Содержание к диссертации
Введение
1 Объекты и методы исследования 14
1.1. Объекты исследования 14
1.2. Методы исследования 20
1.2.1. Выделение, идентификация микроскопических грибов и си- нэкологическая характеристика микобиоты в наземных экосистемах 21
1.2.2. Проверка штаммов грибов на чистоту от бактериальной контаминации 22
1.2.3. Выделение ассоциаций грибов и азотфиксирующих бактерий23
1.2.4. Определение нитрифицирующей активности грибов на жидкнх средах 23
1.2.5. Определение активности образования закиси азота и окиси азота грибами на питательных средах 24
1.2.6. Изучение способности грибов к восстановлению закиси азота 26
1.2.7. Изучение влияния ацетилена, аммония и кислорода на образование закиси азота грибами 26
1.2.8. Изучение роста и образования закиси азота Fusarium oxysporum lldnl в анаэробных условиях 26
1.2.9. Изучение нитратредуктазной активности грибов в аэробных и аэробных условиях 27
1.2.9.1. Культивирование грибов и получение гомогенатов мицелия 27
1.2.9.2. Определение нитратредуктазной активности грибов 28
1.2.9.3. Определение локализации нитратредуктазы F. oxysporum lldnl 29
1.2.9.4. Определение молекулярной массы нитратредуктазы F. oxysporum I Idnl при аэробном и анаэробном росте 29
1.2.9.5. Ингибиторный анализ синтеза и регуляции активности нитратредуктазы R oxysporum lldnl при аэробном и анаэробном росте 30
1.2.10 Определение биомассы грибов и бактерии в почвах 30
1.2.10.1 Субстрат индуцированное дыхание 30
1.2.10.2, Метод люминесцентной микроскопии 31
1.2.10.3 Метод мембранных фильтров 32
1.2.10.4. Метод фумигации-экстракции 32
11. Расчет продуктивности и числа генераций микроорганизмов в почвах 34
12. Определение содержания азота в мицелии грибов, растущих в почве 34
13. Определение активности процессов трансформации азота в почвах 35
14. Определение нитрифицирующей активности грибов в стерильной почве 37
15. Определение активности образования закиси азота грибами в стерильных почвах 37
16. Определение вклада микроскопических грибов в трансфер- мацию азота в почвах с использованием ингибиторного подхода 38
1.2.16.1. Определение активности гетеротрофной нитрификации в почвах 39
1.2.16.2. Влияние ингибиторов нитрификации нарадиальную скорость роста микроскопических грибов 40
1.2.16.3 Определение влияния ингибиторов нитрификации на накопление биомассы, нитрифицирующую активность и фитотоксические свойства грибов 40
17. Определение численности автотрофных нитрифицирующих бактерий в почвах 41
18. Оценка роли грибного гидролиза растительных субстратов на активность азотфиксации в почвах 42
19. Изучение продукции ферментов грибами 42
1.2.20. Статистическая обработка экспериментальных данных 43
2. Почвенные микроскопические грибы как компонент наземных экосистем 44
2.1. Роль грибов в почвах и биосфере 44
2.2. Подходы к изучению структурно-функциональной организации биоты сапротрофных микроскопических грибов наземных экосистем 47
2.2.1. Трофические особенности почвенных сапротрофных микро-скопических грибов 48
2.2.2. Методология изучения распространения сапротрофных микроскопических грибов в наземных экосистемах 49
2.2.3. Методы определению биомассы, видового богатства и функций микроскопических грибов в почвах 50
2.2.4. Методы количественного анализа видового разнообразия и структуры биоты почвенных микромицетов 53
2.3. Жизненные стратегии грибов 62
2.4. Организация биоты сапротрофных микромицетов в почвах 66
3. Ассимиляция азота и его влияние на развитие и метаболическую активность грибов на средах и в почве 77
З.1 Ассимиляции азота грибами 77
3.1.1. Ассимиляции; ш аммонийного азота грибами 77
3.1.2. Ассимиляция нитратов и нитритов грибами 78
3.1.3. Ассимиляция органических соединений азота грибами 80
3.2. Влияние уровня азота в окружающей среде на его содержание в грибах 84
3.3. Определение содержания азота в мицелии микроскопических грибов, развивающихся в почве 85
3.4. Влияние соединений азота на прорастание, рост и развитие грибов на средах и in situ 87
З.4.1 Влияние соединений азота на прорастание спор и жизнеспособность грибов 87
3.4.2 Влияние соединений азота на рост и развитие грибов на питательных средах и почве 89
3.5. Влияние соединений азота на метаболическую активность и конкурентные взаимоотношения грибов 90
3.5.1. Влияние азотсодержащих соединений на гидролитическую активность грибов 91
3.5.2. Влияние соединений азота на конкурентные взаимоотношения грибов в почвах 93
3.6. Влияние азотных удобрений на состав микоризных грибов в наземных экосистемах и микотрофность растений 95
3.7. Влияние азотных удобрений на почвенную микобиоту и проявления микробного токсикоза почв 97
3.7.1. Влияние азотных удобрений на сапротрофную микобиоту почв 97
3.7.2. Влияние азотных удобрений на почвенные фитопатогенные грибы 102
3.7.3. Азотные удобрения и проявления микробного токсикоза почв 103
3.7.4.. Устойчивость микробного комплекса почв к минеральным удобрениям 105
4. Аммонификация и иммобилизация азота грибами в почвах 108
4.1. Распределение азота в различных компонентах наземных экосистем и его соединения в почвах 108
4.2. Минерализация и иммобилизация азота микроорганизмами и продуктивность экосистем 110
4.3. Масштабы иммобилизации азота грибами и бактериями в дер ново-подзолистых почвах, окультуренных и под ельником-кисличником 115
4.4. Аммонификация легкодоступных азотсодержащих соединений грибами и бактериями в дерново-подзолистых почвах 119
4.5. Сопряженность активности минерализации азотсодержащих соединений и газообразных потерь азота в дерново-подзолистых почвах 121
5. Участие грибов в нитрификации в почвах 127
5.1. Экологические последствия активизации нитрификации в почвах 127
5.2. Нитрифицирующие микроорганизмы: разнообразие, активность, ферменты нитрификации 129
5.2.1. Автотрофные нитрифицирующие бактерии 129
5.2.2. Гетеротрофные нитрифицирующие микроорганизмы 130
5.3. Нитрифицирующая активность микроскопических грибов на питательных средах и стерильной почве 134
5.3.1. Распространение способности к нитрификации среди почвенных микроскопических грибов 134
5.3.2. Нитрифицирующая активность микроскопических грибов на питательных средах 139
5.3.3. Образование нитратов грибами в стерильной почве 141
5.4. Эколого-физиологические аспекты образования грибами гидроксамовых кислот при гетеротрофной нитрификации 144
5.5. Автотрофная и гетеротрофная нитрификация в почвах природных экосистем и агроэкосистем 148
5.5.1. Разработка ингибитороного подхода для дифференциальной оценки вклада автотрофных и гетеротрофнных микроорга низмов в нитрификацию в почвах 149
5.5.1.1. Действие ингибиторов нитрификации на рост, нако- пление биомассы и образование нитритов и нитратов грибами на питательных средах 149
5.5.1.2. Влияние возрастающих концентраций ингибиторов нитрификации на образование нитратов в почвах 151
5.5.2. Численность автотрофных нитрифицирующих бактерий в почвах 154
5.5.3. Нитрификация в почвах естественных биоценозов и агроценозов при внесении сульфата аммония и пептона 155
5.5.4. Интенсивность гетеротрофной и автотрофной нитрификации в почвах: ингибиторный подход 157
5.5.5. Взаимосвязь активности нитрификации и плотности популяций автотрофных нитрифицирующих бактерий в почвах 159
