, что вызывает токсические эффекты (Тырхеев, А. П. Общая рецептура и технология лекарственных форм: учеб.–метод. пособие. Улан-Удэ: Изд-во БГСХА им. В. Р. Филиппова, 2008. 68 с.; Torchilin V. Nanoparticulates as Drug Carriers. 756p.).
Идея создания новых систем доставки лекарственных веществ принадлежит области онкологии. Поскольку препараты для лечения опухолей обладают высокой общей токсичностью, молекулы, высокой реакционной способностью, то стало необходимым создание особых систем направленной доставки, обеспечивающих, с одной стороны, физическую изоляцию активного начала от внешней среды на пути к мишени и, с другой – его высвобождение в пораженном участке или внутри него (Новый биологически активный препарат на основе наночастиц селена / Храмцов А.Г. [и др.] С.122-125). Всё больше открытий сделано в пользу использования композитных материалов в медицине и ветеринарии (Медицинские нанотехнологии. Перспективы использования фуллеренов в терапии болезней органов дыхания / Ширинкин С.В. [и др.]. / отв. ред. докт. мед. наук, проф. М. В. Покровский. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2009. 183с).
Однако введение только размерного параметра нельзя признавать удовлетворительным и окончательным в создании нанокомпозитных систем доставки лекарственных веществ. Во-первых, в данном случае многие лекарственные вещества должны быть отнесены к объектам обычной медицины, т.к. размеры их не превышают 1 нм. Во-вторых, введение только размерного параметра не позволяет выделить существенного принципиального отличия нанофармакологических препаратов от фармакологических препаратов обычной медицины (Головин Ю.И. Введение в нанотехнику. М.: Машиностроение, 2007. 496 с). В основе нанотехнологий лежат особые свойства наночастиц, отличные от свойств объемной фазы, а именно проявление квантовых эффектов и существенная роль свободной поверхности (Головин Ю.И. Введение в нанотехнику. 496 с). Исследования процессов всасывания лекарственных веществ и проведенные опыты показали, что на терапевтическую эффективность особое влияние оказывают следующие факторы, которые и названы фармацевтическими: физическое состояние лекарственного вещества (размер частиц, форма кристаллов, наличие или отсутствие заряда на поверхности частиц и др.); химическая природа лекарственного вещества (соль, кислота, основание, количество гетероциклов, эфирные связи, комплексные соединения и т.д.); вспомогательные вещества, их природа, физическое состояние, количество; вид лекарственной формы и пути ее введения; фармацевтическая технология. Более того, сочетание введенной дозы и химической формы лекарственного вещества играют фундаментальную роль в определении его токсичности (Griffiths C. A comparison of the monetized impact of IQ decrements from mercury emissions. P.841–847; Clarkson T.W. The toxicology of mercury-current exposures and clinical manifestations. P.1731–1737).
Среди перечисленных факторов наибольшее значение имеют следующие факторы: физическое состояние лекарственного вещества, наличие вспомогательных веществ и их природа (Пат. 2392944 Российская федерация. МПК А61К 31/785, А61К 33/04, А61Р 3/02. Препарат для лечения и профилактики нарушения обмена селена для сельскохозяйственных животных / Оробец В. А., Серов А. В., Беляев В. А., Киреев И. В., Мирошниченко М. В.; заявитель и патентообладатель ФГОУ ВПО Ставропольский гос. агр. ун-т. № 2008137463/15; заявл 18.09.2008; опубл. 27.06.2010, Бюл. №18. 10 с). Немаловажным фактором при применении нанотехнологий является и «отслеживание» наночастиц в биологическом материале. Это возможно благодаря возможности наночастиц к флуоресценции или наличию квантовых точек. Поскольку ведется активная работа в изучении биологического действия нанокомпозитных материалов, уже сделано большое количество открытий и исследований в области синтезирования и применения препаратов на основе наночастиц химических элементов и органических полимеров - стабилизаторов (матриц) (Нанотехнологии и наноматериалы в ветеринарии [Электронный ресурс] / Министерство сельского хозяйства РФ. М., 2011. 15с. –Электрон. версия печат. публ. – Режим доступа: http://guv.tatarstan.ru/rus/file/pub/pub_95316.pdf . – 11.09.2013).
