Введение к работе
Актуальность проблемы. Современная эпоха в развитии человеческого общества характеризуется усилением техногенного воздействия на окружающую среду. Результатом хозяйственной деятельности человека являются ухудшение качества среды его обитания и снижение устойчивости природных экосистем, в частности агроэкосистем. Сельскохозяйственное производство - это основная транспортная магистраль переноса радиоактивных и токсичных веществ в цепи почва-растение-животное, а продукция растениеводства и животноводства - главный источник их поступления в организм человека [Алексахин P.M., 2006; Анненков Б.Н. и др., 2004; Корнеев Н.А. и Сироткин А.Н., 1987; Пристер Б.С., 2006; Радиобиология и радиоэкология...., 1973; Сироткин А.Н. и Ильязов Р.Г., 2000; Смирнов A.M., 2006]. Следует отметить, что наиболее чувствительным компонентом агроэкосистем при воздействии физических и химических факторов считают сельскохозяйственных животных. Поэтому обеспечение устойчивого развития животноводства в условиях техногенного загрязнения территорий становится важной задачей сельскохозяйственной экологии.
Экологическая ситуация в ряде областей Российской Федерации (РФ) характеризуется одновременным воздействием физических, химических и биологических факторов с невысоким уровнем экспозиции радиоактивных и токсичных веществ. Организация и ведение сельскохозяйственного производства в этих регионах требуют оценки характера воздействия и риска формирования патологий животных. Основные закономерности ответной реакции организма сельскохозяйственных и лабораторных животных получены при действии ионизирующих излучений и химических веществ, в частности кадмия, в больших дозах [Киршин В.А. и Бударков В.А., 1990; Сельскохозяйственная ...., 1992; Шевченко А.С., 1994; Sarkar S. et al., 1994]. Данные о биологическом действии этих агентов в малых дозах (концентрациях) единичны. В связи с этим проблема изучения влияния ионизирующих излучений и кадмия в малых дозах (концентрациях) на млекопитающих имеет как теоретическое, так и практическое значение.
Хронический характер воздействия и невысокий уровень экспозиции действующих агентов не вызывают специфических изменений в организме млекопитающих, однако оказывают влияние на процессы внутриклеточного метаболизма. Физиологическая активность большинства клеток млекопитающих контролируется внутриклеточными регуляторами, к числу которых относят фосфоинозитиды, циклические нуклеотиды (цАМФ и цГМФ), ионы Са2* и активные формы кислорода (Ог', Н2О2, ОН') [Hawley S.A. et al., 2005; Singh D.K. et al., 2005; Woods A. et al., 2005; Linnane A.W. et al., 2007; Veal E.A. et al., 2007].
Модификация регуляторных процессов при действии ионизирующих излучений и кадмия в малых дозах может приводить к формированию адаптивно-защитных или патологических реакций. Однако до сих пор не выяснены молекулярные механизмы их развития [Евсеева Т.И. и Гераськин С.А., 2001]. Предполагается, что при облучении млекопитающих в малых дозах увеличивается вклад нарушений плазматической мембраны в общее повреждение клеток органов и тканей, а в дальнейшем и их гибель [Бурлакова Е.Б. и др., 1996]. В то же время состав плазматических мембран, их структурная организация и функциональная активность клетки зависят от интенсивности свободнорадикальных реакций, протекающих в организме. В свою очередь, активация процесса свободнорадикалыюго перекисного окисления липидов (ПОЛ) и нарушение Са т-гомеостаза рассматриваются в качестве механизмов цитотоксического действия ионов кадмия [Fowler В.А., 1992; Gonick Н.С., 1982; Yang R.M. et al., 2005].
Цель и задачи исследования. Целью работы стала оценка молекулярно-клеточных показателей при действии у-излучения и кадмия в малых дозах на млекопитающих. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:
-
Оценить интенсивность процесса свободнорадикального ПОЛ, содержание биоантиокси-дантов (ретинол, а-токоферол) в плазме и активность аденилатциклазы, проницаемость плазматической мембраны для ионов Са2+ в клетках периферической крови овец, подвергнутых пролонгированному воздействию у-излучения в дозах 0,1 и 0,5 Гр.
