Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Проблема адаптации растений к нестерильным условиям и пути её решения 8
1.2. Фитоалексины и их роль в формировании иммунитета растений ...14
1.3. Иммунизация элиситорами 16
1.3.1. Биотические эписиторы, особенности иммунизации растительных объектов 16
1.3.2. Биопрепараты нового поколения эмистим, экост 1/3 и возможность их практического применения 20
1.4. Коллекции растительных объектов in vitro и их значение 22
1.4.1. Пересадочные коллекции 22
1.4.1. Депонированные коллекции 24
1.5. Использование криосохранения для консервации генетических ресурсов 26
1.6. Сомаклональные и эпигенетические вариации 30
1.6.1. Происхождение и причины сомаклональных вариаций 33
1.6.2. Частота сомаклональных вариаций 37
1.7. Цель,задачи исследований 41
2. Материалы, методика и условия проведения экспериментов 42
3. Объекты исследований 48
4. Результаты экспериментов и обсуждение 51
4.1. Эффект элиситоров при клональном микроразмножении ягодных культур in vitro 51
4.2. Повышение адаптивной способности растений в нестерильных условиях под влиянием элиситоров 78
4.3. Последействие криосохранения на рост и развитие малины и земляники в открытом грунте 98
5. Влияние типа экспланта на стабильность проявления признаков у растений земляники в полевых условиях 112
6. Экономическая эффективность применения элиситоров при производстве посадочного материала методом клонального микроразмножения 122
Выводы 127
Рекомендации 128
Литература 130
- Фитоалексины и их роль в формировании иммунитета растений
- Использование криосохранения для консервации генетических ресурсов
- Повышение адаптивной способности растений в нестерильных условиях под влиянием элиситоров
- Влияние типа экспланта на стабильность проявления признаков у растений земляники в полевых условиях
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время серьёзные опасения вызывает увеличивающееся антропогенное воздействие на биосферу. Сложнейшая экологическая обстановка, сложившаяся на нашей планете, привела к тому, что сельскохозяйственные растения постоянно находятся в условиях экологического стресса, поскольку страдают от болезней, вредителей, бесконтрольного применения пестицидов, переизбытка удобрений.
Химическое и инфекционное давление на растения часто превышает порог возможностей их адаптации. Поэтому сейчас особенно важно не только глубокое понимание природы фиторезистенции, но и разработка различных средств иммунокоррекции, с тем чтобы эффективно контролировать иммунный ответ растений, преодолевая его дефицитность.
Пока единственным способом защиты восприимчивых к болезням форм растений является обработка их пестицидами. Между тем, почти все пестициды входят в классы соединений, среди которых встречаются мутагены и канцерогены. Часто пестициды поражают не только болезнетворные мишени, на которые направлено их действие, но и организмы, которые мишенями не являются. Поэтому необходимы альтернативные методы защиты растений. Они нужны для получения экологически чистой продукции и оздоровления окружающей среды- Одним из наиболее перспективных принципов защиты растений является метод индуцирования их устойчивости.
Метод основан не на подавлении фитопатогенов, как это имеет место в случае использования пестицидов, а на индуцировании естественного потенциала растений по тому образцу как это происходит в природе (ОЛ. Озерецковская, 1994).
Специфической проблемой клонального микроразмножения является перевод растений из пробирок в нестерильные условия. Изучение природы фнтоиммунитета позволит повысить адаптивные способности растений - регенерантов. С этой целью используют биогенные элисито-ры фитопатогенов, вызывающие образование фитоалексинов, веществ, играющих главную роль в формировании фитоиммунитета. Индуцирование устойчивости растений может стать альтернативой создания трансгенных растений или удачным дополнением процесса грансгенеза.
Кроме того, хозяйственная деятельность человека приводит к изменению биогеохимических циклов и не оставляет места для существования в них представителей флоры и фауны. В настоящее время происходит наиболее сильный в истории Земли период силового уничтожения видов, в результате которого из существующих более 5 тысяч видов ежегодно исчезают от 3 до 5. Потеря биологического разнообразия - это потеря ценного генофонда и потеря устойчивости экосистем.