5.6. Нитрификация в почвах: активность автотрофных и гетеротрофных нитрификаторов и факторы ее определяющие 160
6. Восстановление нитратов и образование окислов азота (N2O и NO) микроскопическими грибами 166
6.1. Источники поступления и баланс закиси азота в атмосфере 166
6.2. Участие бактерий в образовании и потреблении окислов азота
6.2.1. Денитрифицирующие бактерии и эмиссия газообразных соединений азота из почв 168
6.2.2. Автотрофная нитрификация и образование N2O в почвах 173
6.2.3. Другие микробиологические источники закиси азота 174
6.2.4. Микробиологические пути стока N2O в почвах 175
6.3. Установление у грибов способности образовывать окислы азота 176
6.3.1. Условия и источники азота для образования окислов азота грибами 176
6.3.2. NO-синтазная активность грибов 178
6.4. Анаэробное восстановление оксидов азота грибами: диссимиляторная нитритредуктаза и NO-редуктаза 179
6.4.1. Принципиальные отличия ассимиляторного и диссимиляторного восстановления соединений азота 179
6.4.2. Диссимиляторная нитритредуктаза и NO-редуктаза грибов 180
6.5. Образование окислов азота (N2O и NO) и диссимиляторная нитратредуктаза у микроскопических грибов 183
6.5.1. Распространенность среди микроскопических грибов способности к образованию N2O 183
6.5.2. Анаэробный рост F. oxysporum lldnl и образование N2O и N0 в зависимости от концентрации и формы неорганического азота в среде 184
6.5.3. Активность образования N2O микромицетами на питательных средах 187
6.5.4. Образование окиси азота (N0) микроскопическими грибами в анаэробных условиях 188
6.5.5. Сопряженность образования закиси азота с активностью нитратредуктазы у грибов в условиях аноксии на средах снитра-тами 188
6.5.6. Свойства нитратредуктазы Fusarium oxysporum. Функционирующей в аэробных и анаэробных условиях 190
6. Оценка влияния ацетилена на накопление N2O грибами и способности грибов к редукции N2O 193
6.7. Активность выделения N;0 микроскопическими грибами в почвах 194
6.8. Участие почвенных микроскопических грибов в анаэробном воестановлении нитратов и нитритов и формировании потока закиси азота в атмосферу 197
7. Грибы и азотфнксация в почвах 203
7.1. Взаимоотношения грибов и бактерий в природных местообитаниях 203
7.2. Ассоциации и взаимоотношения диазотрофных бактерий и сапророфных грибов 206
7.3. Ассоциации и взаимодействия бактерий н микоризных грибов 210
7.4. Роль гидролиза растительных полимеров грибами в протекании азотфиксации в почвах 214
Заключение 225
- Методы исследования
- Подходы к изучению структурно-функциональной организации биоты сапротрофных микроскопических грибов наземных экосистем
- Влияние уровня азота в окружающей среде на его содержание в грибах
- Минерализация и иммобилизация азота микроорганизмами и продуктивность экосистем
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди многообразных форм жизни в поддержании стабильного функционирования биосферы первостепенное значение принадлежит микроорганизмам. Они осуществляют круговорот большинства элементов периодической системы и трансформацию всех известных природных соединений. Благодаря их деятельности почвенный покров играет роль биогеохимической мембраны, обеспечивающий устойчивый обмен веществом и энергией между литосферой, атмосферой, гидросферой и всеми обитающими на Земле организмами (Добровольский, 1996).
Микроорганизмы играют ведущую роль в круговороте азота*- главного элемента, лимитирующего продуктивность большинства наземных экосистем. Вместе с тем, применение в возрастающих количествах азотных удобрений ведет к серьезным негативным последствиям -резкому увеличению эмиссии парниковых газов (N:0, С02) в атмосферу, деградации гумуса, токсикозу почв, миграции нитратов в фунтовые воды и водоемы и повышенному содержанию в растениях.
Понять природу этих явлений, прогнозировать изменения в биосфере при нарушениях природных экосистем и успешно разрабатывать новые технологии вырашнваиия растений невозможно без дальнейшего прогресса в микробиологии цикла азота и, в частности, выяснения экологической роли основных представителей почвенной биоты в трансформации азотсодержащих соединений. Определение участия бактерий и грибов в превращениях азота представляется базисным, так как они доминируют в почвах по биомассе и обладают наиболее высокой удельной биогсохимической активностью среди живых организмов, В настоящее время рассмотрение круговорота азота в биосфере и почве сводится к анализу функционирования различных групп бактерий (азотфиксаторов, аммонификаторов, нитрифнкаторов и денитрификаторов). Деятельность же грибов, которые также способны использовать и трансформировать многие азотсодержащие соединения не учитывается. Такая ситуация сложилась в связи с недостаточностью усилий, прилагаемых для раскрытия их метаболических возможностей, недооценкой запасов грибной биомассы в почвах, разнообразия почв по физико-химическим условиям и взаимосвязи циклов азота и углерода, в котором роль грибов, как основных редуцентов органических веществ, признана. Грибы - гетеротрофные организмы, обладающие в большинстве своем мощными и разнообразными гидролазами, занимают в наземных экосистемах ведущее положение деструкторов растительных полимеров и, поддерживая потоки углерода и энергии, уже іем самым лолжнм влиять на активность процессов азотного цикла в почвах.
Наши знания об участии грибов в трансформации азотных соединений в почвах крайне ограничены. Известно, что грибы ассимилируют аммонийный и аминный азот и подавляющее большинство видов - нитраты и нитриты, однако оценка их роли в иммобилизации азота и аммонификации в почвах отсутствует- Существуют виды грибов, окисляющие аммонийный и органический азот до нитритов и нитратов, но чтобы определить их вклад в нитрификацию в почгзах необходимо знаті», насколько это явление распространено среди микромицетов, какова их активность не только на средах, но и в почве, и какова интенсивность гетеротрофной нитрификации в почвах разных экосистем. Перед началом работы имелись единичные сообщения о возможности грибов образовывать закись азота (N2O). Поэтому предстояло исследовать ряд аспектов этого метаболизма у грибов и выявить наиболее активные виды для оценки экологической значимости данного процесса. Для выяснения экологии микробных процессов азотного цикла необходимо было также составить представление о том, насколько типичны и обильны виды микроорганизмов, их осуществляющие, в почвах конкретных экосистем.
Целью работы было установление особенностей структуры комплексов микроскопических мицелиальных грибов в почвах и их роли в круговороте азота.
Основные направления исследований. 1) Сравнительное изучение структуры комплексов микроскопических грибов в почвах, на растениях и горных породах.
2) Определение участия грибов в сопоставлении с бактериями в иммобилизации азота,
аммонификации легкодоступных азотсодержащих соединений и влияния грибов на
азотфиксацию в почвах.
Оценка распространенности среди микроскопических грибов сиособиисти к нитрификации и их роли в окислительном звене цикла азота п почвах. Изучение действия ингибиторов нитрификации на рост и нитрифицирующую активность микромицетов. Определение интенсивности автотрофной и гетеротрофной нитрификации в почвах зональных типов под естественной растительностью и в агроэкосистемах.
