Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. О взаимодействии гуминовых веществ и живых организмов 6
1.1. Функции гуминовых веществ в биосфере 6
1.2. Биологическая активность гуминовых веществ 12
1.3. Основные гипотезы природы биологического действия гуминовых веществ 13
1.4. Использование биологических объектов в тестировании 22
Глава 2. Объекты и методы исследования 27
2.1. Химические свойства ГК 27
2.2. Биологические объекты 30
2.3. Методика эксперимента по сорбции гуминовых кислот клетками дрожжей 31
2.4. Методики экспериментов на биологических объектах: 32
2.4.1. Эксперименты на проростках пшеницы 32
2.4.2. Эксперименты на клетках дрожжей 32
2.4.3. Эксперименты с применением бактериального люминисцентного биотеста 34
Глава 3. Результаты и обсуждение 38
3.1 Характеристика использованных гуминовых кислот 38
3.2. Сорбция гуминовых кислот клетками дрожжей 43
3.3. Стимулирующие, адаптогенные и протекторные свойства гуминовых кислот 50
3.3.1. Предварительный тест на биологическую активность 50
3.3.2. Информативность параметров роста биомассы и интенсивности дыхания клеток для исследования биологических эффектов действия ГК 52
3.3.3. Стимулирующее действие гуминовых кислот на клетки дрожжей 76
3.3.4. Влияние гуминовых кислот на способность дрожжей к адаптации 77
3.3.5. Протекторные свойства гуминовых кислот, сорбированных на поверхности клеток 80
3.4. Пространственная локализация биопротекторного действия гуминовых кислот в почве 84
Заключение 88
Выводы 89
Список литературы 90
- Биологическая активность гуминовых веществ
- Использование биологических объектов в тестировании
- Методика эксперимента по сорбции гуминовых кислот клетками дрожжей
- Стимулирующие, адаптогенные и протекторные свойства гуминовых кислот
Введение к работе
Биологическая активность гуминовых кислот (ГК) интенсивно изучается в течение длительного времени. Результаты этих работ неоднократно обобщались в ряде обзорных статей и монографий (Христева, 1951; Кононова, 1963; Александрова, 1972; Орлов, 1993; Горовая'и др., 1995; Чуков, 2001; Попов, 2004). Многочисленные исследования позволяют констатировать наличие положительного отклика живых клеток на присутствие ГК в окружающей среде. В тоже время такие сложные по химическому составу и строению вещества как ГК не могут не обладать двояким эффектом и должны оказывать, в зависимости от условий, как положительное, так и отрицательное воздействие на живую клетку. В литературе встречаются довольно многочисленные данные о негативном влиянии ГК на состояние живых организмов (Тишкович и др., 1982; Peng et al., 1999; Nieman et al., 2005). Вероятно, это связано и с тем, что во многих случаях для оценки действия гуминовых веществ на живые объекты использовались различные тесты. Мало изученной областью в исследованиях биологической активности ГК является анализ конкретных механизмов транспорта макромолекул ГК внутрь клеток и, в частности, взаимодействия ГК с клеточными стенками и периплазматической мембраной клеток.
Физиологическая и биопротекторная активность относятся к важнейшим функциональным параметрам гумусовых веществ (Чуков, 2001). Благодаря этим свойствам ГВ играют особую роль как в обеспечении высокой биологической продуктивности наземных экосистем, так и в повышении устойчивости этих систем к неблагоприятным воздействиям. Эти функции в почве выполняет целостная, специфически организованная, в том числе и пространственно, система гуминовых веществ почвы. Гуминовые вещества, присутствующие в почвенных растворах и существующие в виде пленок на поверхности минеральных фаз и самостоятельных фаз, могут выполнять протекторную функцию по отношению к живым клеткам -
связывать токсичные вещества, предотвращая их поступление в клетку. Однако реальный вклад различных пулов гуминовых веществ в биопротекторную функцию почвы мало изучен. Фактически неизвестна роль ГВ, сорбированных клеточными стенками корней и почвенных микроорганизмов.