В качестве азотсодержащих полимеров могут быть использованы: поливинилпирролидон, желатин, хитозан и другие азотсодержащие полимеры, способные стабилизировать наночастицы нуль-валентного селена. Препарат повышает иммунную резистентность организма животных и может быть использован в качестве препарата, снижающего частоту селенового дефицита. (Пат. 2392944 Российская федерация. МПК А61К 31/785, А61К 33/04, А61Р 3/02. Препарат для лечения и профилактики нарушения обмена селена для сельскохозяйственных животных / Оробец В. А., Серов А. В., Беляев В. А., Киреев И. В., Мирошниченко М. В.; заявитель и патентообладатель ФГОУ ВПО Ставропольский гос. агр. ун-т. – № 2008137463/15; заявл 18.09.2008; опубл. 27.06.2010, Бюл. № 18. – 10 с).
Определение антиоксидантной активности препарата in vitro
Определение антиоксидантной активности in vitro проводили в ИИХ СО РАН. Для оценки антиоксидантной активности (АОА) нанокомпозитного препарата селена использовали спектрофотометрический метод, в котором радикал-катион 2,2 -азинобис(3-этилбентиозолин-6-сульфоновой кислоты) диаммониевой соли (ABTS+), имеющий характерное поглощение в области 600-850 нм, генерировали персульфатом калия и измеряли процент ингибирования поглощения добавляемыми антиоксидантами (Antioxidant activity applying an improved abts radical cation decolorization assay / Re R. [et al.] // Free Radical Biology & Medicine. 1999. Vol.26, №. 9/10. P.1231–1237).
Методика определения. Антиоксидантную активность определяли по методике, описанной в работе (Применение радикал катионов ABTS+ в оценке антирадикальной активности флавоноидов / И. Р. Ильясов и др. // Фармация. 2008. №6. С.15–18). Для определения АОА использовали раствор чистого арабиногалактана, а также его нанокомпозита с селеном с концентрациями 0,54-0,55% в дистиллированной воде. Растворы аскорбиновой кислоты в воде и кверцетина в этаноле готовили с концентрациями 0,002 моль/л и 0,00057 моль/л, соответственно. Генерирование катион-радикала ABTS+ проводили, добавляя к 2,5 мл раствора ABTS с концентрацией 7 ммоль/л в солевом фосфатном буфере (PBS рН=7,4) равный объем раствора персульфата калия в том же буфере с концентрацией 2,5 ммоль/л. Для приготовления рабочего раствора ABTS+ его исходный раствор разбавляли буфером PBS, термостатировали в течение 15 мин при фиксированной температуре 30С. Затем измеряли оптическую плотность рабочего раствора ABTS+ при длине волны 730 нм. Если поглощение в максимуме составляло 0,7±0,01 единиц оптической плотности, то продолжали эксперимент, прибавляя по 3,9 мл рабочего раствора ABTS+ к ранее отобранным микроколичествам от 10 до 60 мкл соответствующего антиоксиданта с концентрациями, которые вызывали подавление поглощения ABTS+ в интервале 20-60%. Емкости с рабочими растворами интенсивно встряхивали, выдерживали в темноте при температуре 30С в течение 4 минут, а затем измеряли оптическую плотность при 730 нм. Раствор сравнения - PBS, толщина кюветы d=1 см. Процент ингибирования рассчитывали по формуле: % ингибирования = 100 (1 - А2/А1) где А1 - оптическая плотность раствора ABTS+ на длине волны 730 нм без добавления исследуемого образца; А2 - оптическая плотность раствора ABTS+ через 4 минуты после добавления исследуемого образца.
Токсическое повреждение печени моделировали путем подкожного введения 50% масляного (оливковое масло) раствора тетрахлорметана (CCL4) на протяжении 4 дней в дозе 2 мл/кг. Введение изучаемых веществ осуществляли за 1 час до применения гепатотоксина. Контрольные животные получали токсикант и эквиобъемное с гепатопротектором количество воды (Таблица 1) (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. под общ. ред. члена-корр. РАМН, проф. Р.У. Хабриева. М.: Медицина, 2005. 832 с).