Определение видового разнообразия микромицетов, продуцирующих ЫэО, и активности образования ими N2O на питательных средах и в почвах. Изучение особенностей нитратредуктазной системы, функционирующей у грибов в анаэробных условиях.
Научная новизна. 1. На основе количественных синэкологических критериев и моделей рангового распределения относительного обилия видов выявлены особенности структуры комплексов микроскопических грибов в различных компонентах наземных экосистем. Доминирование ограниченного числа видов снижается, а видовое разнообразие микромицетов растет в ряду от выветренных горных пород к примитивным и
сформировавшимся почвам, при переходе от надземных частей растений и опада к подстилке и верхним минеральным горизонтам, от поверхности корней к почве.
Впервые дана количественная оценка относительного участия грибов и бактерий в трансформации азота в почвах природных экосистем и агроэкосистем и сформулировано положение о взаимодополняющей роли этих групп микроорганизмов в круговороте азота.
Грибам принадлежит ведущая роль в иммобилизации азота в почвах по сравнению с бактериями, особенно, в естественных экосистемах, а синтез ими устойчивых к деградации азотсодержащих веществ (меланопротеидов, комплексов хитина с меланинами) представляет важнейший механизм поддержания и накопления устойчивых органических форм азота в почвах, В дерново-подзолистой почве под ельником-кисличником грибами удерживается до 90% азота от его запаса в микробной биомассе, что составляет 5-14% от общего азота почвы, а в окультуренных почвах около 3-4% общего азота закреплено в грибной биомассе, что составляет 50-70% от всего азота иммобилизованного микроорганизмами,,
Многие виды почвенных микроскопических грибов способны окислять аммонийный и аминный азот до нитритов и нитратов, а наиболее активные нитрифицирующие микромицеты продуцируют экологически значимые количества нитратов в почве. Впервые показано, что интенсивность гстсрогрофной нитрификации, в проведении которой доминируют грибы, выше в почвах природных экосистем по сравнению с соответствующими зональными почвами агроэкосистем. Вклад гетеротрофных микроорганизмов в образование нитратов снижается (с 95 до 5%), а автотрофных нитрифицирующих бактерий растет в следующем ряду почв: ненарушенная дерново-подзолистая почва под климаксным еловым лесом, серая лесная почва под мелколиственным лесом, темно-каштановая почва под разнотравной целинной степью, почвы разных типов под широколиственными, смешанными лесами и степными залежами и почвы агроэкосистем; .,
Установлено, что резкое повышение нитратредуктазтюй активности у грибов, образующих N2O на среде с нитратами при пониженном парциальном давлении кислорода, связано с функционированием диссимиляторнои нитратредуктазы. Впервые получены доказательства синтеза диссимиляторнои нитратредуктазы de novo грибами при смене аэробных условий на анаэробные. Определено, что она в отличие от ассимиляторнои нитратредуктазы имеет у Fusarium oxyspomm более высокий молекулярный вес, температурный оптимум, не интибируется аммонием и локализована в цитоплазме.
Выявлены виды грибов, ответственные за образование N^0 в почвах. Многие из них представлены факультативно-анаэробными микромицетами, видовой список которых значительно расширен. Впервые с использовани^ацетилена, ингибитора ^О-редуктазы,
показано, что N2O конечный газообразный продукт восстановления нитратов и нитритов у грибов в анаэробных условиях. Впервые определена активность этого процесса на питательных средах и в почвах. Установлено, что эмиссия N2O, обусловленная деятельностью грибов, не превышает нескольких процентов от газообразных потерь азота при денитрификации в почвах.
7, Непосредственно в условиях почпм показано, что активность азотфиксирующих
бактерий и эффективность несимбиотической азотфиксапии зависит от внеклеточного
гидролиза грибами растительных полимеров. Частота обнаружения и нитрогеназпая
активность ассоциаций бактерий и грибов значительно выше в известкованных дерново-
подзолистых почвах агроэкосистем, чем в кислых почвах,
8. Сделано обобщение о происходящем перераспределении биогеохимических нагрузок
между грибами и бактериями, а именно, о снижении значения грибов и возрастании роли
бактерий в биологических процессах в почве, и соответственно, в биосфере, вызванное
уничтожением естественного растительного покрова Земли, техногенными воздействиями
на природные экосистемы и вовлечением почв в сельскохозяйственное производство.
Грибы удерживают в клетке подавляющую часть азота в ходе его трансформации,
бактерии способны к резкому ускорению всех процессов цикла азота и образованию
соединений, легко удаляемых из почв, и поэтому такое изменение в микробном комплексе
ведет к возрастанию потерь азота из почв в смежные среды (атмосферу, гидросферу и
литосферу).
Практическая значимость работы. Определен вклад грибов в эмиссию закиси азота из почв, что важно для расчетов баланса этого парникового газа в атмосфере. Показано, что грибы среди микроорганизмов преимущественно ответственны за закрепление азота в почвах и их роль в иммобилизации азота снижается в почвах агроэкосистем. Возрастание участия бактерий в круговороте азота в окультуренных почвах, обусловливает меньшую степень удержания азота в системе «почва-растение». Показано, что причиной микробного токсикоза почв в агроэкосистемах может быть не только накопление фитотоксичных форм грибов, но и стимуляция синтеза токсинов у грибов под действием агрохимикаїов (ингибиторов нитрификации). Установлена важная роль внеклеточного гидролиза грибами растительных остатков в поддержании несимбиотической азотфиксации в почвах. Эти положения необходимо учитывать при разработке альтернативных приемов земледелия.
Разработан и модифицирован ряд методов количественной оценки участия грибов и бактерий в процессах трансформации азота в почвах.
Полученные в работе данные по видовой структуре комплексов микромицетов в почвах и других компонентах наземных экосистем позволяют проводить целенаправленный поиск штаммов конкретных систематических групп грибов для биотехпологических целей. Разработано несколько стратегий скрининга грибов-продуцентов экзоферментов и оригинальных методик выделения микромицетов из природных объектов (введения индукторов в среды и почвенные суспензии, др,). При поиске штаммов для борьбы с корневыми патогенами предложено в качестве дополнительного критерия, наряду с использованием типичных для ризопланы видов, определять их локализацию в ризоплане, а сам вид и его штамм отбирают среди первых колонизаторов тех участков поверхности корня, которые являются «воротами» инфекции.
Реализация результатов. Создала коллекция микроскопических грибов (более 1000 штаммов 50 видов), которая включает микромицеты из различных эколого-трофических групп, продуцентов протеазы, каталазы, глюкозооксидазы (патент РФ 2001 г, №2170762), термостабильных и ал кал остаб ильных целлюлаз. Отобран штамм Aspergillus sydowi (патент РФ 1993 п, №2002800) для использования в качестве тест-культуры при испытаниях пластика и смазок на устойчивость к биоповреждениям. Культуры из коллекции используются в учебном процессе и научной работе на кафедрах биологии почв и микробиологии МГУ.
Результаты исследований используются в лекциях по почвенной биотехнологии, микологии, экологии и геохимической деятельности микроорганизмов, читаемых на кафедре биологии почв МГУ, включены в учебные и учебно-методические пособия и рекомендованы для применения в криминалистике.
Основные защищаемые положения. 1. Особенностями комплексов
микроскопических грибов верхних минеральных горизонтов почв является их более высокое разнообразие и выравненность видов по обилию в сравнении с другими компонентами наземных экосистем (выветриваемыми горными породами, опадом, разлагающимися растительными остатками, поверхностью живых растений).
