Введение к работе
Актуальность исследований. Изучение закономерностей роста растений является основой для разработки новых технологий управления их продуктивностью Рост является интегральным производным всех процессов, протекающих в растительном организме на этапах онтогенеза, которые находятся под контролем эндогенных регуляторних систем Познание механизмов регуляции ростовых процессов и раскрытие их связей с другими факторами онтогенеза способствует решению важнейших научно-практических задач целенаправленного изменения роста, морфогенеза и развития растений
Рост как показатель физиологического состояния растений обладает высокой чувствительностью к изменению внутренних и внешних факторов и, тем самым, наиболее пригоден для определения объема и сроков необходимого вмешательства, в том числе при оценке экологической приспособленности и адаптивных возможностей растений Это особенно важно при разработке современных технологий в генетике, селекции и практике растениеводства (Смирнов, 1970, Батыгин, 1986, Шевелуха, 1992)
Спектр биологически активных веществ, молекулярно-биологических и биохимических механизмов, способных включаться в реализацию программ роста, развития и реализации защитных реакций растительной клетки весьма разнообразен К таким соединениям до недавнего времени были отнесены фитогормоны - ауксины, цитоки-нины, гиббереллины, брассиностероиды и ингибиторы АБК, этилен, фенольные соединения и др Они наиболее изучены и представлены в многочисленных статьях, обзорах и монографиях (Кораблева, Метлицкий, 1973, Чайлахян, 1975, Гуськов, 1975, Процко, Сытник, 1979, Hess, Dieter, 1973, Кефели, 1978,1992)
В последнее 20-летие открыты и изучаются растительные олигосахариды, фрагменты распада полисахаридов клеточной стенки, обладающие широким спектром ре-гуляторных функций в растениях (Albersheim, Darvill, 1992, Усов, 1993) Олигосахариды подавляют рост, стимулируемый ауксинами, прорастание семян, улучшают процессы фотосинтеза, ускоряют транспорт питательных веществ, увеличивают биомассу растений, улучшают развитие корневой системы, способствуют эмбриогенезу и морфогенезу в трансплантатах растительных тканей, повышают устойчивость к стрессовым ситуациям (Fry, Aldington, Hartelington et al, 1983, York, Darvill, 1992, Долгих, Шайкин, Усов и др 1988) Такой широкий спектр биологического действия позволяет сделать заключение, что олигосахариды действуют как сигнальные молекулы, участвующие в регуляции различных функций растительного организма
Один из представителей регуляторних фитоолигосахаридов является предметом наших исследований на протяжении более 30 лет Выделенный ингибитор роста дрожжей из проростков гороха идентифицирован как олигосахарид с новыми биологическими свойствами, ранее неизвестными для олигосахаридов, с антивитаминным действием в отношении одного из самых распространенных витаминов группы В в живых организмах - пантотеновой кислоты (ПК, витамин В5) В процессе экспериментальных исследований этому новому антивитаминному фактору нами было дано условное название пизамин. Изучение его биологических свойств, роли в регуляции метаболических и ростовых процессов и механизма действия в растительном организме имеет большое значение для познания разнообразия биологически активных веществ растений и получения новых знаний о функциях фитоолигосахаридов в растительном организме Изучение пизамина, как антивитамина ПК, обостряет внимание
и к проблеме участия витаминов группы В и, в частности, коферментной формы ПК-кофермента ацетилирования (КоА), в жизнедеятельности растений
Невозможно представить рост, морфогенез в растении без образования de novo многочисленных органических веществ или возникающих в результате распада сложных биополимерных и комплексных соединений и усвоения их структурных компонентов в процессе роста. Эти процессы протекают при участии специфических ферментов, катализирующих ход пластического и энергетического метаболизма, лежащего в основе роста. Активность значительной части таких ферментов определяется коферментом, в структуре которого присутствуют витамины группы В, в чем и проявляется биологическая каталитическая функция витаминов в живом организме Поэтому наряду с фито-гормонами, специфичными индуктивными регуляторами роста следует рассматривать и витамины (коферменты) как регуляторы роста метаболических путей В этой связи В И Кефели (1981) отнес витамины к негормональным факторам роста растений, убедительно доказывая участие витаминов в каталитических реакциях, усиливающих ростовые процессы, в том числе активируемые фитогормонами Влияние витаминов на ростовые процессы довольно детально изучено, что отражено в ранних обзорных работах (Чайлахян, 1958, Овчаров, 1969, Карабанов, 1977, Oertl, 1987)