Изучаемый композитный препарат нано-Se вводили животным перорально через зонд в дозе 2 мг/100 г массы животного (исходя из информации о содержании селена в нанокомпозитном препарате и эффективных доз селенита натрия), предварительно растворив сухой препарат в 3 мл воды. Поскольку АГ входит в состав изучаемого препарата, он явился препаратом сравнения и его также растворяли в воде и вводили перорально через зонд в дозе 20мг/100 г (Гуцол Л.О. Патогенетическое обоснование применения арабиногалактана для коррекции нарушений в печени при интоксикациях фенилгидрозином и этиленгликолем: дис. канд. биол. наук: 14.00.16. Иркутск, 2006. 165 с). Группа интактных животных содержалась в тех же условиях, при таком же кормлении, как опытные и контрольные группы. Таблица 1 – Дизайн эксперимента
Концентрацию МДА в сыворотке крови определяли по методу В.Б. Гаврилова, А.Р. Гавриловой, Л.М. Мажуль, с помощью тиобарбитуровой кислоты (ТБК) (Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль Л.М. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой // Вопросы медицинской химии. 1987. № 1. С.118–122; Гаврилов В.Б., Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперикисей липидов в плазме крови // Лабораторное дело. 1983. № 3. С.33–36). Принцип метода основан на образовании окрашенного комплекса при взаимодействии МДА с тиобарбитуровой кислотой. При нагревании в кислой среде часть продуктов ПОЛ, относящихся к классу эндоперекисей, разлагается с образованием малонового диальдегида, связывание молекулы которого с двумя молекулами ТБК приводит к формированию окрашенного комплекса. Реакцию проводят под контролем внутреннего и внешнего стандарта, используя растворы: контрольный (0,2 мл дистиллированной воды вместо сыворотки) и стандартный (0,2 мл 510-6М раствора 1,1,3,3 - тетраметоксипропана («ICN») вместо сыворотки, что соответствует содержанию 1 нмоль МДА пробы). В каждой пробе регистрировали интенсивность флуоресценции при lвозб=515нм и lисп=554нм на спектрофлюорофотометре Shimadzu (RF-1501, Япония). Концентрацию МДА выражали в мкмоль/л.
Определение содержания субстратов с сопряженными ненасыщенными двойными связями (ДВ. СВ.), диеновых конъюгат (ДК), кетодиенов и сопряженных триенов (КД и СТ)
Содержание ДК в сыворотке крови определяли по методу И.А.Волчегорского, А.Г.Налимова, Б.Г.Яровинского, Р.И.Лифшица (Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного определения липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови / Волчегорский И.А. [и др.] // Вопросы медицинской химии. 1989. № 1. С.127–131). Принцип метода основан на интенсивном поглощении конъюгированных диеновых структур гидроперекисей липидов в области 220 (ДВ.СВ.), 232 (ДК), 278 (КД и СТ) нм. Измерения производились на спектрофотометре СФ–56 (Россия). Для расчета ДК использовался молярный коэффициент экстинкции: К=2,2 105 Моль-1 См-1. Содержание двойных связей (ДВ. СВ.) и кетодиенов и сопряженных триенов (КД и СТ) выражали в отн. ед., диеновых конъюгатов (ДК) в мкмоль/л. Определение активности супероксиддисмутазы (СОД)
Определение активности СОД проводили методом H.P. Misra, I. Fridovich (Misra H.P. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase // J. Biol. Chem. 1972. Vol.247. P.3170–3175). Метод основан на способности СОД тормозить реакцию аутоокисления адреналина при РН = 10,2. Реакцию в пробах, содержащих гемолизат эритроцитов, начинали добавлением адреналина. Измерение активности СОД проводили на спектрофлюорофотометре Shimadzu (RF-1501, Япония) при l= 320 нм. За условную единицу активности фермента принимали такое количество СОД, которое требовалось для ингибирования скорости аутоокисления адреналина на 50%. Активность СОД выражали в усл.ед.
Оценка биологического действия нанокомпозитного препарата селена на организм животных
Как уже говорилось выше, селен обладает антиоксидантным действием. Основная задача, которая решалась на данном этапе исследований – оценить антиоксидантное действие нанокомпозитного препарата селена в условиях in vitro и сравнить его с АГ, а также с известным антиоксидантом – аскорбиновой кислотой. На основании полученных результатов строили графики зависимости процента ингибирования от концентрации антиоксиданта (Рисунок 3) и определяли IC50 - концентрацию, при которой нейтрализуется 50% радикал-катионов, также рассчитывали наиболее универсальную относительную характеристику АРА - TEAC - эквивалент антиоксидантной активности в пересчете на тролокс, активность которого принимают за 1. Данные по АРА изученных соединений представлены в таблице 2.
Достоверность полученных величин IC50 оценивали среднеквадратической ошибкой (s) и доверительным интервалом среднего значения (x), вычисленным для n измерений при 95% вероятности по формулам (Doerffel K. Statistics in Analytical Chemistry / K. Doerffel // Deut. Verlag Grundstoffind., Leipzig, 1966.).