Функциональные возможности бактерий и грибов в трансформации азота во многом носят дублирующий характер, что является одним из факторов, обеспечивающих стабильность круговорота азота в наземных экосистемах.
Грибам, по сравнению с бактериями, принадлежат ведущие позиции в иммобилизации и долговременном закреплении азота в почвах, меньше их роль в аммонификации легкодоступных азотсодержащих соединений и заметно ниже в нитрификации, кроме кислых подзолистых почв под климаксными хвойными лесами. Грибы не фиксируют молекулярный азот, но, осуществляя внеклеточный гидролиз растительных полимеров,
обеспечивают легко--доступными соединениями углерода азотфиксаторов в почве-Бактерии доминируют в денитрификации и, в большинстве почв, в окислительном звене цикла азота, в аммонификации их вклад не ниже чем у грибов, за исключением кислых лесных почв, и существенно меньше их роль в иммобилизации азота, особенно, в почвах природных экосистем.
4. Роль грибов в цикле азота весомей в почвах природных экосистем, что обусловливает его более высокий уровень удержания и депонирования в почвах. Снижение участия грибов в трансформации азота в почвах агроэкосистем и возрастание роли бактерий ведет к интенсификации круговорота азота, особенно, процессов окисления и восстановления азотных соединений, что повышает потери азота из почв.
Работа выполнялась па кафедре биологии почв факультета почвоведения и Международном биотсхнологическом центре МГУ, Автор выражает глубокую благодарность своим учителям, заведующему кафедрой, проф. Д.Г. Звягинцеву, с.н.с. Т.Г. Мирчилк, проф. М.М. Умарову, проф. B.C. Гузеву, доц. И.П. Бабьевой за поддержку и цепные советы, своих коллег Б.А. Вызову, О.Е. Марфениной, Н.В. Костиной, И.Ю. Чернову, АЛ. Степанову, В.В. Демину, Т.Г. Добровольской, Г.М. Зсновой* Л.В. Лыеак, Л.М. Полянской, И.Н. Скворцовой, П.А. Кожевину, А.Е. Ивановой, М. Оразовой, весь коллектив кафедры и биоцентра, за благожелательное отношение, помощь и консультации. Большой вклад в работу на разных этапах исследований внесли работавшие совместно со мной студенты и аспиранты - АЛ1. Попов, И.В, Евдокимов, Д.М. Соколов, Е.М, Култышева, О.А. Пахненко, Н.Г. Сомова, Е.В. Скрынникова, Р.Б, Лаврентьев, Ю,А. Козлова, Ю.А. Завгородняя, А.Н. Носиков, С.В- Зайцев, М.А. Давыдова, Л.А, Лежнева, И.В. Дорошенко, A.M. Пашинский, М.В. Бирюков, И.С. Прохоров. Изучение нитратредуктазы у грибов в лаборатории металлсодержащих белков Института биохимии РАН проф, Н.П. Львова, нитрификации в почвах прерий и широколиственных лесов был осуществлен в Висконсинском университете (г. Мэдисон, США) в лабораториях проф. Л-Банди и Р. Харриса, выделение грибов в анаэробных условиях в Институте микробиологии РАН в лаборатории д.б.н, Е.А. Бонч-Осмоловской, за что автор выражает им искреннюю благодарность, а также акад. В.Г.Минееву, проф. А.П.Синицыну, директору ЦЛГЗ А.СЖелтухииу, с.п.с. А.В Болобовой, М.Б.Куплетской, доц.В.С.Егорову, с.и.с.Гомоповой и многим другим руководителям и сотрудникам научных учреждений, с полевых опытов которых были отобраны образцы почв и с которыми проводились совместные исследования. Ряд разделов работы выполнен при поддержке РФФИ и в рамках международных проектов.
Методы исследования
Исследования проводили с применением инструментальных (газовая хроматография, электронная, люминесцентная микроскопии) и различных микробиологических и биохимических методов (Егоров, 1976;. Звягинцев, 1991; Bergmeyer, 1974 и др.) 1.2.1, Выделение, идентификация микроскопических грибов и синэкологическая характеристика микобиотм в наземных экосистемах Оценку представлен пости микроскопических грибов в почвах и других компонентах наземных экосистем проводили на основе показателей обилия, временной и пространственной частоты встречаемости видов. Типичными для изучаемого местообитания считали виды с временной частотой встречаемости не менее 30% (Мирчипк и др., 1982), При сравнительном анализе комплексов грибов в различных компонентах биоценозов использовали данные, полученные при сходных методических подходах - посевах на одни и те же среды - с легкодоступными углеводами (агар Чапека, Мартина, Ролэна, сусло-агар), с целлюлозой - Гетчинсона и голодный агар и равном числе образцов из каждого местообитания. Выделение грибов из почв при анаэробных условиях инкубирования посевов проводили на различные по составу глюкозо-минеральные среды с микроэлементами и витаминами, адаптировав методику Хаигейта (Hungate, 1969) для микромицетов (Kurakov et aL, 2002). Посев образцов почв в анаэробных условиях проводился па агаризовапную (3 агар) среду следующего состава (г/л): КН2Р04 1,0, КС1 0,5, MgS04 0,5, FeS04 0,01, (NH zSC 2, пептон 5, глюкоза 5, дрожжевой экстракт 0,5, 1 мл/л раствора микроэлементов (мг/л): ЭДТЛ - 500, FeCl2-7H20 - 200, ZnCl2 7H20 - 10, MgCb O - З, HjB04 - ЗО, CoC\r6H20 - 2, CuClr2H20 - 1, Na2Mo04 - 3, NiCh-6H:0 - 2, 1 мл/л раствора витаминов (мг/л): 4-аминобснзойной кислоты - 25, D-биотина - 100, никотиновой кислоты - 25, пантотената кальция - 25, пиридоксина гидрохлорида - 25, фолиевой кислоты - 10, рибофлавина-25, В 12-0,5, липоевая кислота-25 и ряд других сред (сусло-агар, Чапек), Модификации для выделения грибов состоят в посеве на агаризованную среду, разлитую в небольшие матрасы (введение антибактериальных антибиотиков, увеличение длительности инкубации (7-12 сут.) и снижение температуры инкубации (24-26 С), использование низких разведений (1:1 - 1:10) или прямого посева мелкозема). Раствор минеральных компонентов кипятили для удаления растворенного кислорода, потом остужали в кристаллизаторе с холодной водой. При этом через раствор продували молекулярный азот, пропущенный предварительно через колонку с нагретой медью для удаления из пего следов кислорода.