К началу XXI столетия под угрозой реального исчезновения находится примерно 9 % существующих на Земле представителей флоры и фауны. Исходя из этого главной задачей цивилизованного общества должно быть всемерное стремление к поддержанию эволюционно обусловленного разнообразия видов, как в рамках биоценозов, так и в отдельных популяциях (Б.Л. Астауров, 1974).
Наиболее простым способом сохранения генофонда является создание условий для существования популяций. Однако, по подсчётам специалистов для сохранения только основных типов популяций из землепользования необходимо исключить более 30 % территорий. В настоящее время в мире в государственном ведении находится примерно 2,5 % территорий. А при всё возрастающей потребности в продовольствии даже небольшое увеличение отчуждённых земель сразу же столкнется с противодействием сельскохозяйственных структур. Кроме того,
ограниченные популяции в заповедниках и заказниках не способны сохранить разнообразия вида в результате спонтанного дрейфа генов (Б.Н. Вепренцев, Н.Н. Ротт, 1984).
Возможным решением проблемы становится культура ткани (L.A. Withers, MM. Engels, 1990). Для некоторых видов культура ткани является единственно возможным способом сохранения генетического разнообразия. Хотя этот метод и имеет большие потенциальные возможности для вегетативно размножаемых культур и видов с рекальцит-ратными семенами, возникают две технические проблемы: первая - генетическая нестабильность материала в культуре ткани, возникающая из-за сомаклональных вариаций во время регенерации растения, вторая -время сохранения ткани лимитировано.
Значительная работа проведена в обоих направлениях. Развитие техники культуры ткани для некоторых видов значительно снизило уровень сомаклональных вариаций. Быстрый прогресс в области криокон-сервации даёт возможность сохранять растительные материалы в течение длительного периода. Хотя обе проблемы еще далеки от решения, дальнейшие исследования в этой области сделают консервацию растительных генетических ресурсов вполне экономически эффективной (М-Simpson, L.A. Withers, 1986; Rao Ramanatha, 1992; M.M. Engels, 1993; Rao Ramanatha, W.R. Kennet, 1994).
Фитоалексины и их роль в формировании иммунитета растений
Одним из механизмов иммунитета является способность растений образовывать в ответ на инфицирование антибиотические вещества, практически отсутствующие в интактных тканях - фитоалекснны (фито -растение, алексо - отражение атаки). Впервые о фитоалексинах сообщили в 1940 г. Мюллер и Боргер, но первый фитоалексин был получен много лет спустя. В настоящее время химическая структура и физиологические функции фитоалексинов изучаются во многих странах мира. В исследованиях достигнут значительный успех, о чём, в частности, свидетельствует идентификация более 350 фитоалексинов для приблизительно 30 ботанических семейств (ГЛ. Курсанова, 1988; J. Кис, 1995).
В настоящее время о фитоалексинах известно следующее: 1. Фитоалекснны представляют особую группу антибиотических веществ, продуцируемых только высшими растениями в ответ на контакт с фитопатогенными микроорганизмами, их метаболитами или химическими соединениями и, достигнув фунгитоксичных концентраций, способных выполнять защитную роль в явлениях фитоиммунитета (Л.В. Метлицкий, ОЛ. Озерецковская, 1973; N. Furuchi, J. Suzuki, 1990; С.А. Ryan, E.E. Farmer, 1991; A. Yamadaetal., 1993.J. Rananski etal., 1996). 2. Отсутствие фитоалексинов у микроорганизмов и возможность их индуцировать у растений химическими веществами свидетельствует о том, что образование фитоалексинов определяется геномом растения хозяина, а не паразита. Метаболиты последнего, как и ряд химических соединений, выполняют роль индуктора этого процесса (LA. Cruickshank, D.R. Perrin, 1968; Е. Chalutz, М. Stanmann, 1969; J. Frank, J.P. Paxton, 1970; J. Sharpet et a!., 1984; R. Dixon, 1986). 3. Высоким содержанием фитоалексинов характеризуются не здоровые, а уже некротизированные клетки. Именно поэтому защитная роль фитоалексинов проявляется в устойчивости растений, основанной на реакции сверхчувствительности - одной из наиболее распространенной в фитоиммунитете, при которой за счёт гибели отдельных клеток сохраняется организм в целом (Л.В. Метлицкий, ОЛ. Озерецковская и ДР-, 1970).
