Механизмы внутриклеточной сигнализации при реинициации мейоза в ооцитах сельскохозяйственных животных Денисенко, Виталий Юрьевич

Введение к работе

Актуальность темы. Одной из важнейших и актуальных проблем современной биологии развития является выяснение механизмов активации и ингибирования мейоза в ооцитах животных. Основным подходом к решению этой проблемы является изучение механизмов внутриклеточной сигнализации в клетках при активации и ингибировании мейоза. Эта область исследований имеет не только теоретическую, но и большую практическую значимость, так как интенсификация внедрения клеточных репродуктивных технологий в животноводство, биомедицину, фармакологию вызывает необходимость детального изучения механизмов формирования зрелой яйцеклетки. В настоящее время разработаны методы, позволяющие получать высокий процент яйцеклеток коров (Bols et al., 2012) и свиней (Coy et al., 2005) при созревании ооцитов in vitro, однако, при последующем оплодотворении лишь треть из них развивается до стадии морулы и бластоцисты. Успех культивирования зависит от многих факторов, важнейшим из которых является создание системы культивирования, обеспечивающей полноценное дозревание ооцитов, компетентных к оплодотворению и дальнейшему развитию из них эмбрионов (Kuzmina et al., 2007; 2010). Моделирование процессов ядерного и цитоплазматического созревания основывается на детальном знании процессов, детерминирующих реинициацию и ингибирование мейоза. Для прохождения процессов мейоза необходима передача сигналов внутрь клетки. В плазматической мебране проходят процессы, преобразующие внешние сигналы во внутриклеточные. Восприятие клеткой внешних сигналов происходит в основном благодаря взаимодействию различных веществ с рецепторами, расположенными на поверхностной мембране клетки. С помощью рецепторов распознаются приходящие сигналы и приводятся в действие внутриклеточные пути передачи сигналов, которые, в конечном счете, приводят к запуску и регуляции различных клеточных процессов. Несмотря на огромное разнообразие стимулов, существует всего несколько универсальных сигнальных систем, передающих при взаимодействии стимула с рецептором информацию различным клеточным органеллам и запускающих определенные физиологические процессы в клетке. В настоящее время установлено, что важным моментом внутриклеточной передачи сигналов является изменение транспорта и внутриклеточной концентрации различных ионов. Доказано, что изменение внутриклеточной концентрации Ca²⁺, Na⁺, K⁺, H⁺, Cl^- играет существенную роль в процессах активации и регуляции различных общих и специализированных клеточных функций. В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании путей активации клеток, в которых роль основного вторичного посредника выполняют ионы Ca²⁺. Изменения в транспорте и внутриклеточной концентрации Ca²⁺ играют ключевую роль в запуске и регуляции общих и специализированных клеточных функций, таких как пролиферация, рост, секреция, сокращение и т.д. (Berridge, 1995; 1998). Увеличение концентрации цитоплазматического кальция происходит за счет освобождения Ca²⁺ из внутриклеточных депо и входа в клетку внеклеточного кальция. К внутриклеточным депо относятся такие внутриклеточные органеллы, как шероховатый эндоплазматический ретикулум, комплекс Гольджи и кальциосомы (Galione, Churchill, 2002). При всех значительных успехах, достигнутых в познании механизмов формирования зрелой яйцеклетки, до сих пор не выяснены многие вопросы, касающиеся регуляторных механизмов мейоза и раннего эмбриогенеза. Необходимость в получении углубленных знаний, связанных с изучением механизмов внутриклеточной сигнализации, детерминирующих реинициацию мейоза в женских гаметах овариальных фолликулов животных обусловили направление наших исследований.

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы явилось исследование механизмов регуляции Са²⁺ сигналов и, в первую очередь, освобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо (ВД) в соматических (клетки гранулезы) и половых (ооциты) клетках овариальных фолликулов свиней и коров при реинициации мейоза. В соответствии с вышеуказанной целью были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать типы ВД кальция, детерминирующих освобождение Са²⁺ в ооцитах свиней при действии активаторов обмена Са²⁺ и активаторов увеличения концентрации цАМФ.

2. Изучить эффект хлортетрациклина на возможность проникновения низкомолекулярных соединений в клетки гранулезы свиней.

3. Изучить взаимодействие между различными (IP₃(инозитолтрифосфат)- и рианодинчувствительными) ВД Са²⁺ при воздействии активаторов обмена Са²⁺ и увеличении концентрации цАМФ.