Исследование физиологического и биопротекторного действия ГВ имеют и значительную практическую ценность. В настоящее время на рынок поступает большое количество препаратов гуматов, для получения которых используются разные виды сырья и технологии. Ведется активная реклама и пропаганда их использования, однако до настоящего времени остается открытым вопрос о критериях оценки их качества и биологического действия. Использование только химических и физических методов не дает комплексную характеристику этих сложных объектов. В настоящее время становятся актуальными поиск надежных критериев контроля биологической активности гуматов, разработка методик экспрессного биотестирования препаратов, а так же выявление условий, в которых возможно проявление негативных эффектов от применения этих соединений.
Цель работы. Изучить взаимодействие ГК с поверхностью живых клеток и исследовать биологические эффекты, возникающие в результате этого взаимодействия.
В задачи работы входило:
Количественно оценить связывание ГК на поверхности клеток;
Изучить возможность использования параметров роста и
интенсивности дыхания клеток для исследования биологических эффектов действия ГК;
Изучить протекторные свойства ГК, связанных на поверхности
клеток;
Разработать схему пространственной локализации
биопротекторного действия ГК в почве.
Научная новизна работы. Впервые проведена количественная оценка сорбции ГК на поверхности клеток дрожжей. На основании проведенных экспериментов установлен полимолекулярный характер сорбции ГК живыми клетками. Показано, что молекулярные слои ГК, образующиеся на поверхности живых клеток в результате сорбции последних из растворов, могут играть роль активных фильтров, связывающих молекулы токсикантов, присутствующих в почве. ГК, находящиеся во внеклеточной среде в концентрациях, лежащих в области оптимума биологической активности ГК (0,1 - 1 мг/л), не только стимулируют клеточный рост, но и увеличивают адаптивные способности клеток. В качестве основного критерия биологической активности гуминовых кислот предложено рассматривать показатели, которые непосредственно описывают рост и состояние биомассы, в частности, величину биомассы и скорость ее удвоения.
Практическая значимость работы. Результаты работы могут быть использованы для разработки критериев тестирования биологической активности промышленных препаратов гуматов, оптимизации технологий получения этих препаратов, расчетов доз гуматов при их использовании в биореакторах и сельскохозяйственной практике.
Благодарности
Автор выражает глубокую признательность сотруднице кафедры
общего земледелия Куликовой Н.А., сотруднику института почвоведения МГУ Дёмину В.В., сотруднице кафедры химии почв Завгородней Ю.А., сотруднику кафедры биологии почв Вызову Б.А., сотруднице кафедры микробиологии Зарубиной А.П., за постоянное внимание, ценные консультации и помощь в работе. Автор выражает глубочайшею признательность сотрудникам кафедр общего земледелия, биологии почв и химии почв за сотрудничество и поддержку.
Биологическая активность гуминовых веществ
Начиная с работ Л.А. Христевой, выполненных в 30-40 годах и показавших, что выделенные из углей гуминовые кислоты вызывают положительные изменения в биохимическом статусе растений, высказывались различные гипотезы о молекулярных механизмах действия этих соединений.
Согласно гипотезе Л.А Христевой (Христева, 1951), физиологический эффект ГК обусловлен их влиянием на энергетический метаболизм клетки, которое заключается в активации процессов окислительного и фотосинтетического фосфорилирования и усилении белоксинтезирующей системы. А.И.Горовая (Горовая, 1993; Горовая и др., 1995) считает, что стимулирующее действие физиологически активных ГК обусловлено активацией процессов синтеза ДНК, РНК и белка, улучшением функционального состояния клеточных органелл и повышением митотической и пролиферативной активности в меристематических тканях.
Другие исследователи связывают физиологическую активность ГК с парамагнитными (Комиссаров, Логинов, 1981; Чуков, 2001), мембранотропными (Баталкин и др., 1982; Вахмистров и др., 1987; Мажуль и др., 1993), электронно-донорно-акцепторными (Бобырь, 1984) свойствами этих веществ, наличием широкого спектра функциональных групп (Орлов, 1993).