После охлаждения раствора в него добавляли органические компоненты, витамины и микроэлементы. Среду анаэробно (в токе N2) разливали в стеклянные матрацы, в которых находились навески агара. Для подавления роста бактерий в расплавленную, стерильную, не горячую срелу добавляли антибиотики: стрептомицин и хлорамфеникол в концентрации 200 мг/л среды. Выделение термофильных грибов и других экстемофилов проводили согласно рекомендованным (Вилай, 1982) и разработанным нами подходам {Кураков, Болобова, 1999; Кураков, 2001). Для определения видовой структуры биоты с апротрофных микромицетов в различных ярусах наземных экосистем (почва, растения) использовали показатель относительного обилия видов (Кураков, Костина, 1998; Кураков и др., 1999, 2000, Кураков, 2001), а не пространственной частоты встречаемости (Мирчинк и др,,1982). Использование показателя обилия, в отличие от частоты встречаемости, позволяет провести математический анализ модели рангового распределения видов грибов в почве и сравнение с таковыми вдругих эконишах (Кураков, 2001, 2002), Для характеристики комплексов микроскопических грибов использовали индекс разнообразия и выравненное Шеннона, доминирования Симпсона, сходства Серенсена, соответствие моделям рангового распределения относительного обилия видов, средней радиальной скорости роста типичных видов и некоторые другие экологические показатели (Одум, 1975, Мирчинк, 1988, Звягинцев, 1989, Мэгарран, 1992, Кураков, 2001). Идентификацию микроскопических грибов осуществляли по культурально-морфологическим признакам по соответствующим для конкретной систематической группы определителям (Кириленко, 1977; 1978; Билай, Коваль, 1988; Barnett, Hunter, 1972; Bissett, 1991; Booth, 1977; Domsh et alM 1993; Ellis, 1971; Klich, Pitt, 1992; Rapcr, Fennell, 1965; Rapcr, Thorn, 1949; Ramirez, 1982; Rifai, І962; Pitt, 1991; Samuels, 1996; Schipper, 1973; Simmons, 1967 и др.). 1.2.2. Проверка штаммов грибов на чистоту от бактериальной контаминации Культуры грибов, использованные в экспериментах по трансформации различных соединений азота, были проверены на отсутствие бактериальной контаминации путем световой микроскопии и посевами в глкжозо-пептоиный бульон с циклогексимидом (100 мкг/мл) и на твердые среды (мясо-пептонпый (МПА), глюкозо-пептопный (ГПА) (пептон 2 г, дрожжевой экстракт 1 г, гидролизат казеина 1 г, СаСОз 5 г, агар 20 г, НгО 1000 мл, рН 7) и почвенный агар (ПА) (вытяжка после кипячения 100 г почвы в 500 мл, агар 20 г)) и инкубации при 25 и 37 С. Посев на среду с почвенной вытяжкой позволяет выявить бактериальных спутников типа Melallogenum, Их наличие придаст грибным колониям вид «паучков», причем рост бактерий наблюдается вдоль мицелия с попутным отложением солей оксидов марганца (Мирчинк и др,, 1970). После пассажей на МПА, ГПА и ПА культуры дополнительно проводили через среду Чапека со стрептомицином и хлорамфениколом (по 30 мг/л). В работу отбирали только чистые культуры микроскопических грибов, и они были повторно проверены на чистоту от бактериальной контаминации после проведения опытов. 1.2.3. Выделение ассоциаций грибов и азотфиксирующих бактерий Для выявления грибов, имеющих в качестве спутников диазотрофных бактерий, использовали подход, принципиально отличный воспользовавшихся ранее приемов (Коненков и др., 1979). Ассоциации грибов и бактерий выделяли не из накопительных водно-почвенных суспензий или из посевов на питательные среды, а непосредственно из почвы или разлагающихся в почве растительных субстратов. Выделение мицелия микроскопических грибов с бактериальными спутниками проводили из микробных сообществ, развивающихся в почве.
В микрочашки Петри были заложены почвенные пластинки, в которые вносили различные субстраты внутрь почвы и Era поверхность. Отдельные гифы мицелия препаравальной иглой под контролем бинокулярного микроскопа ипокулировали в среду Эшби, предполагая, что если гриб будет расти в безазотной среде, то основным поставщиком азота будут азотфиксирующие бактерии. Отсутствие или очень слабый рост гриба свидетельствовали о том, что на мицелии не было диазотрофных бактерий или они обладают низкой активностью. При наличии хорошего видимого невооруженным глазом роста (нитей или нитей с помутнением) определяли азотфиксирующая активность ассоциаций в жидкой среде Эшби ацетиленовым методом. Известно, что случаи распада ассоциаций грибов и бактерий нередкое явление при длительных пассажах. Выявленные нами ассоциации грибов и бактерий сохраняли свой состав в течение нескольких пересевов, более длительные пассажи для определения стабильности ассоциаций не проводили» Путем посева ассоциаций на твердые питательные среды (Эшби, Чапека, сусло и глюкозо-пептонную с дрожжевым экстрактом) и создания условий для преимущественного развития грибов или бактерий была установлена их таксономическая принадлежность. 1,2.4. Определение нитрифицирующей активности грибов на жидких средах Для оценки нитрифицирующей активности микром ицетов на аммонийном источнике азота использовали среду, аналогичную по составу среде Чапека, но н которой азотнокислый натрий заменяли на сернокислый аммоний в концентрации 8 г/л (рН 7,0, соотношение C:N - 5). При культивировании грибов на органическом азоте применяли среду Эйлера-Шмидта (г/л): К:НРО - 1,0, MgS04 - 0,5, FeS04 - 0,01, MnSO - 0,01, глюкоза - 2,0, пептон или В-аланин - 5,0, вода дистиллированная - 1 л, рН 7,0 (Eylar, Schmidt, 1959). Микромицеты культивировали в статических условиях в колбах объемом 250см3в 100 мл среды втеченис 10-12 суток при температуре 26 С, Способность грибов к нитрификации устанавливали по образованию гидроксиламина, гидроксамовых кислот, нитрита или нитрата. Нитрифицирующими штаммами считали тс, в культуральиой жидкости которых обнаруживали не менее 0,1 мкг/мл одного из этих соединений. Мицелий и споры отделяли от культуральиой жидкости фильтрованием или центрифугированием и определяли биомассу грибов.
Подходы к изучению структурно-функциональной организации биоты сапротрофных микроскопических грибов наземных экосистем
Дальнейший прогресс в познании роли грибов в различных процессах в почвах и биосфере невозможен не только без количественной оценки потоков вещества и энергии на основе методов экосистемного подхода, но и выявления и объяснения наблюдаемого распределения организмов того или иного вида в пространстве-времени в рамках популяционного подхода. Конкретные виды выступают в сообществах / ассоциациях / комплексах в качестве регуляторов потоков веществ и энергии. Одновременно следует помнить о межорганизменных взаимодействиях в микробных сообществах, их эмерджентных свойствах, что может существенно повлиять на интенсивность и характер изучаемых процессов. Так, убыль хвои Pinus sylvestris в результате ее разрушения базидиомицетом-лигнолитиком Marasmius androsaceus за 12 месяцев составила 52%, целлюлозолитическим микромицетом Trichoderma viride - 48%, а аборигенным микробиотой леса - 36% (Сох et al., 2001). Знание видовой структуры микобиоты в различных местообитаниях необходимо и для решения многих прикладных задач -успешной интродукции микроорганизмов, контроля микробиологического состояния ПОЧВ при различных системах удобрения и севооборота, разработке стратегий биоремедиации и скрининга грибных продуцентов для биотехнологических производств, приемов борьбы с фитопатогенами, грибами-деструкторами строительных материалов, древесины, камня, синтетических полимеров. 2.2.1. Трофические особенности сапротрофных микроскопических грибов Всеми грибами легко диссимилируются моносахара. Однако эти соединения обычно имеются в небольших количествах в почвах и других природных объектах. Поэтому колонизация грибами субстратов зависит от их способности синтезировать ферменты, гидролизующие более сложные соединения. Для разрушения разнообразных природных полимеров необходим большой набор ферментов, причем нередко по несколько ферментов для гидролиза одного полимерного соединения. Хотя многие грибы синтезируют широкий спектр ферментов, ни один вид не имеет их полный набор, что потенциально позволяет использовать все субстраты растительных и животных тканей. Известно, что большинство зигомицетов (Mucor, Mortierella) не могут утилизировать целлюлозу (из полимеров гидролизуют ксилан) и представляют группу «сахарных» грибов. Большинство грибов Ascomycota и Deuteromycota продуцируют глюканазы и гидролизуют гсмицеллюлозу, целлюлозу и практически все - ксилан. Некоторые из них способны к деградации лигнина.