Витамины, как предшественники коферментов, являются эндогенными регуляторами роста и развития растений, функции которых, как и фитогормонов, регулируются в растительном организме различными путями, в том числе ингибированием активности, что необходимо для сбалансированности и оптимизации метаболизма В этом плане они подчиняются универсальной системе саморегулирования - стимулятор/ингибитор, что предполагает наличие антивитаминных факторов Обнаружение, выделение и изучение антивитаминов (антикоферментов) является важной задачей для познания роли витаминов в жизненных процессах растений, закономерностей их роста и путей направленного его управления
Антивитаминные факторы широко распространены в растениях и идентифицированы практически для всех витаминов Но их обнаружение, как правило, не связывалось с физиологией растительного организма и выявлялось по действию на животных, у которых при поедании растительной пищи наблюдались признаки типичного авитаминоза, устраняемые добавлением витаминов (Mellanby, 1930,1949, Wens, 1952, Weswig, Freed, Haag, 1946, Kodichek, 1949, Bar, 1954, Костов, Гахниян, 1964, Островский, 1973)
Можно утверждать, что роль природных антивитаминных факторов в росте растений до настоящего времени практически не изучена.
Следует отметить, что образование антивитаминных факторов присуще не только высшим растениям, но и животным и низшим организмам (Hanka, Berg, Kelly, 1966, Островский, 1973) Это может служить доказательством особой роли этих веществ, причастных к фундаментальным механизмам регуляции метаболизма. Поэтому изучение природы образования, структуры и механизма действия, значение их в реализации функции коферментов и ростовых процессах растений имеет важнейшее значение для различных направлений и проблем биологии высших растений и животных
В первую очередь возникает вопрос о значении антивитаминов в растительном организме как возможных регуляторов функций витаминов (коферментов) в обмене веществ, росте и развитии и вероятных путей осуществления целенаправленного вмешательства в эти процессы
Ответ на данный вопрос получен путем всестороннего изучения природного антивитаминного фактора ПК, выделенного из проростков гороха, который до настоя-
щего времени, как высокоспецифичный антивитамин, является единственным представителем фитоолигосахаридов, образуемых в растении Это раскрывает малоизученную сторону процессов регуляции закономерностей роста и развития растений с участием антивитаминного фактора, что и определило цель наших исследований
Данное направление исследований заслуживает особого внимания, поскольку большинство растительных организмов синтезирует необходимые вещества самостоятельно В то же время существует значительное количество примеров из фито-фармации, когда весьма эффективно эксплуатируется антивитаминный механизм действующей лекарственной субстанции из растений Таким образом, витамины являются предшественниками как «протеидизированных» коферментов (флавопротеи-ды, пиридоксалевые ферменты), так и «свободно диссоциированных» (КоА, NAD, NAD) в ближайшем окружении энзимов, взаимодействующих с активными центрами каталитических биополимеров
Цель исследований - изучить природу, биологические свойства и механизм действия антивитаминного фактора пантотеновой кислоты (ПК), витамина Bs олигосахарид-ной природы (пизамина), выделенного из проростков гороха (Pisum sativum L), как природного негормонального регулятора ростовых процессов растений
Реализация поставленной цели достигалась выполнением следующих задач исследования
Разработать технологию выделения и очистки пизамина из проростков гороха, изучить его физико-химические свойства и определить химическую природу
Разработать метод анализа и изучить динамику образования пизамина в онтогенезе растений гороха, условия его синтеза и накопления в органах проростков
Изучить влияние содержания и динамики накопления эндогенного пизамина и его соотношения с различными формами ПК в растении на характер роста проростков гороха, динамику активности окислительных ферментов и процесса дыхания в онтогенезе органов проростков гороха.