Открытие и изучение защитной роли фитоалексинов существенно продвинуло наши представления о природе фитоиммунитета. Хорошие результаты иммунизации путем инфицирования растений фитопатогенами получены американским исследователем профессором Д. Кучем (J. Кис, 1966). Главными объектами исследования Куча были растения семейства тыквенных и табак. В качестве первичной инфекции Куч использовал ослабленные культуры патогенов, либо авирулентные расы патогенов, либо вирулентные расы патогенов. Иммунизация обеспечивала защиту, по крайней мере, от 12 различных болезней, включая облигатные и факультативные грибы, бактерии, вирусы локального и системного действия.
Однако, иммунизация жизнеспособными патогенами таит в себе опасность распространения той самой болезни, с помощью которой и осуществляют иммунизацию. Пытались заменить иммунизацию патогенами, иммунизацией выделенными из них веществами, исследователи испробовали в качестве иммунизаторов клеточные стенки грибов и бактерий, их экстр ацеллюлярные экстракты, эксудаты флоэмы, экстракты инфицированных и иммунизированных тканей, однако, не всегда добивались успеха.
Иммунизация растений метаболитами фитопатогенов имеет преимущества против иммунизации растений фитопатогенами, поскольку: - позволяет избежать опасности заражения посевов; - существенно упрощает и удешевляет биотехнологию иммунизации. Однако, достичь успешной иммунизации возможно лишь при соблюдении как минимум трёх необходимых условий (И.В. Березин, 1984; Л.В. Метлицкий, О.Л. Озерецковская, 1985). 1. Иммунизировать растения можно только с помощью определённых соединений патогенов, носящих название индукторов или элисито-ров. Эти вещества патогенов распознаются растением, и растение отвечает комплексом защитных механизмов: образованием фитоалексинов, ингибиторов протеиназ, образованием патогензависимых белков - PR-белков, активных форм кислорода, укреплением клеточных стенок за счет отложения в них лигнина, суберина, каляозы. Все эти защитные механизмы в сумме и формируют мультикомпонентный ответ растительной ткани (J. Ebel, Е. Cosio, 1994). 2. Иммунизировать растительные ткани можно с помощью только определённых концентраций элиситоров, причём концентраций существенно более низких, чем те, в которых элнситоры вызывают образование фитоалексинов в растительных тканях. Использовать высокие концентрации элиситоров, которые индуцируют фитоалексины и, тем самым, как бы "заготавливают их впрок", в расчёте на будущую инфекцию не только нецелесообразно, но и просто опасно. Опасно потому, что содержащие фитоалексины растительные ткани могут становится ядови-тыми для человека. Нецелесообразно потому, что фитоалексины мета-болизируются тканями растений и исчезают. Смысл успешной защиты заключается в том, чтобы защитные механизмы срабатывали там и тогда, где и когда проникает инфекция (J. Кис, 1992). 3. Иммунизировать растительные ткани возможно только при условии очистки злиситоров от сопутствующих им факторов агрессии фитопатогенов - токсинов и супрессоров, подавляющих защитные системы растений и, тем самым, препятствующих действию злиситоров. Преимуществами иммунизации являются: - экологическая безопасность такого способа защиты растений; - крайне малые концентрации рабочих растворов злиситоров; - системность и продолжительность иммунизации; - неспецифичность иммунизации, которая защищает растение от комплекса болезней, вызываемых грибными, бактериальными и вирусными фитопатогенами, а также нематодами; - иммунизация основывается на активировании многих защитных реакций (мультикомпонентность защиты), т.е. она полигенна по своей природе; - защитные реакции в иммунизированных растениях возникают только в случае их инфицирования; - иммунизация стимулирует рост растений, некоторые из злиситоров подавляют апикальное доминирование, в результате чего в одном растении возрастает число побегов; - иммунизация стимулирует процессы раневой репарации растений; иммунизация сокращает коэффициент размножения паразитов и, следовательно, иммунизированные посевы являются преградами на пути распространения инфекций.