4. Исследовать влияние стероидных гормонов на взаимодействие между различными ВД Са²⁺ (IP₃- и рианодинчувствительными) после добавления активаторов обмена Са²⁺ и увеличения концентрации цАМФ.

5. Выявить особенности кальциевой сигнализации из ВД растущих и завершивших фазу роста ооцитов свиней.

6. Охарактеризовать интрацеллюлярные процессы, детерминирующие механизмы воздействия соматотропина (СТГ) на мобилизацию кальция при реинициации мейоза в ооцитах свиней.

7. Изучить взаимодействие между IP₃- и рианодинчувствительными ВД в ооцитах свиней, выделенных из яичников в лютеальной фазе.

8. Исследовать совместное действие IP₃- и рианодинчувствительных ВД клеток гранулезы и влияние стероидных гормонов на их взаимодействие.

9. Охарактеризовать взаимодействие ВД в ооцитах коров, выделенных из яичников на стадии фолликулярного роста при действии активаторов обмена Са²⁺.

Научная новизна. Диссертационная работа является первым комплексным исследованием механизмов регуляции Са²⁺ сигналов и, в первую очередь, освобождения Са²⁺ из ВД в соматических (клетки гранулезы) и половых (ооциты) клетках овариальных фолликулов свиней и коров. При выполнении работы впервые были получены следующие результаты:

Определены типы ВД и рецепторов на поверхности этих депо, стимулируемые активаторами обмена Са²⁺ и увеличения концентрации цАМФ в ооцитах свиней. Изучено взаимодействие между IP₃- и рианодин-чувствительными ВД кальция при использовании активаторов обмена Са²⁺ и увеличения концентрации цАМФ в ооцитах свиней. Показано влияние стероидных гормонов (эстрадиол, тестостерон и прогестерон) на взаимодействие между IP₃- и рианодинчувствительными ВД кальция, стимулированное активаторами обмена Са²⁺ и увеличения концентрации цАМФ в ооцитах свиней. Обнаружены различия в механизмах освобождения Са²⁺ в ооцитах свиней, находящихся на разных стадиях роста – растущих и завершивших фазу роста. Идентифицированы во ВД (IP₃- и рианодинчувствительных) типы внутриклеточных рецепторов и показано взаимодействие этих ВД в ооцитах свиней, выделенных из яичников в лютеальную фазу. В клетках гранулезы обнаружено взаимодействие между IP₃- и рианодинчувствительными ВД и охарактеризовано влияние стероидных гормонов на взаимодействие между ними. Показано влияние хлортетрациклина на перенос во внутриклеточное пространство низкомолекулярных соединений в ооцитах и клетках гранулезы свиней. В ооцитах коров установлены типы внутриклеточных рецепторов на поверхности IP₃- и рианодинчувствительных ВД и изучено взаимодействие этих ВД.

Теоретическая и практическая значимость работы. Основной конструктивной характеристикой работы является полученная информация, необходимая для понимания фундаментальных механизмов внутриклеточной сигнализации и, в первую очередь, освобождения Са²⁺ из ВД в соматических (клетки гранулезы) и половых (ооциты) клетках овариальных фолликулов свиней и коров при реинициации мейоза, которая может быть использована при оптимизации методов клеточных репродуктивных технологий. На основании полученных данных высказано предположение о возможности образования связи и перехода Са²⁺ между различными ВД кальция (IP₃- и рианодинчувствительными). Представлена гипотеза, согласно которой реинициация мейоза зависит от перехода Са²⁺ из рианодин- в IP₃-чувствительные ВД, а ингибирование мейоза связано с переходом Са²⁺ из IP₃- в рианодинчувствительные ВД. Показано участие стероидных гормонов в регуляции процессов реинициации и ингибирования мейоза, детерминированное перемещением Са²⁺ между рианодин- и IP₃-чувствительными ВД. Разработана тест-система оценки качества донорских ооцитов, используемых в клеточных репродуктивных технологиях, позволяющая определить фазу роста ооцитов для предварительной селекции донорских ооцитов перед культивированием. Предложен способ прижизненной оценки целостности цитоскелета, основанный на оценке изменения концентрации внутриклеточного кальция в интактных и имеющих повреждение структурных элементов цитоскелета клетках. Предложен способ доставки биологически активных веществ в клетки животных, основанный на способности антибиотика хлортетрациклина образовывать на поверхности клеток поры небольшого диаметра, которые обеспечивают перенос в клетки млекопитающих низкомолекулярных соединений, не проникающих внутрь клеток.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Переход и освобождение Са²⁺ из ВД ооцитов приводит к увеличению концентрации цитоплазматического Са²⁺ и активации клеток. Реинициация мейоза в ооцитах свиней детерминируется переходом Са²⁺ из рианодин- в IP₃-чувствительные ВД, перемещение Са²⁺ в обратном направлении – из IP₃- в рианодинчувствительные ВД ингибирует реинициацию мейоза.