Изучить антивитаминное действие экзогенного пизамина на ростовые процессы в растениях, взаимоотношение с фитогормонами в процессе роста растяжением и некоторые метаболические процессы в растении
Изучить специфичность, механизм антивитаминного действия пизамина в растительном и животном организмах как антивитамина пантотеновой кислоты, в том числе воздействие на биосинтез ее коферментной формы - КоА
Установить характер особенностей и специфичности антивитаминного действия пизамина на рост, физиологические и биохимические процессы дрожжевых грибов и других микробных организмов
Используя дрожжевые грибы как тестовую культуру, исследовать особенности взаимодействия пизамина с метаболитами, антиметаболитами, производными ПК и другими антивитаминными факторами
Научная новизна. Впервые выделен новый природный антивитамин ПК из высшего растения (Pisum sativum L ), который идентифицирован как олигосахарид с условным названием «пизамин»
Изучена динамика образования и накопления пизамина в растительном организме в онтогенезе, условия его биосинтеза, связь с дифференцированным и ритмичным изменением роста системы корень/стебель и междоузлий проростков гороха
Впервые получены экспериментальные данные об антивитаминном действии пизамина в растительном и животном организмах Установлен механизм антивитамин-
ного действия как неконкурентного антагониста ПК, снижающего биологическую активность коферментной формы витамина- КоА
Впервые показано участие пизамина как негормонального и, преимущественно, метаболического регулятора ростовых процессов в высшем растении, снижающего активность связанных форм ПК (предшественников КоА и КоА), не влияющего на биологический синтез витамина.
Установлены особенности характера и специфичности взаимодействия пизамина как антивитамина ПК с метаболитами и антиметаболитами с протеиногенными аминокислотами, природными и синтетическими производными ПК и КоА Выявлены соединения, инактивирующие и усиливающие действие пизамина, его синергизм в антибиотическом действии с другими антивитаминными факторами
Показано взаимодействие антивитаминного фактора с фитогормонами 0-индолилуксусной и гибберелловой кислотами в регуляции ростовых процессов растений
Установлена последовательная адаптация дрожжевых грибов к антивитамину с приобретением ими полной резистентности к пизамину, закрепляемой генетически и сохраняемой в свойствах дрожжей неопределенно длительное время Тем самым констатируется получение мутантного штамма, который обладает повышенной интенсивностью роста, сокращенным лаг-периодом, с активированным синтезом белка и высокой бродильной активностью
Основные положения, выносимые на защиту:
Выделение, очистка, физико-химические свойства и химическая природа пизамина - природного антивитамина пантотеновой кислоты
Условия образования, динамика накопления и распределения пизамина в онтогенезе растений гороха (Pisum sativum L)
Зависимость характера роста органов проростков гороха от содержания эндогенного пизамина, различных форм пантотеновой кислоты и активности окислительных ферментов
Характер действия экзогенного пизамина, как негормонального регулятора, на ростовые и некоторые метаболические процессы растений
Видовая специфичность и механизм действия пизамина как антивитамина пантотеновой кислоты в растительном и животном организмах, реализуемая на уровне биохимических функций КоА
Особенности антивитаминного действия пизамина на рост дрожжевых грибов и изменение их физиолого-биохимических и морфологических свойств
Специфичность взаимодействий пизамина с метаболитами и антиметаболитами в культурах дрожжевых грибов
Теоретическая и практическая значимость. Установлено присутствие в проростках Pisum sativum L нового биологически активного вещества, антивитамина важнейшего витамина группы В — ПК, подавляющего каталитические функции КоА в метаболических и ростовых процессах растений, животных и других организмов
Результатами проведенных исследований расширено представление о регуляторних функциях фитоолигосахаридов как негормональных регуляторов роста через модуляцию метаболических процессов
Установлено участие пизамина, антивитамина ПК, в подавлении роста междоузлий растяжением в проростках гороха и регуляции соотношения роста системы «корень - стебель», как фактора, задерживающего рост стебля и обеспечения приоритетного роста корня проростков
Установлен механизм антивитаминного взаимодействия пизамина с ПК (КоА) в
регуляции ростовых процессов в растении, заключающийся в нарушении каталитической функции коферментной формы витамина - КоА
Установлена связь динамики накопления пизамина с изменением аминокислотного и белкового обмена в процессе роста междоузлий растяжением и переходом клетки от интенсивного роста растяжением к замедлению и прекращению роста.