Использование криосохранения для консервации генетических ресурсов
Криосохранение - это сложный многоэтапный процесс, который проводят с целью неограниченно долго сохранить стабильными живые клетки, ткани и органы в состоянии анабиоза (A. Charrier et al., 1991; L. Withers, 1991; R.S. Escobar et al., 1993). Единственно надёжным средством для решения этой задачи является глубокий холод (-140 С), обеспечиваемый пока наиболее практично с помощью жидкого азота(-196С) Поэтому важнейший этап процесса криосохраиения - замораживание.
Необходимо отметить два исторически разных подхода к решению проблемы криосохраиения (Р.Г. Бутенко, А.С. Попов, 1979; А.С. Попов, 1981; А.С. Попов, 1982). Первый шёл от генетически детерминированной способности морозостойких растений к холодовому закаливанию (И.И. Туманов и др., 1968). Второй - от программного замораживания в присутствии криопротекторов (веществ, затрудняющих образование льда и защищающих от действия других повреждающих факторов) с постоянной малой (1-5 град/мин) скоростью, давно разработанный для культивируемых in vitro клеток животных (К. Nag, Н. Street, 1973).
Процесс замораживания прост только для достаточно сухих объектов (пыльца, ортодоксальные семена), которые можно прямо погружать в азот и оттаивать впоследствии на воздухе в обычных условиях.
В случае оводнённых клеток, тканей и органов растений криосохранение является крайне экстремальным процессом и начинается, как правило, с этапа подготовки (специальное предварительное культивирование), а заканчивается рекультивированием, проводимым часто в условиях, обеспечивающих интенсивное деление клетки. Успешным этот процесс считается при возобновлении роста культур. По опубликованным данным, к настоящему времени успешное криосохранение клеточных и тканевых культур in vitro достигнуто примерно для 0-65 видов, из которых около 30 - культуры меристем (А.С. Попов, 1993).
Основные трудности связаны со спецификой как самих растительных клеток (большие размеры - до 2000 мкм, сильная вакуолизация), так и гетерогенностью их популяции in vitro. В любой культуре клетки имеют физиологические и морфологические вариации, что отражается на их крнеустойчивости, и поэтому неизбежно, что далеко не все клетки выдерживают криосохранение.
В случае меристематических культур ситуация дополнительно усложняется, так как каждая меристема является, в сущности, микроорганом размером в среднем 500 мкм, в котором наряду с делящимися клетками собственно меристемы, характеризующимися малыми размерами и отсутствием большой вакуоли, присутствуют клетки других тканей, находящиеся на разных стадиях дифференцировки, вытянутые и ва-куолизированные в различной степени. Криоусгойчивость этих клеток намного меньше, чем собственно меристематических. Все клетки меристемы взаимодействуют друг с другом, образуя единую организованную структуру. Проникновение криопротекторов и выход воды затруднён по сравнению с клеточными суспензионными культурами. В то же время взаимодействие клеток и, в частности, дифференцированных в примор-дии и собственно меристематических, имеет решающее значение для судьбы всей меристемы, пережившей глубокое замораживание - оттаивание. Если взаимодействие сохранилось, т.е. соответствующие клетки выжили, то меристема регенерирует растение, если же нет - то получится неорганизованный каллус (А.И. Гукасян, Р.Г. Бутенко и др., 1977). Из такого каллуса тоже можно регенерировать растение, но этот путь непрямой и нежелательный, так как при регенерации через каллус нет уверенности в точном воспроизведении исходного генотипа и необходимы специальные исследования растений-регенерантов, чтобы установить их тождество исходным (А.С. Попов, 1993).