Рядом исследователей (Гуминский, 1957; Гуминский, 1968; Горовая и др., 1995) было выявлено усиление дыхания у растений под действием ГК. Ими было показано, что ГК стимулировали дыхание растений даже в условиях острого дефицита кислорода. Применение гуминовых препаратов в виде внекорневой подкормки растений показало, что гуминовые вещества, поступающие через листовую пластинку, оказывали влияние на процесс тканевого дыхания, однако эффективность их действия была мала и непродолжительна (Комиссаров и др., 1971). Экспериментами на митохондриях крысиной печени было продемонстрировано, что короткое воздействие ГК на объект вызывало прерывание окислительного фосфорилирования, тогда как при инкубации митохондрий с ГК в течение более длинного периода отмечалось положительное влияние на окислительное фосфорилирование (Visser, 1987).
В экспериментах с кормовыми дрожжами было найдено, что биостимулирующая активность ГК была наибольшей во фракциях с относительно небольшой молекулярной массой — меньше 10000 Да (Стрелков и др., 1991) и в интервале 500-1500 Да (Рыжиков и др., 1991). Аналогичные результаты получены и в опытах с растениями (Mato et al., 1972). Высокая биологическая активность фракции ГК относительно небольшой молекулярной массы объясняется большим содержанием в молекулах ГК как ароматических соединений, так и карбоксильных и фенол-гидроксильных групп (Piccolo et al., 1992). Относительно низкомолекулярные ГК поступают в клетки растений легче, чем более высокомолекулярных фракции ГК. Относительно низкомолекулярная фракция ГК передвигается по симпласту и непосредственно влияет на метаболизм растений, а более высокомолекулярная фракция ГК передвигается по апопласту и влияет на процессы, связанные с функционированием клеточной стенки растений (Nardi et al., 2002). Относительно низкомолекулярная фракция ГК тоже может передвигаться по апопласту, оказывая при этом воздействие на плазмалемму. Несмотря на то что более высокомолекулярные ГК способны прочно фиксироваться на клеточной стенке, они и в этом случае могут ускорять рост растений и снижать активность определенных ферментов (Vaughan, Orel, 1981).
В благоприятном влиянии ГК на растения некоторые исследователи (Rerabek, 1963; Сассо, Dell Agnola, 1984) находят аналогию с действием фитогормонов — ауксинов и гиббереллинов. Т.Ф. Овчинникова (Овчинникова, 1991) полагает, что ГК по характеру действия на растения, грибы и микроорганизмы, можно отнести к неспецифическим регуляторам роста. По мнению А.И. Попова (Попов, 2004) биологическая активность ГК, проявляющаяся в благоприятном влиянии гумусовых кислот на рост и развитие растений обусловлена тем, что ГК, попадая в растения, включаются в биохимические и биофизические процессы. Этот вывод автор подкрепляет ссылками на работы, в которых (Алёшин, Тюнеева, 1956; Красильников, 1958; Кононова, 1963; Прат, 1963; Прат, 1965; Гуминский, 1968; Комиссаров и др., 1971; Александрова, 1972; Карпухин, 1979; Горовая и др., 1995) как он полагает, факт поступления сложных органических молекул, в том числе и ГК, в растения через корневую систему и их дальнейшая ассимиляция является хорошо доказанным.
Для изучения процессов транспорта и взаимодействия ГК с живой клеткой широко применяются методы с использованием «радиоактивной метки». В ряде из этих работ использовались меченные по 4С гуминовые вещества (Prat, 1951, цит. по (Кононова, 1963)), (Ибрагимов, Фокин, 1974; Фокин и др., 1975; Карпухин, 1979). В этих экспериментах, «меченные» по С молекулы ГК вносились в питательную среду организмов. Через некоторое время, радиоактивный изотоп С обнаруживался во внутриклеточной среде исследуемого организма. Результаты этих экспериментов позволили авторам заявить о возможности поступлении всей молекулы ГК в клетку. Долгое время, несмотря на накапливающиеся сомнения и противоречия, результаты и выводы этих экспериментов не подвергались сомнению.