Разработана модель ПК-недостаточности в экспериментах на животных с использованием препарата пизамина.
Олигосахарид из Pisum sativum, как высокоактивное вещество с антивитаминным действием, может служить основой для получения синтетических аналогов и использования их в качестве антибиотических веществ, в частности, для борьбы с грибными болезнями растений
Обосновано использование устойчивых к пизамину адаптированных дрожжевых культур для количественного определения ПК в биологическом материале, в котором может присутствовать антивитаминный фактор
Доказана возможность использования высокой специфичности пизамина к организмам, не синтезирующим витамин, в качестве теста при установлении потребности в экзогенной пантотеновой кислоте различных микроорганизмов
Личный вклад автора. Диссертация включает экспериментальные материалы исследований, проведенных автором лично или под его руководством Автор непосредственно участвовал в разработке научно-теоретического обоснования направлений исследований, в постановке конкретных исследовательских задач, разработке методов и подходов их экспериментального решения и анализа Вьмснение механизмов антивитаминного действия витамина осуществлено частично в Институте биохимии НАН Беларуси (акад Ю М Островский, член-корр А Г Мойсеенок), а идентификация олигосахаридной природы пизамина проведена в Институте органической химии им И Д Зелинского РАН (под руководством проф А И Усова)
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях Астраханского государственного педагогического института (1973-1977, 1991, 1994-1996), научных конференциях Астраханского государственного педагогического университета (1997, 1999, 2000), Третьем всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1974), 4-м Гродненском симпозиуме «Химия, биологические функции и применение пантотеновой кислоты» (Гродно, 1977), Республиканской конференции «Витамины и фитогормоны в растениеводстве» (Вильнюс, 1981), Втором координационном совещании преподавателей педагогических институтов (Орел, 1981), симпозиуме «Биохимия, фармакология и медицинское применение производных витаминов и других предшественников коферментов (Иркутск, 1983), VII Гродненском симпозиуме «Антивитамины в регуляции обмена веществ (эксперимент, клиника)» (Гродно, 1983), совещании физиологов растений пединститутов РСФСР (секция II «Рост растений и его регуляция», Пенза, 1984), Республиканской научной конференции «Витамины и фитогормоны в растениеводстве» (секция 1 «Реализация генетической программы в ответе организмов на фитогормоны и витамины и в мутагенезе», Вильнюс, 1986), семинаре-совещании физиологов растений педагогических институтов (Вологда, 1990), семинаре-совещании физиологов растений педагогических институтов и университетов (Смоленск, 1993), Всероссийской научной конференции «Астраханский край история и современность (Астра-хань, 1997), Международной научно-практической конференции по пасленовым культурам (Астрахань, 2003), IX Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2006)
Результаты исследований опубликованы в журналах «Прикладная биохимия и микробиология», «Микробиология», «Физиология растений», «Биологические науки», «Вестник Московского областного университета» (серия «Естественные науки»), «Южно-российский вестник геологии, географии и глобальной энергии», «Естественные науки», «Весщ Акадэмп навук БССР» (сер бшлапчных навук), а также в сборниках научных работ «Регуляция роста растений», «Рост растений и пути его регулирования», «Рост растений и его гормональная регуляция»
Публикации. Всего опубликовано 65 работ, в том числе по теме диссертации 45, из них 10 - в ведущих рецензируемых журналах, 19 - в центральных рецензируемых журналах и 16 - в материалах симпозиумов и конференций
Структура и объем диссертации. Диссертация построена по монографическому типу и состоит из введения, 9 глав основного текста (включая обзоры литературы, результаты и обсуждение собственных исследований), выводов, научно-практических рекомендаций, библиографического списка и приложения