2. В завершивших фазу роста ооцитах свиней обмен Са²⁺ между рианодин- и IP₃-чувствительными ВД осуществляется в обоих направлениях, в растущих ооцитах Са²⁺ переходит только в одном направлении – из IP₃- в рианодинчувствительные ВД.

3. В ооцитах свиньи, выделенных из яичников на стадии желтого тела, в отличии от ооцитов, выделенных из яичников на стадии фолликулярного роста, отсутствует переход Са²⁺ между рианодин- и IP₃-чувствительными ВД кальция.

4. Стероидные гормоны оказывают различное влияние на переход Са²⁺ между рианодин- и IP₃-чувствительными ВД кальция. Эстрадиол стимулирует переход Са²⁺ из рианодин- в IP₃-чувствительные ВД, тестостерон – в обратном направлении (из IP₃- в рианодинчувствительные), прогестерон ингибирует переход Са²⁺ между внутриклеточными депо.

5. В ооцитах свиней переход Са²⁺ между ВД (рианодин - в IP₃-чувствительными) происходит в обоих направлениях, в клетках гранулезы Са²⁺ перемещается между ВД только в одном направлении – из рианодин- в IP₃-чувствительные ВД.

6. В ооцитах свиней Са²⁺ перемещается между рианодин- и IP₃-чувствительными ВД, в ооцитах коров отсутствует переход Са²⁺ между внутриклеточными депо.

7. В трансдукцию Са²⁺ из рианодин- в IP₃-чувствительные ВД вовлекаются микротрубочки, в перемещении Са²⁺ в обратном направлении – из IP₃- в рианодинчувствительные ВД участвуют микрофиламенты.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 25 международных научных конференциях: «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 1995; 2000), «Проблемы индивидуального развития с.-х. животных» (Киев, 1997), «Селекционно-генетические и биотехнологические методы консолидации новообразованных пород и типов сельскохозяйственных животных» (Киев, 1999), «Повышение эффективности ведения свиноводства» (Быково, 2000), «Современные проблемы развития животноводства» (Жодино, 2000), «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005; 2007; 2009; 2011), «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (Дубровицы, 2002; 2003; 2004; 2006), «Современные проблемы селекции и племенного дела в животноводстве» (С.-Петербург–Пушкин, 2002), «Актуальные проблемы интенсификации производства продукции животноводства» (Жодино, 2005), «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 2006), II Съезд общества клеточной биологии (С.-Петербург, 2007), «Проблемы повышения эффективности производства животноводческой продукции» (Жодино, 2008), «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии» (Дубровицы, 2008; 2009), «Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных» (С.-Петербург–Пушкин, 2009), «Пути интенсификации отрасли свиноводства в странах СНГ» (Гродно, 2009), «Биологические ресурсы» (Киров, 2010), «Инновационные технологии в животноводстве» (Жодино, 2010), «Современные технологии сельскохозяйственного производства» (Гродно, 2011), «Повышение интенсивности и конкурентноспособности отраслей животноводства» (Жодино, 2011), «Теоретические и практические аспекты оологии в современной зоологии» (Киев, 2011), Всероссийских симпозиумах «Биология клетки в культуре», «Клеточная биология на пороге XXI века», «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» и «Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет» (С.-Петербург, 1999, 2001; 2003; 2004; 2006; 2007; 2009; 2012).

Публикации результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 117 научных работ, из них 20 – в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК («Онтогенез», «Цитология», «Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова», «Theriogenology», «J. Repr. Dev.»).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 251 странице, содержит 56 таблиц, 29 рисунков и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических предложений и библиографического списка, включающего 390 цитируемых источников.

Похожие диссертации на Механизмы внутриклеточной сигнализации при реинициации мейоза в ооцитах сельскохозяйственных животных

Молекулярные механизмы "обратной сигнализации", опосредованной Fas-лигандом Прусакова Ольга Вадимовна

Роль вестибулярной сигнализации в механизме регулирования холодового тремора Кузьмина Галина Ивановна

Механизмы кальциевой сигнализации в электро-невозбудимых клеткахКазначеева Елена Валентиновна

Исследование вероятностно-временных характеристик механизмов управления нагрузкой в сети сигнализации ШЦСИСНурмиев Марат Хамзиевич