Наиболее естественным способом подготовки к криосохранению растений умеренного климата является закаливание к холоду, но способность к нему ограничена генетически. Более универсальный метод подготовки - добавление в среду для культивирования осмотически активных алифатических спиртов - ман-нита или сорбита (S. Wiest, P. Steponkus, 1978; 1983), криопротекторные свойства которых общеизвестны. Показано, что и один из наиболее мощных и универсальных криопротекторов - диметилсульфоксид СЦМСО) влияет на стабильность, состав, состояние и проницаемость мембран и плазмалеммы клеток растений (L. Erdei, L. Vign, D. Dugits, 1982).
В основном криозащитное действие этих веществ обусловлено, вероятно, их способностью проникать в клетки и накапливаться там в значительных количествах, связывая воду и предотвращая тем самым чрезмерное сжатие (К.К. Kartha, 1980; L. Withers, 1994). Названные соединения обладают этой способностью в разной степени, она особенно характерна для ДМСО, но он токсичней других. На этапе рекультивирования полезно использовать различные способы интенсификации роста клеточных культур (А.С. Попов, Н.Ф. Черняк, В.Н. Пауков, 1984).
Исследования, проведенные в области крно со хранения, разработка успешных методов быстрого и медленного замораживания для различных видов дикорастущих и культурных растений позволяет надеяться, что этот метод будет широко применяться в будущем для сохранения генотипа редких, исчезающих и ценных видов растений.
Основные этапы криосохранения универсальны. Однако, необходим подбор оптимальных условии на каждом из этих этапов для каждого нового вида. Для расширения применения криосохранения необходимо, конечно, сочетание любых разумных подходов для совершенствования всех этапов этой процедуры.
Таким образом, хранение растений in vitro должно гарантировать: - поддержание удовлетворительного уровня генетической стабильности; - введение в культуру различных генотипов с соблюдением высокой генетической стабильности; - возможность регенерации и получения растений-регенерантов; - минимальный уход за культурами во время хранения; - высокую скорость размножения после периода хранения; - получение и хранение неинфицирова иного материала; - возможность международного обмена; - экономическую приемлемость хранения (Н.П. Дорошенко, Н.А. Хохлова, 1993; М.М. Engels, 1993). Однако, давно известно, что ткани и клетки растений в культуре in vitro претерпевают изменения (O.R. Patenen, 1963; J.O. Тоггеу, 1965; G. Morel, 1971; P.S. Carbon, 1973; P.S. Carlson, J.B.C. Polacco, 1975; C.E. Green, 1977). Эти изменения могут происходить в результате действия различных мутагенных факторов, от которых оградить коллекцию полностью практически невозможно, а также в результате естественных процессов, происходящих в растительных тканях.
Дело в том, что даже при таких низких температурах хранения, как +1 - +10 С и еще более низкой (до -18 С) для семян, в растительных тканях все ещё происходят биохимические процессы (А.С. Попов, 1982).
Повышение адаптивной способности растений в нестерильных условиях под влиянием элиситоров
Большие потери при переносе пробирочных растений в нестерильные условия являются одной из основных проблем, препятствующих распространению метода клонального микроразмножения, заставляют производить дополнительное число растений, использовать различные способы и приемы для предотвращения гибели растений, что приводит в итоге к удорожанию продукции.
Поскольку элиситоры являются индукторами комплексной устойчивости, то было интересно проследить, как сказывается присутствие эмистима в питательной среде на способность растений выживать в нестерильных условиях.
С целью повысить устойчивость растений к стрессовым условиям использовали 2 препарата из группы элиситоров - эмистим и экост 1/3. По утверждению производителей этих препаратов (НПК "Биор") указанные элиситоры способствуют формированию мощной корневой системы, повышению фотосинтетической способности, увеличению зеленой массы растений и устойчивости к ряду болезней, а также к стрессовым факторам среды.