Среди сапротрофных базидиомицетов (за исключением дрожжей) все разрушают целлюлозу и многие-лигнин (Билай, 1974; Мирчинк, 1988; Dix, Webster, 1995). В адаптации грибов к питательным субстратам можно выделить две тенденции эволюции: расширение субстратной специализации или ее сужение по отношению к конкретным субстратам и хозяевам. Оба пути непосредственно связаны с эволюцией генетического и ферментативпого аппаратов (расширение наборов ферментов, повышение экономичности обмена, синтез антибиотиков, токсинов, выработки устойчивости к фитоалексинам, продуктам обмена хозяина и т.п.). Первая тенденция чаще всего возникает при дефиците питательных веществ и следствием ее является появление олиготрофии у грибов, обитающих в почве и водоемах. В условиях повышения конкуренции наблюдается ускорение специализации по отношению к субстратам, недоступным конкурентам, и переход в другие экологические ниши (к симбиотрофии, паразитизму, хищничеству) (Великанов, 1997). В исследованиях Ждановой с коллегами (Жданова и др., 1997; Кучеренко, 1999) показано, что изолятам Fusarhim oxysporum, выделенным из почв, свойственны более широкие приспособительные возможности, чем тем, которые перешли к облигатному паразитизму на высших растениях и, соответственно, потеряли или почти потеряли способность к сапротрофному способу питания. Большинство сапротрофных микромицетов - убиквисты, использующие широкий, с небольшими ограничениями, круг субстратов, присутствующих в различных биоценозах. В отличие от них виды Basidlomycota специфичнее в отношении субстратов и имеют более ограниченные ареалы распространения. 2.2.2. Методология изучения распространения сапротрофных микроскопических грибов в наземных экосистемах В связи с тем, что многие почвенные микромицеты способны к росту на разнообразных органических субстратах ведущими факторами, которые определяют их распространение и конкурентоспособность являются физико-химические условия среды, ингибирующис и стимулирующие вещества, взаимоотношения с другими организмами. Комплекс этих факторов и обусловливает при значительном сходстве неизбежные различия видового состава почвенных микроскопических грибов в разных природно-климатических зонах, биоценозах и субстратах. Группы грибов, даже если они связаны с аналогичным субстратом (древесным опадом, хвоей или листвой, подстилкой и т.д.), могут отличаться по составу или, что чаще всего обнаруживается, по представленности (плотности популяций) одних и тех же видов в разных биогеоценозах или природно-климатических зонах. Сравнение микробных группировок в почвах разных природно-климатических зон привело к выводу, что роль географического фактора в расселении микробных сообществ сказывается через комплекс экологических факторов, таких как влажность, тип субстрата, кислотность, температура, засоленность почв (Звягинцев и др., 1999). Одновременно популяиионная плотность видов в сообществах не может не меняться в ситуации непостоянства условий окружающей среды, источников питания, биотических взаимодействий и при накоплении с течением времени внутренних противоречий. Описание качественных и количественных изменений в структуре сообществ в зависимости от времени отражается в микробных сукцессиях. Последовательная смена видов в сообществе при разрушении растительных субстратов в почвах и подстилке объясняется их различной способностью к утилизации органических соединений, стресс-толерантностью, межвидовыми взаимодействиями.
Различия в видовой структуре микробных сообществ в вертикальных ярусах наземных экосистем (на поверхности живых растений, свежем опаде и подстилке, минеральных горизонтах почвы) в довольно большой степени сходны с наблюдаемыми в сукцессии при разложении растительных остатков в почвах (Мирчинк, Бабьева, 1981; Звягинцев и др., 1999). В связи с вышеизложенными положениями методология изучения структурно-функциональной организации микробных сообществ в наземных экосистемах включает: I) вертикально-ярусный подход - одновременное исследование микробных сообществ в пределах всех ярусов экосистемы (филлоплана растений, опад (подстилка), почва по горизонтам; 2) географический подход, согласно которому анализируется не только распространение отдельных видов по природным зонам, а соответствие микробного сообщества конкретного ландшафта климатическим условиям и 3) сукцессионный анализ, так как микробные сообщества постоянно претерпевают изменения вызванные внешними воздействиями (температура, влага, поступление субстрата) и внутренними причинами, обусловленными предыдущими событиями в микробной системе (Мирчинк, Бабьева, 1981;3вягинцевидр., 1984, 1999; Чернов, 1993). 2.2.3. Методы определения биомассы, видового богатства и функций грибов в почвах Арсенал известных методов пока не в полной мере адекватен такой непростой задаче, как установление структурно-функциональной организации микобиоты почвы и других компонентов наземных экосистем. Вместе с тем, использование взаимодополняющих методов позволяет выявить многие ее параметры - определить численность колониеобразующих единиц грибов при посевах образцов на различные среды, общую и жизнеспособную биомассу, биомассу мицелия и спор, видовой состав и плотность популяций различных видов, а также выделить грибы, находящиеся в почве в мицелиальной форме, охарактеризовать физиоло-биохимические свойства изолятов и их способность к трансформации разнообразных веществ (субстратов). Адаптироваиность грибов к данному местообитанию (почве, корневой зоне, поверхности горной породы и т.д.) оцскивают по скорости роста чистых культур при различных физико-химических условиях среды и динамике внесенной популяции или нескольких популяций в этой эконише (Мирчинк, Бабьева, 1981; Кожевип, 1989; Кураков и др., 1999; Кураков, 2001).
Влияние уровня азота в окружающей среде на его содержание в грибах
Содержание белков, нуклеиновых кислот, хитина, мочевины и, соответственно, общее количество азота в грибах подвержено значительным колебаниям, в зависимости от их систематической и экологической принадлежности, условий роста и стадии развития. Большое количество хитина содержат аспергиллы - 18-22% в сухой биомассе и значительно меньше пенициллы и высшие грибы - 3-6,7% (Фостер, 1950; Феофилова, 1983), В плодовых телах и спорах содержание азота намного (2-3 раза) выше, чем мицелии (Беккер,1988). На содержание азота в клетках грибов, помимо формы утилизируемого азотсодержащего соединения» существенное влияние оказывает и его концентрация в среде. Имеются данные, что увеличение концентрации азота и углерода в среде повышает выход хитина у РєтсШіит digitatum (Костина и др., 1978), При помещении созревшего плодового тела шампиньона в атмосферу аммиака содержание мочевины в гименни повышалось до 14%. Увеличение концентрации азота в среде добавлением виннокислого аммония увеличивало биомассу мицелия и содержание в нем протеина у базидиальных грибов (Reusser et al., 1958). В высоких концентрациях аммонийный азот начинает оказывать ингибирующее действие на рост грибов, в частности Agaricus bisporus (Гарибова, 1964). В мицелии микромицетов количество азота варьирует в диапазоне от 1,7 (для бедных по азоту сред) до 10 % (для сред с высоким содержанием азота) (Фостер, І950; Paul, Clark, 1989). В условиях богатых по азоту (среда Гетчинсона) грибы накапливают его в мицелии в концентрации 4-10%, т.е. количествах аналогичных для целлюлозолитических бактерий 4-12%(Наплекова, 1974). При довольно постоянном содержании углерода - порядка 30-45%, соотношение С к N у грибов может быть от 4,5/1 до 20/1 и более у ксилотрофов. В бактериях содержание азота выше (4 -15%) и его варьирование меньше, чем в грибах (Herbert, 1976; Ross, 1989; Paul, Clark, 1989), и, соответственно, соотношение С KN лежит в диапазоне (3/1-10/1). Для оценки масштабов закрепления азота в биомассе грибов в наземных экосистемах необходимо знать его количество в мицелии при их росте in situ. При анализе данных по содержанию азота в макромицетах, растущих в природной обстановке обнаружена, та же закономерность, что и для чистых культур грибов, на питательных средах: чем больше азота в источнике питания, тем больше его потребляется и аккумулируется в мицелии и плодовых телах. В мицелии дерсворазрушающих грибы содержание азота достигало 0,2% (C/N = 250) при росте на среде с глюкозой и соотношением C/N = 2000 (аналогичному в древесине).