Как видно из таблицы 2, АРА композита селена с арабиногалактаном не уступает АРА аскорбиновой кислоты. Поскольку исходный арабиногалактан не способен ингибировать ABTS+ при значительно более высоких концентрациях, чем композит на его основе, можно полагать, что АРА последнего определяется наличием Se.
Арабиногалактан Не обладает Не обладает Нанокомпозит арабиногалактана и селена 18±2.9 s=2.5; n=6 0.91 - Стандарт (аскорбиновая кислота) 16.1±1.1s=0.96; n=5 0.98 0.712 13.7 2.2.2. Антиоксидантная активность нанокомпозитного препарата селена in vivo
Существующие литературные данные и собственные исследования in vitro, свидетельствующие об антиоксидантной роли Se, позволили нам выдвинуть гипотезу о том, что позитивный эффект при даче нанокомозитного препарата селена при токсическом повреждении печени определяется адресной доставкой Se в клетки печени при помощи АГ, что и определяет антиокисдантную защиту и протекторное действие на гепатоциты.
Как можно видеть из результатов, представленных в таблице 3, содержание Дв. св. в каждой из четырех исследованных групп имеет сходную тенденцию к изменению: самая высокая величина измеряемого показателя остается у интактных животных, затем несколько снижается в группе с нано-Se, заметно ниже в группе с арабиногактаном и самый низкий показатель Дв.св. в серии животных, которые получали чистый четыреххлористый углерод. Другими словами, нанокомпозитный препарат селена во все сроки эксперимента предохраняет ненасыщенные структуры жирных кислот от окисления, что в последующем может положительно сказаться на характер течения процессов липопероксидации мембранных структур.
Действительно, как показывают результаты таблицы 3, концентрация первичных продуктов ПОЛ при использовании нано-Se иногда даже статистически значимо не отличается от аналогичных показателей, характерных для серии интактных животных.
Представляется закономерным, что наноселен, введенный в матрицу арабиногалактана, оказывает положительный эффект и при генерации так называемых ТБК-активных продуктов, которые могут ингибировать биологически активные амины и которые вносят значительный вклад в генерацию эндогенной интоксикации (Зайчик А.Ш. Основы патохимии. Том 2. СПб.: Элби-СПб, 2001. 688 с).
Не исключено, что определенная защитная функция от вводимого токсиканта обусловлена и арабиногактаном, который может обладать этим эффектом в серии экспериментов через 21 сутки, когда потери наночастиц селена значительны, а освободившаяся органическая матрица может проявить описанные антиоксиданные гепатопротективные свойства (Колесникова Л.И. Окислительный стресс при репродуктивных нарушениях эндокринного генеза у женщин. Новосибирск: Наука, 2011. 116 с.; Чистяков Ю.В. Основы бионеорганической химии. М.: КолосС, 2007. 539 с).
Известно, что достоверную информацию о состоянии любой редокс-системы, включая целостный организм, можно получить не только изучая активность радикальных процессов, но и при одновременном исследовании компонентов, определяющих мощность антиоксидантной подсистемы с ее низкомолекулярными и ферментативными звеньями (Колесникова Л.И. Роль процессов перекисного окисления липидов в патогенезе осложнений беременности: автореф. дис. д-ра мед. наук. Иркутск, 1993. 39 с.; Сазонтова Т.Г. Значение баланса прооксидантов и антиоксидантов – равнозначных участников метаболизма // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2007. № 3. С. 2–18). ДК – нетоксичный промежуточный продукт ПОЛ, и при дальнейшем окислении ДК образуют МДА, который оказывает отрицательное воздействие на организм, известное как редокс-ассоциированные поражения. Во все сроки эксперимента содержание промежуточных продуктов (ДК) в группе нанo-Se ниже, чем в группах сравнения, и приближается к показателю группы интактных животных. Следовательно, и образование МДА из ДК достоверно ниже, чем в остальных группах. Такой показатель как АОА – показатель защиты организма от действия свободных радикалов и соединений О2 – всегда оставался на одном уровне в группе нанo-Se и даже превышал таковой у интактных животных, в то время как в группах с АГ и CCL4 был значительно снижен во все дни эксперимента.
Анализ такого интегрального показателя, как величина общей АОА, показывает (Таблица 3), что при введении экспериментальным животным наноселена этот показатель практически не изменяется по сравнению с таковым для интактных крыс; кроме того, статистически значимо он превышает аналогичные данные для арабиногалактана и особенно для четыреххлористого углерода.