С целью изучить возможность использования этих ценных свойств эмистима и экоста 1/3 была проведена серия экспериментов при переводе пробирочных растений в нестерильные условия.
Пробирочные растения ежевики сортов Агавам, Дарроу и Торнфри, укоренённые на среде с эмистимом, пересаживали в грунт, используя стандартную методику. Корни отмывали в водопроводной воде, обрабатывали раствором фундазола (2 г/л) и высаживали в субстрат, состоящий из торфа и песка (3:1 по объему), предварительно простери-лизованный в сушильном шкафу при температуре 115 С в течение 4 часов.
Наблюдения за высаженными растениями показали, что присутствие эмистима не повлияло на выживаемость растений. Процент выпадов в нескольких вариантах достигал 60 %. Число листьев и высота растений также не увеличились по сравнению с контрольными.
Обработка корней порошкообразным препаратом экост 1/3 вместо фундазола и высадка растений в стерильный субстрат не дали преимуществ в отношении выживаемости и общего состояния опытных растений.
В связи с этим мы пришли к выводу, что стерильный субстрат препятствует проявлению положительного действия этих препаратов, поскольку одним из свойств препаратов такого типа является стимулирование развития полезной почвенной микрофлоры (Ф.Ю. Гельцер, 1990). В дальнейшем мы использовали нестерильный почвенный субстрат. Полученные результаты подтвердили наше предположение.
Побеги ежевики, предварительно укорененные на питательной среде с эмистимом, высаживали в нестерильный субстрат. Контролем служили растения, высаженные в стерильную почву. Чтобы определить влияние каждого из элиситоров (экоста 1/3 и эмистима) эти препараты применяли отдельно. Так же оценивали результат их совместного применения.
Известно, что гибель пробирочных растений обычно наблюдается в первые 2 недели после высадки в грунт, поэтому после прохождения критического периода проводили оценку выживаемости растений.
Как показали наши наблюдения, выживаемость контрольных растений варьировала от 30 % у Агавама до 70 % у Торнфри и 65 % у сорта Дарроу.
Дополнительная обработка экостом 1/3 положительно сказалась на выживаемости растений сорта Агавам. Процент выживших растений составил 97 %. Повысился процент выживших пробирочных растений сорта Дарроу до 78 %. На растения сорта Торнфри обработка экостом І/3 не оказала существенного влияния (рис. 13).
Однако, совместное последовательное применение эм і ютим а и экоста 1/3 очень благоприятно сказалось на растениях сорта Торнфри, процент выживаемости которых после обработки повысился до 100.
На растения сорта Агавам прекрасный эффект оказывало присутствие эмистима в питательной среде для укоренения без дополнительной обработки экостом 1/3. Выживаемость достигала 100 %. Растения же сорта Торнфри наоборот снизили показатель выживаемости при этом способе применения индукторов комплексной устойчивости.
Таким образом, сортовая реакция растений на эмистим и экост 1/3 проявилась и в этом случае. Базируясь на наших результатах можно выделить оптимальные варианты применения этих препаратов для ежевики указанных сортов.
Для растений сорта Агавам - вполне подходит укоренение на обычной питательной среде с последующим опудриванием корневой системы экостом 1/3. Для сорта Торнфри - укоренение на среде с эмистимом в разведении 10-9 и опудривание корней экостом 1/3. Для сорта Дарроу - укоренение проводить на среде с эмистимом в разведении 10 без дополнительной обработки экостом 1/3.
Влияние типа экспланта на стабильность проявления признаков у растений земляники в полевых условиях
Объектом культуры in vitro могут быть различные ткани, взятые из разных частей растений. Общеизвестно, что генетическая стабильность получаемого in vitro материала зависит от модели размножения. Так, процесс размножения плодовых растений, в основном, связан с пролиферацией пазушных меристем. Генетическая же стабильность есть неотьемлимое свойство меристемы, которое может быть сохранено in vitro, если последняя культивируется в условиях, ингибирующих формирование каллуса.