Низким содержанием азота отличались и плодовые тела ксилотрофов, при их развитии на древесине (Levi, Cowling, 1969). В плодовых телах подстилочных и микоризных макромицетов, отобранных в естественном биоценозе, содержание азота заметно более высокое и составляло у Paxillus irtvolutus - 3,64-3,79 %, Armillariella melea — 2,97-3,02 %, Russtda xerampella — 3,12 %, Lactarius deliciosus - 3,68 %T Marasmtus bulUardii — 4,78 % Hyphohma faseiculare — 1,8 %, Stropharia aeruginosa - 4,82 %, Inocybefastig tata — 5,2 % (Бурова, 1986). Значительно сложнее определить содержание азота в мицелии микроскопических грибов при их развитии непосредственно в почве и на находящихся в ней растительных остатках. Имеющиеся в литературе данные по концентрации азота а мицелии микроскопических грибов получены в условиях их роста на питательных средах (Фостср, 1950; Kjoller, Stniwe, 1982). В единичных работах определение содержания азота в микромицетах дано в условиях приближенных к естественным. При выращивании микромицетов в течение месяца на среде с почвенным экстрактом содержание азота в мицелии составило 3,7% (Baalh, Soderstrom, 1979). По данным Фланагана и ВанКлива (Flanagan, Van Cleve, 1977) количество азота в мицелии грибов, культивированных на пленках с глюкозой, которые инкубировали в почвах, достигло 5,75%. Сведения о том, каков уровень накопления азота в мицелии микроскопических грибавпри их развитии в почве и о возможных изменениях в содержании азота в мицелии в зависимости от обеспеченности почвы азотом отсутствуют. Известно, что при внесении азотного удобрения соотношение C/N в микробноіРйожет резко снижаться, например, в микробной биомассе серой лесной почвы с 11,6 до 2,4 (Благодатский, 1987). Доминирование грибного мицелия в структуре микробной биомассы в большинстве почв, указывает на важность корректного выбора величины, характеризующей содержание в нем азота, для расчетов масштабов его иммобилизации грибами. Это обусловило необходимость постановки опытов по оценке содержания азота в грибах при их росте непосредственно в почвенных условиях, 3.3. Определение содержании азота в микроскопических грибах, развивающихся в почве Главными методическими проблемами для определения содержания азота в грибах, развивающихся в почве, были отбор мицелия грибов и проведение анализа небольших по весу образцов. При внесении вглубь и на поверхность почвы (почвенной пластинки) измельченной соломой или крахмалом, сахарозой, реально собрать остро отточенной препаравальной иглой фрагменты растущего мицелия (поднимающегося над поверхностью почвы в воздух) общим весом не более 1-10 мг (0,1-1 мг в. с. масса). Для анализов традиционными методами и методом микроКьельдаля необходимы сухие образцы весом не менее 0,5-1 г. Поэтому был применен анализатор «Карло Эрба» (модель 1106), адаптированная для биологических объектов, для которого достаточно иметь навески образцов весом (0,5-1,0 мг) (Гельман и др., 1987). Согласно проведенным экспериментам содержание азота в мицелии грибов, развивающемся в неудобрявшейся почве было 2,87±0,08%, и в почвах, ранее получавшей азотное удобрение - 3,17+0,14 и полное минеральное удобрение - 3,63+0,04% (табл, 9). Эти значения концентраций азота в мицелии и соотношения C;N были использованы для расчетов масштабов его иммобилизации грибами в почвах.
Достоверных различий в уровне накопления азота в мицелии, отобранном с поверхности почвы с добавкой люцерновой соломы и крахмала, ке отмечали, В среднем содержание азота в мицелии микроскопических грибов, растущих непосредственно в дерново-подзолистой почве, составляло 3,2+0,4%, т,е, было ближе к величинам, характерным для развития грибов на небогатых азотсодержащими соединениями питательных средах. Параллельно в тех же образцах определили количество углерода, которое составило 29,95-30,26 %. Оно достоверно не изменялось в мицелии грибов, развивавшихся в разных вариантах почвы. Соответственно соотношение C:N снижалось в мицелии грибов, развивавшихся в удобряемых почвах до 8,2 с 10,6 в контроле. Полученные данные показывают, что при внесении азотных и полного минерального удобрения содержание азота в мицелии почвенных грибов достоверно возрастает (на 10 и 24%), Это свидетельствует о том, что даже если при применении удобрений биомасса грибов в почве может заметно не увеличиться, размеры иммобилизованного в ней азота возрастают, 3.4. Влияние соединений азота на прорастание, рост и развитие грибов на средах и in situ 3-4.1. Влияние соединений азота на прорастание спор и жизнеспособность грибов Обнаружено, что азотсодержащие соединения (пептон, сульфат и нитрат аммония, аминокислоты), а не моно- и дисахара являются стимуляторами прорастания конидий Aspergillus niger (Морозова и др., 2001). Ингибирование прорастания конидий фитопатогенов Botritis cinerea Phoma betae и Cladosporium herbarum тесно коррелирует с потреблением бактериями рода Pseudomonas, типичными обитателями поверхности растений, аминокислот из окружающей среды (Brodie, Blakeman, 1976). При прорастании грибные споры поглощали аминокислоты более медленно, чем бактериальные клетки. Поэтому их прорастание стимулировалось в большей мере аминокислотами, чем глюкозой, за которую бактерии конкурировали с грибами менее успешно (Blakeman, Brodie, 1977). Имеются сведения об ингибирующем и стимулирующем действии сидерофоров (из группы линейных и циклических гидроксамовых кислот) на прорастание и рост патогенных грибов (Neilands, Leong, 1986). Сообщали, что сидерофор ферикросин в низких концентрациях является фактором прорастания конидий Neurospora crassa (Horowitz etal., 1976). Довольно многочисленные свидетельства получены о важной роли аммиака в подавлении прорастания спор грибов и проявлениях фунгистазиса в почвах.