Использование биологических объектов в тестировании
Для получения объективных и представительных результатов о биологической активности столь неоднозначных природных объектов как ГК, необходимым является исследование их с использованием различных методов. Ведущую роль при этом, как мы полагаем, должны играть методы, в которых в качестве сенсоров используются либо живые организмы (или клетки и ткани), либо отдельные биохимические реакции. Информация, получаемая с помощью химических и физических методов, о составе и строение гуминовых веществ не позволяет в настоящее время надежно предсказывать их действие на живые объекты.
Современные аналитические методы (газожидкостная хроматография, ЯМР, масс-спектрометрия и др.) позволяют определить минимальное количество токсического соединения в образце. Однако всем этим методам присущи существенные недостатки: громоздкость аппаратуры, высокая стоимость анализа и необходимость специальной подготовки кадров. При этом нельзя получить ответ на основной вопрос - насколько опасно количество ксенобиотика и особенно смеси различных и часто неизвестной природы токсических веществ для жизнедеятельности организмов. Обходить указанные недостатки позволяет тестирование с использованием чувствительных к поллютантам живых организмов и при этом получать ответ о токсичности.
Учитывая это обстоятельство, в США уже в начале 80-х годов прошлого столетия появились законы Federal Water Pollution Control Act (1972) и Toxic Substances Control Act (1976), затем и в Европе (European Pharmacopeia, 2nd ed., Maisonneuve, Sainte-Ruffe, 1980, Chapter V.2.I.5.), которые утвердили процедуры определения токсичности образцов (Krebs, 1992). Тесты, основанные на биологических объектах, обязательно включали в общую аналитическую процедуру как первичные методы оценки общей токсичности отдельных компонентов, их смесей и мониторинга объектов окружающей среды. В биотестировании в обязательном порядке предусматривали использование чувствительных к поллютантам живых организмов (в основном, семена и проростки высших растений, пресноводных или морских - простейших, дафний, рыб и т.д.). Однако большинство таких анализов длительны по времени, требуют поддержания тест-обьектов, большого количества анализируемого материала и весьма субъективны, поскольку связаны с подсчётом процента повреждённых и погибших организмов или изменением их свойств (Bringmann, Kuhn, 1980; Quereshi et al., 1982; Ribo, Kaiser, 1983; Burton, Petersen, 1986; Coleman, Quereshi, 1995; Pardos et al., 2000).
Сравнительная оценка различных типов чувствительных биологических систем, проведенная в последние десятилетия, позволила выделить из множества биотестов один, основанный на бактериальной биолюминесценции и в значительной степени свободный от перечисленных недостатков. Преимуществами тест-системы на основе бактериальной биолюминесценции являются: простота и быстродействие (время анализа образца 5-30 минут и более), точность и воспроизводимость (ошибка эксперимента 10%), тестирование в микрообъёмах (от 0,1 до 1мл), а также корреляция с ответной реакцией, регистрируемой в других общепринятых тест-системах. Преимуществом тест-системы на основе бактериальной биолюминесценции является корреляция с ответной реакцией других биотестов, например, водорослей Chlorella sp., инфузорий Tetrahymena pyriformis, дафний, различных рыб, культуры ткани и высших организмов: 50% ингибирование свечения у люминесцентных бактерий - ЕС50 коррелирует с LD50 для животных (Korpela et al., 1989; Bulich et al., 1990; Steinberg et al., 1995; Ганшин, Данилов, 1997; Kaiser, 1998). Так, для многих тяжелых металлов, фенолов, нитро- и хлорбензолов величина 50% тушения свечения - ЕС50 соотносилась с ЛД5о с большим коэффициентом корреляции от 0,8 до 0,95 (Microtox instructions for operating. Hundred per cent effluent, color correction. //Microtox bulletin 6984. Becman Instruments. Inc. Carsbad. Calif. USA. 1980., 1980; Stewart, 1990). Так как очень широкий ряд соединений-ксенобиотиков влияют на интенсивность люминесцентной реакции in vivo, это позволило разработать высокочувствительный аналитический люминесцентный метод оценки токсичности различных образцов на основе бактерий-биосенсоров.