-
Исследовать интенсивность процесса свободнорадикального ПОЛ, содержание биоанти-оксидантов (ретинол, а-токоферол) и процентное соотношение жирных кислот в плазме крови овец, подвергнутых острому воздействию у-излучения в дозах 2 и 6 Гр однократно и повторно после пролонгированного облучения в дозах 0,1 и 0,5 Гр.
-
Оценить ответную реакцию организма крыс при хроническом поступлении нитрата кадмия с питьевой водой в концентрациях 0,05 и 0,1 мг/л.
-
Оценить ответную реакцию организма крыс первого и второго поколений при хроническом воздействии нитрата кадмия в антенатальный и постнатальный периоды развития.
5. Определить содержание малонового диальдегида и проницаемость плазматической мемб
раны тимоцитов крыс для ионов Са2+ при внутрибрюшинном введении кадмия в дозе 0,5
мг/кг.
-
Исследовать содержание малонового диальдегида и проницаемость плазматической мембраны для ионов Са2* в эритроцитах периферической крови коров при длительном содержании на радиоактивно загрязненных территориях.
-
Определить содержание малонового диальдегида в эритроцитах периферической крови супоросных свиноматок.
Основные положения, выносимые на зашиту:
1. Пролонгированное облучение овец в дозах 0,1 и 0,5 Гр ингибирует процесс
свободнорадикального перекисного окисления липидов и модифицирует реакцию организма
при повторном остром воздействии у-излучения в сублетальной (2 Гр) и летальной (6 Гр)
дозах.
2. Однократное острое воздействие у-излучения в диапазоне доз от сублетальной (2 Гр) до
летальной (6 Гр) активирует процесс свободнорадикального перекисного окисления липидов
плазмы крови овец.
-
Формирование адаптивно-защитных и/или патологических реакций при хроническом поступлении нитрата кадмия с питьевой водой в организм млекопитающих зависит от концентрации металла, длительности и периода воздействия (антенатальный и/или постнатальный).
-
Физиологическое состояние коров при длительном содержании на радиоактивно загрязненных территориях характеризуется увеличением проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для ионов Са2+ и концентрации малонового диальдегида.
Научная новизна. Впервые на овцах установлено, что пролонгированное воздействие у-излучения в дозах 0,1 и 0,5 Гр приводит к уменьшению в плазме крови содержания малонового диальдегида (МДА), диеновых и триеновых коньюгатов (ДК и ТК), а-токоферола при одновременном увеличении уровня ретинола. Активность аденилатциклазы в лимфоцитах периферической крови облученных овец была снижена, а в тромбоцитах отмечали фазовый характер изменений. Стимулируемая форсколином (10" моль/л) и простагландином Еі (10" моль/л) активность фермента в клетках имела более выраженный характер. Оценка пассивной проницаемости плазматической мембраны клеток для ионов Са2+ выявила повышение значений показателя в эритроцитах и нелинейный характер изменений в нейтрофилах периферической крови. Интенсивность внутриклеточного накопления ионов Са + в нейтрофилах была увеличена, хотя в начальные сроки исследования в зависимости от дозы у-излучения регистрировали разнонаправленный характер изменений.