Минерализация и иммобилизация азота микроорганизмами и продуктивность экосистем
Представление об одновременном протекании минерализации органических веществ с образованием неорганических соединений и ассимиляция неорганических молекул и ионов в составе клеток микроорганизмов является одним из базовых положений в микробной экологии и почвоведении, При минерализации органических соединений часть энергии теряется в тепловой форме, большие количества углерода улетучивается в форме СОз, а неорганические ионы обычно остаются. Если энергетические субстраты (соединения углерода) не возобновляются, то достигается стадия, когда в почве накопятся минеральные соединения для ассимиляции растений. Напротив, если в почву поступают доступные микроорганизмам соединения углерода, потребности в минеральных веществах становятся выше и неорганические вещества (минеральные формы азота) ассимилируются (иммобилизуются) микроорганизмами. Почвенные микроорганизмы более конкурентносиособны в ассимиляции азота, как NH++, так и NOj", в сравнении с растениями (Jackson et aL, 1989). Поэтому накопление аммония указывает, что количество азотсодержащих субстратов в почве превышает ассимиляционные потребности в азоте у микроорганизмов. Известно, что при внесении субстратов с соотношением C:N 25 у микроорганизмов возникает избыток азота для ассимиляторных нужд и происходит экскреция аммония в почву (Пошон, Де Баржак, 1950; Федоров, 1956; Мишустин, Емцев, 1987). Поступление во многие почвы легко метаболизируемых источников углерода с соотношением C:N 25-30 ведет к временной иммобилизации ранее доступного растениям минерального азота почвы в микробной биомассе. Естественно, что это соотношение может меняться в зависимости от доступности для микроорганизмов углеродной части веществ, попадающих в почву, и других экологических факторов. Продуктивность растений уменьшается, пока не произойдет дополнительного поступления азота за счет удобрений, фиксации атмосферного азота диазотрофами и пока азот, иммобилизованный в клетках микроорганизмов, не станет доступным в результате их гибели и последующей аммонификации азотсодержащих веществ их биомассы. В почвах под естественными фитоценозами минерализация и иммобилизация азота» как правило, уравновешивают друг друга, и в таких почвах практически не накапливается азот в минеральной форме.
Распашка почв, внесение минеральных удобрений, особенно азотных, ведет к преобладанию минерализации над иммобилизацией и дефициту усвояемого углерода для микроорганизмов, в результате чего иммобилизация азота удобрений в органическую форму не компенсирует затрат почвенного органического вешества на минерализацию (Кудеяров, 1999). Расход углерода на «дыхание» почвы превышает поступление с растительными остатками, поскольку часть продукции фотосинтеза в агроэкосистемах отчуждается. Пол и Джума (Paul, Juma, 1981) в серии лабораторных и полевых опытов с применением математического моделирования и меченного азота показали, что общая минерализация в черноземной почве существенно превосходила иммобилизацию азота микроорганизмами. Это положение подтверждается и данными большого числа длительных опытов, в которых установлено снижение содержания гумуса на вариантах с NPK за 20-30 лет па 10-14% по сравнению с исходным (Шевцова, 1989). Превращения органического азота в почве рассматривают с учетом существования его нескольких фракций - активной фракции с относительно небольшим периодом разложения и устойчивой (пассивной) фракции (негидролизуемый азот), возрастом более 1000 лет (т.е. имеющая значение только в долгосрочном анализе круговорота азота) (Paul, Juma, 1981), Активная фракция (фаза) органического вещества почвы образуется из растительных остатков, останков животных, биомассы почвенных микроорганизмов, прижизненных выделений лочвообитаюших организмов и растений, периферической части гумусовых веществ. По данным Пола и Джума (Paul, Juma, 1981) период полураспада биомассы микроорганизмов в удобренной почве по прошествии 6 месяцев составляет 24,7 недель, других метаболитов - 76,8 недель и пассивной фракции, в которую заключено 2/3 всего азота, 27-600 лет. Внесение азотных удобрений приводит к сокращению запасов азота в активной фазе органического вещества, что обусловливает появление эстра-азота (Кудеяров, 1989). Так, систематическое применение азотных минеральных удобрений привело к снижению на 40-60 % биомассы грибов по сравнению с контролем (Берпат, 1983). Постоянство плотности микроорганизмов в почве указывает на то, что в почвах ненарушенных экосистемах питательные вещества, содержащиеся в микробной биомассе, сохраняются микробными популяциями. Для оценки способности почвенных микроорганизмов обеспечивать снабжение растений элементами питания большой интерес представляет та биомасса, которая синтезируется сверх стационарного уровня, благодаря поступлению богатых углеродом субстратов. Когда запас питательных веществ истощается, плотность микробных популяций возвращается к первоначальному уровню в результате выедания почвенными животными и гибели микроорганизмов из-за отсутствия источников питания (Тате III, 1991). Количество азота в биомассе почвенных микроорганизмов может представлять существенную величину. Андерсон и Домш (Anderson, Domsh, 1980) установили, что в почвах агроценозов от 0,5 до 153 % общего азота почвы (в среднем 5,0 %) содержалось в биомассе микроорганизмов. В микробной биомассе трех лесных почв содержалось от 0,16 до 0,22 % общего азота почв, что значительно ниже в сравнении с почвами агроценозов. Азам с коллегами (Azam et al„ 1988) обнаружили, что в микробной биомассе пылеватого суглинка, обогащенного азотом в возрастающих концентрациях и глюкозы для поддержания отношения C:N=30:1, содержалось от 10 до 18 % азота почвы. Джума и Паул (Juma, Paul, 1984) на основе метода хлороформной фумигации определили, что от 15 до 25% органического азота, минерализованного в течение 12-недельной инкубации, относятся к микробной биомассе.
Доступность азота, заключенного в микробной биомассе, для растений зависит от устойчивости клеток микроорганизмов и азотсодержащих соединений, входящих в их состав, к деградации. Аминокислоты, подавляющее большинство белков, пептиды, пуриновые и пиримидиновые основания нуклеиновых кислот, мочевина быстро аммонифицируются в почвах. Максимальная скорость аммонификации в почве наблюдается в случае добавки аминокислот и пептона (от нескольких часов до суток) (Kunze et al., 1983; Alef, Klein, 1986; Paul, Clark, 1989). Внесенная в почву нуклеиновая кислота минерализуется в течение нескольких недель на 60-85 % и несколько быстрее разлагаются нуклеотиды (Pearson et al.f 1941). Интенсивность разрушения хитина в почве заметно ниже, и состапляла па глубинах 1, 5 и 10 см за вегетационный сезон 43-71% (Коваль, Харкевич, 1982). Следует, однако, учитывать, что в реальных условиях в почву поступают в большинстве случаев не индивидуальные вещества, а их смеси и часто много более устойчивые комплексы. Определенная часть из них сохраняется благодаря адсорбции на минералах и в мелких порах, взаимодействию с другими веществами с образоианием более устойчивых соединений, например белков с лигнином. В ряде работ было изучено разложение различных веществ микробных клеток и образование минеральных элементов питания растений. Кинетика минерализации различных веществ микробных клеток была сходна с таковой для растительных материалов. После начального периода быстрой минерализации легкодоступных компонентов, следует более медленная стадия минерализации устойчивых веществ. Средний уровень разложения добавленных в почвы меченных Си N клеток бактерий и грибов через 10 дней инкубации составлял 43 и 34 % для нарабурозема и чернозема соответственно. Через 28 дней инкубации была минерализована примерно половина органического углерода (Mammoto et al,, 1982a). Дополнительная минерализация растительной и микробной биомассы с почти равным отношением C;N (8,3 и 8,0, соответственно) на фоне внесения азотного удобрения в серую лесную почву была практически одинаковой, составляя примерно 11% от исходного содержания азота (за 180 сут. при 60 % ППВ и 20 С) (Кудеяров, 1999). Эти исследования показывают, что в целом биохимические механизмы разложения компонентов микробных клеток существенно не отличаются от механизмов разложения сочных растительных тканей.