Бактериальная биолюминесценция.
Биологические сенсоры, чувствительным элементом которых являются интактные клетки бактерий, содержат фермент люциферазу, осуществляющую трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для быстрых и количественных измерений. К настоящему времени получен достоверный материал о строении, составе и функционировании люминесцентной системы, а также по ее генетической организации. Хотя люциферазы разных видов светящихся бактерий имеют специфические физические и кинетические свойства, все они катализируют одну и ту же реакцию, которая в общем виде может быть представлена следующей схемой (McElroy, Green, 1955;Baldwin et al., 1995): FMNH2 + RCHO + 02 a FMN + H20 + RCOOH + hv.
Фермент люцифераза классифицирована как монооксигеназа и аналогична другим флавиновым монооксигеназам, известным также как оксидазы со смешанной функцией (Данилов, Егоров, 1990). Люцифераза катализирует окисление восстановленного флавина (FMNH2) и длинноцепочечного альдегида (RCHO) в окисленный флавин (FMN), и в соответствующую длинноцепочечную жирную кислоту (RCOOH), происходит образование молекулы воды, а также излучение света. Для образования и рециклизации жирной кислоты в альдегид требуется комплекс редуктаз жирных кислот (Riendeau, Meighen, 1989). Редуктаза жирных кислот является мультиферментным комплексом и состоит из трех ферментов - редуктазы, трансферазы и синтетазы (Chatter j ее, Meighen, 1995). ЫАГ)(Р)Н-флавиноксидоредуктаза катализирует восстановление флавина. Постоянный приток восстановленного флавина для биолюминесцентной реакции обеспечивается NAD(P)H: FMH-оксидоредуктазой (Данилов, Егоров, 1990), что представлено на схеме:
NAD(P)H + Н+ + FMN FMN-pewKra3a- FMNH2 + NAD(P)+ Люминесцентная система светящихся бактерий рассматривается как альтернативный электронтранспортный путь, конкурентный цепи дыхательной системы. На флавиновом участке цепи переноса электронов люминесцентная система тесно связана с дыхательной цепью и ответвление от дыхательной цепи происходит на уровне восстановленного флавина. В дальнейшем биолюминесцентная реакция биохимической специфичностью не связана с дыханием.
Методика эксперимента по сорбции гуминовых кислот клетками дрожжей
Используемый биосенсор. В анализах использовали тест-систему "Эколюм-08", разработанную в МГУ им. М. В. Ломоносова (Данилов и др., 2002). Биосенсором служили стандартные лиофильновысушенные бактерии сконструированного генно-инженерного штамма со светящимся фенотипом Escherichia coli KI2 TGI, с клонированным в него lux-опероном из светящихся почвенных бактерий Photorhabdus luminescens ZMl (Данилов и др., 2002).
Подготовка биосенсора "Эколюм-08" к использованию в качестве биотеста. Перед проведением анализа биотест приводили в рабочее состояние, т.е. регидратировали лиофильновысушенные бактерии. Для этого вскрывали флакон с лиофильновысушенными бактериями - биореагентом (приготовлены и хранятся в лаб. биологически активных веществ кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова) и вносили во флакон 10 мл стерильной охлажденной до 4С дистиллированной воды, рН=7.5, - получили "маточную суспензию" бактерий. Несколько раз встряхивали флакон с суспензией бактерий и выдерживали "маточную" суспензию в холодильнике в течение 30 минут. Затем готовили "рабочую суспензию" бактерий в чистой отдельной стеклянной посуде при добавлении к "маточному" раствору 40 мл стерильной дистиллированной воды комнатной температуры рН=7,5. Выдерживали "рабочую" суспензию бактерий до комнатной температуры. Использовали "рабочую" суспензию бактерий с 1-4x10 кл./мл в анализах.