Показано, что пролонгированное облучение овец в дозах 0,1 и 0,5 Гр модифицирует реакцию организма при последующем остром воздействии у-излучения в сублетальной (2 Гр) и летальной (6 Гр) дозах, которое свидетельствует об индукции адаптивного ответа (АО). Впервые установлено, что при остром воздействии у-излучения в сублетальной (2 Гр) и летальной (6 Гр) дозах через девять мес после пролонгированного облучения овец в дозах 0,5 и 0,1 Гр отсутствует выраженная активация процесса свободнорадикального ПОЛ и в плазме крови наблюдаются снижение интенсивности спонтанной хемилюмииесценции (СХЛ), тенденция к повышению концентрации МДА и слабое изменение содержания ДК и ТК, уровней а-токоферола и ретинола. Напротив, однократное острое воздействие у-излучения в дозах 2 и 6 Гр увеличивало интенсивность процесса свободнорадикального ПОЛ в плазме крови овец. При развитии лучевой патологии регистрировали повышение интенсивности СХЛ, концентрации МДА, ДК, ТК и а-токоферола при одновременном снижении уровня ретинола. Активация процесса свободнорадикального ПОЛ приводила к изменению процентного соотношения жирных кислот в общих липидах плазмы крови и характеризовалась как приростом суммарного количества насыщенных кислот, так и снижением ненасыщенных. Динамика значений показателей интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ в плазме крови однократно облученных овец в дозах 2 и б Гр имела нелинейный характер и была более выражена при летальной дозе у-излучения.
Установлены различия в ответной реакции организма овец при действии у-излучения в малых и больших дозах. Однократное острое облучение овец в дозах 2 и б Гр характеризуется активацией процесса свободнорадикального ПОЛ, а пролонгированное воздействие в дозах 0,1 и 0,5 Гр - ингибированием.
Показано, что при хроническом поступлении нитрата кадмия в организм крыс с питьевой водой в концентрациях 0,05 и 0,1 мг/л на 90-е сут исследования наблюдаются увеличение интенсивности внутриклеточного накопления ионов 109Cd и уровня МДА в тимоцитах при одновременном ингибировании синтеза ДНК.
Хроническое воздействие нитрата кадмия в антенатальный и постнатальный (365 сут) периоды онтогенеза крыс (поколение Fi) приводило к развитию адаптивно-защитных реакций в течение первых 120 сут исследования. В последующие сроки наблюдения (210-е и 365-е сут) регистрировали формирование негативных реакций на клеточном уровне (увеличение содержания МДА в эритроцитах периферической крови, рост внутриклеточного накопления ионов Са + и ингибирование синтеза ДНК в тимоцитах). В то же время в организме крыс второго поколения при хроническом воздействии нитрата кадмия развитие негативных реакций на клеточном уровне (ингибирование синтеза металлотионеинов в тканях печени, почек, селезенки и ДНК в тимоцитах) и в системе кроветворения (лейкопения) отмечали в течение всего периода исследования (365 сут).
Продемонстрировано, что формирование адаптивно-защитных и/или патологических реакций при хроническом поступлении нитрата кадмия в организм крыс с питьевой водой зависит от концентрации металла, длительности и периода воздействия (антенатальный и/или постнатальный).
В тимоцитах крыс, которым нитрат кадмия вводили внутрибрюшинно в дозе 0,5 мг/кг, показаны стабилизация уровня МДА и тенденция к повышению интенсивности внутриклеточного накопления ионов Са2+ при одновременном снижении пассивной проницаемости плазматической мембраны.
В эритроцитах периферической крови коров при длительном содержании на радиоактивно загрязненных территориях Новозыбковского района Брянской области наблюдали увеличение пассивной проницаемости плазматической мембраны для ионов Са2+ и концентрации МДА. Дополнительное стресс-воздействие (инкубирование клеток в гипертонической среде) обнаружило изменения функционального состояния эритроцитов.
Установлено, что содержание МДА в эритроцитах периферической крови супоросных свиноматок перед опоросом повышается, а после - снижается. Применение витаминных
препаратов перед вакцинацией животных способствовало уменьшению уровня МДА в эритроцитах периферической крови.
Теоретическая и практическая значимость работы. Получены новые экспериментальные данные об ответной реакции организма млекопитающих при воздействии у-излучения и кадмия в малых дозах, которые дополняют и расширяют существующие представления о молекулярно-клеточных механизмах действия этих агентов и позволяют оценить степень их реальной опасности. Разработана методология оценки воздействия техногенных факторов на сельскохозяйственных животных при ведении животноводства в экологически неблагополучных регионах. Рекомендуется вакцинацию продуктивных животных в условиях техногенного загрязнения территорий проводить на фоне применения витаминных препаратов. Кроме того, при составлении рациона необходимо использовать реальные данные о содержании в кормах микро- и макроэлементов, антиоксидантов, незаменимых амино- и жирных кислот.
Для обеспечения устойчивого развития животноводства на техногенно загрязненных территориях предлагается оценивать молекулярно-клеточные показатели сельскохозяйственных животных при дополнительном стресс-воздействии, что позволит выявить негативные изменения на ранних этапах развития и осуществить их своевременную коррекцию биохимико-фармакологическими препаратами.
Результаты диссертационной работы можно использовать при проведении радиоэкологического мониторинга и для разработки мероприятий, обеспечивающих устойчивое развитие животноводства в условиях техногенного загрязнения территорий.
Личный вклад диссертанта. Представленная работа является частью плановых исследований лаборатории №2 "Радиобиология сельскохозяйственных животных" (1991-1992 гг.) и сектора №3 "Молекулярная биология сельскохозяйственных животных" (1993-2007 гг.). Автору принадлежит основная роль в выборе направлений исследований, выполнении большинства экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. Сформулированы основные положения и выводы.
В работе частично использованы материалы совместных исследований сотрудников института к.б.н. Кобялко В.О. и к.б.н. Коноплевой И.В.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены на II съезде по радиационным исследованиям (Киев, 1993); II International Conference "Radiobiologikal Consequences of Nuclear Accidents" (Москва, 1994); II Обнинском симпозиуме по радиоэкологии (Обнинск, 1996); III съезде по радиационным исследованиям (Москва, 1997); II Всероссийском съезде фотобиологов (Пущино, 1998); Международной научно-практической конференции "Эколого-генетические проблемы животноводства и экологически безопасные технологии производства продуктов питания" (Дубровицы, Московская область, 1998); Международной конференции "Проблемы противолучевой защиты" (Москва, 1998); Международной научно-практической конференции "Проблемы ведения агропромышленного производства на радиоактивно загрязненных сельскохозяйственных землях в отдаленный после Чернобыльской катастрофы период" (Мичуринск, Брянская область, 1999); региональной научно-практической конференции "Инновационное развитие: достижения ученых Калужской области для народного хозяйства" (Обнинск, 1999); Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы экологии на рубеже третьего тысячелетия и пути их решения" (Брянск, 1999); IV съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2001); научно-практической конференции "Роль творческого наследия академика ВАСХНИЛ В.М. Клечковского в решении современных проблем сельскохозяйственной радиологии" (Москва, 2000); Международной научной конференции "Биотехнология на рубеже двух тысячелетий" (Саранск, 2001); II Международной конференции
"'Неионизирующие электромагнитные излучения в биологии и медицине" (Калуга, 2002); Международной конференции "Геоэкологические проблемы загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами" (Тула, 2003); научной конференции "Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты" (Санкт-Петербург, 2004); Международной научно-практической конференции "Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных" (Воронеж, 2004); И международной конференции "Геоэкологические проблемы загрязнения окружающей среды тяжелыми металлами" (Тула, 2004); Международной конференции "Радиобиологические эффекты, риск, минимизация, прогноз" (Киев, 2005); 3rd International Conference in Lithuania "Metals in the environment" (Vilnius, 2006); Международной научно-производственной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной патологии и морфологии животных" (Воронеж, 2006); V съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2006); Международной конференции "Радиоэкология: итоги, современное состояние и перспективы" (Москва, 2008).
Материалы диссертационной работы доложены на межлабораторном научном семинаре ГНУ ВНИИСХРАЭ Россельхозакадемии 21 января 2010 года.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 54 печатных работ, в том числе 17 статей.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, приложения. Диссертационная работа изложена на 244 страницах машинописи, иллюстрирована 20 таблицами и 48 рисунками. Список литературы содержит 433 источника, из которых 246 на русском и 187 на иностранном языках.