Процедура проведения анализа и определение индекса токсичности. Измерение контроля всегда должно предшествовать измерению опыта, так как интенсивность свечения бактерий зависит от внешних факторов и не является строго постоянной величиной во времени. В связи с этим метод измерения токсичности не зависит от исходной первоначальной величины свечения биосенсора и необходимо постоянно сравнивать опытный образец с контрольным образцом. Интенсивность свечения бактерий регистрировали с помощью люминометра "Биотокс-6МС" (Россия). Измерения токсичности образцов проводили при комнатной температуре (20С) следующим образом. Наливали в чистые кюветы от люминометра объёмом 1,5 мл по 0,1 мл рабочей суспензии биосенсора. К контрольной кювете добавляли 0,9 мл дистиллированной воды (рН=7,5), к опытной - равный объем (0,9 мл) исследуемого водного образца и отмечали время. Общий объем растворов а кювете равен 1 мл. Эффективность действия токсического вещества обычно растет во времени, особенно в первые минуты, поэтому время экспозиции опытного и контрольного образца с биосенсором было одновременным и строго фиксированным, кювету с образцом помещали в кюветное отделение люминометра и регистрировали интенсивность свечения контроля (1о), затем сразу регистрировали интенсивность свечения опытного образца (7) и определяли величину индекса токсичности (Т) во времени через 5, 15 и 30 мин. Для получения достоверных данных одновременно регистрировали биолюминесценцию контрольных и опытных образцов (в 3-х повторностях).
Оценку токсичности анализируемой пробы с использованием бактериального биолюминесцентного биосенсера принято классифицировать на группы по индексу токсичности (Т - ингибирование свечения) по формуле:Т = 100х(/о- 1)/х1о при фиксированном времени экспозиции контрольного и опытного исследуемых образцов: значение Т меньше 10% - образец нетоксичен; значение Т меньше 20% - допустимая степень токсичности; значение Т от 20% до 50% - образец токсичен; значение Т равно или больше 50% - образец очень токсичен.
В некоторых анализах наблюдали в опытной пробе стимуляцию свечения биосенсора, превышающую показатель интенсивности свечения биотеста в контрольной пробе, т. е. величина Т отрицательная. Механизм стимуляции биолюминесценции неясен, но принято делать вывод об отсутствии токсичности образца (Ревазова и др., 2003). Однако следует отметить, что стимуляция свечения значительно затрудняет интерпретацию результатов. Анализ в течение 5, 15 и 30 мин позволяет делать выводы о действии токсического вещества в случае его наличия (временный или аккумулирующий эффекты). На основании ряда экспериментальных данных некоторые исследователи высказывают предположение, что для большинства неорганических веществ токсический эффект возрастает со временем, тогда как для многих органических веществ токсичность выявляется в первые минуты и потом может даже постепенно снижаться. Механизм такого эффекта неясен, однако подобная тенденция обнаружена на природных штаммах люминесцентных бактерий и рекомбинантных генно-инженерных штаммах с приобретенным люминесцентным фенотипом (Данилов и др., 2002).
Аналитическая система "Эколюм" обладает большими преимуществами перед другими сенсорами на основе люминесцентных бактерий, позволяя проводить анализ и при более высоких температурах. Методики измерений интегральной токсичности воды, почв, воздушной среды, химических материалов и изделий с помощью биосенсора Эколюм имеют свидетельство о метрологической аттестации, зарегистрированы в Департаменте Государственного санитарно-эпидемиологического надзора РФ.
Стимулирующие, адаптогенные и протекторные свойства гуминовых кислот
Полученные данные показывают, что скорость отклика клеток на присутствие токсиканта в питательном растворе высокая. Сравнение контрольных вариантов с вариантами, в которых присутствуют ГК (столбец «1-2» в таблицах), показало, что во всех сериях для начального отрезка кривой роста между ними наблюдаются достоверные различия.
В тоже время аналогичный анализ процессов на стационарной фазе роста показал, что только в одном случае из шести (серия «Cd(II)+ ГКт» (рис.ібв)) наблюдается достоверное различие между вариантами.
Во всех шести сериях на начальных фазах роста наблюдались значимые различия между вариантами «токсикант» и «токсикант+ГК» (столбец «3-4» в таблицах), на стационарной фазе роста значимые различия были обнаружены в пяти вариантах из шести. Исключение составила серия «NaN3+n0r» (рис. 16а).
Кривые роста клеток дрожжей, не отличаются по форме для вариантов с различными ГК. Они соответствуют стандартной кривой роста периодической культуры.
Таким образом анализ динамики изменения численности клеток дрожжей на различных фазах роста позволяет четко и наглядно выделить эффект присутствия во внеклеточной среде гуминовых кислот и биопротекторное действие этих соединений. Исследование дыхания клеточной биомассы
С целью изучения динамики изменения интенсивности дыхания клеточной культуры, нами было произведено определение количества выделявшегося COi . Для этого одновременно с отбором аликвот для определения численности дрожжей, мы отбирали пробы из тех же культивационных ёмкостей для определения СОг хроматографическим методом. Методически было невозможно проанализировать все повторности по всем вариантам, поэтому повторности в рамках вариантов объединялись и в дальнейшем анализировались «усредненные» пробы. На рис.17 и рис.18 представлена динамика интенсивности дыхания суспензии дрожжей на начальных фазах роста. Ход кривых удельной интенсивности дыхания суспензии дрожжей на начальных фазах роста качественно не различается для гуминовых кислот из торфа и угля. Условия проведения данных экспериментов не позволили получить несколько повторностей для одной временной точки, поэтому проведение статистической обработки результатов по схеме, использованной в предыдущем эксперименте, оказалось невозможным. Тем не менее, в большинстве случаев прослеживаются две четкие тенденции: в вариантах с гуминовой кислотой интенсивность дыхания всегда выше, чем в контроле; в вариантах, содержащих токсикант, интенсивность дыхания также всегда выше, чем в контроле.
Если в первом случае увеличение интенсивности дыхания в присутствии гуминовых кислот по сравнения с контролем обусловлено большей скоростью роста, то для объяснения увеличения интенсивности дыхания в присутствии «токсиканта» следует предположить, что клетки дрожжей находятся в состояние стресса и вынуждены расходовать энергию не на рост, а на компенсацию негативных последствий присутствия токсиканта в культуральной среде.
Таким образом, использование показателя интенсивности дыхания в качестве основного теста для оценки биопротекторных свойств ГК может привести к противоречивым результатам.
Для анализа результатов определения величины биомассы и скорости дыхания культуры дрожжей на стационарной фазе роста, мы сочли целесообразным использование статистической обработки. Так как на стационарной фазе не происходит изменения численности клеток дрожжей (или оно незначительно), то с хорошим приближением можно полагать, что в данном случае мы получили данные по варьированию одного параметра биомассы. В этом случае для сравнения значимости различий между вариантами можно использовать t-критерий Стьюдента.
Данные по средней удельной продукции СОг и результаты соответствующей статистической обработки, приведены для ГКт на рис.19, а дляГКу на рис.20. Сравнительный анализ величины биомассы и интенсивности дыхания на стационарной фазе позволяет вновь говорить, о противоречивости полученных результатов. Во всех случаях наблюдается следующая тенденция (в ряде вариантов подтверждаемая с помощью статистических критериев) -величина биомассы дрожжей, определенная методом светорассеяния, в вариантах с «токсикантом» всегда ниже чем в контроле и в присутствии только ГК, в то время как интенсивность дыхания в вариантах с «токсикантами» всегда выше, чем без них.