В последнее время в селекционно-генетической практике широко используется метод "андрогенеза" основанный на культивировании пыльников in vitro. Основной интерес к культуре пыльников связан с тем, что это эффективный метод для получения гаплоидов. В пыльнике содержатся тысячи микроспор, каждая из которых теоретически может дать целое гаплоидное растение. На основе гаплоидов, появляется возможность путём удвоения числа их хромосом, быстро получать полностью гомозиготные линии (К.А. Касаева, 1988). Этим методом удалось получить растения у отдельных форм земляники, яблони, винограда и цитрусовых (Dayuan W. et al., 1988).
Многие виды при культивировании пыльников образуют кал-лусную ткань, в которой затем индуцируется органогенез и формируются растения. Каллусная ткань может содержать, наряду с гаплоидными, клетки других уровней плоидности (анеуплоидные, диплоидные, полиплоидные), что служит дополнительным источником генетической изменчивости).
Некоторые исследования показывают, что в культуре пыльников и пыльцы происходит элиминация вирусов (Abo-El-Nil М.М. et al., 1971; Lee E.S.M. et al., 1975; Гаврикова Л.И., 1986). Теоретически из одного пыльника можно получить до двух тысяч растений. Однако генетически идентичное воспроизведение через культуру пыльников достигнуто только для ряда декоративных культур (Stimart D.P. et al., 1982).
Культуры гаплоидных клеток и протопластов открывают широкие возможности для разного рода генетических исследований и манипуляций. Многочисленные эксперименты выявили, что придаточные побеги наиболее часто оказываются генетически однородными, если они регенерируют из молодых быстрорастущих тканей, например, развивающихся листьев. Обилие листьев при микроразмножении сделало их наиболее перспективным источником материала для ряда работ по культуре тканей. Культуру изолированных листьев успешно используют в селекции растений, поскольку способ регенерации побегов в каллусной культуре, индуцированной на листовых эксплантах, приводит к возникновению различных изменённых форм - сомаклональных вариантов (D.J. James, 1987; О.Р. Jones et al., 1988; N.S. Nehra et ah, 1990).
Большой интерес исследователей к листовым эксплантам объясняется также возможностью использования стерильной культуры высечек или целых листовых пластинок в работах по генной инженерии. Быстрый прогресс в молекулярной биологии растений привёл к возможности получения трансгенных растений (Э.С. Пирузян и др., 1985; DJ. James, 1987).
Наиболее простым и эффективным способом введения генов в растения является инкубация растительных клеток или высечек из листьев на питательной среде в присутствии агробактерии, имеющей плазмиду с необходимыми генами.
До недавнего времени работы по культуре тканей земляники были связаны в основном с культурой изолированных апексов, которая использовалась для оздоровления растений от вирусной инфекции ускоренного размножения и кр и о сохранения.
В настоящее время разработан ряд методик регенерации побегов из тканей листа (N.S. Nehra et al., 1989) и пыльников (О.С. Жуков и др., 1994) для некоторых плодовых и ягодных культур.
В лаборатории биотехнологии ВСТИСП из пыльников и листовых дисков были получены регенеранты ряда сортов земляники (Л.В. Алек-сеенко, 1998). Для изучения роста и развития этих растений в условиях открытого грунта был заложен маточник земляники сортов Женева (растения получены из листовых дисков и пыльников) и Трибьют (регенеранты из пыльников) (рис, 24).
По данным других авторов, урожайность земляники сорта Урожайная ЦГЛ, полученных из изолированных соматических тканей, снижалась почти на 40 %. Также отмечали среди опытных растений (т.е. полученных из каллусных тканей) большое количество экземпляров с мелкими плодами и значительно меньше растений с крупными плодами по сравнению с контролем. Изменения затрагивают также и такие признаки как количество цветоносов, количество ягод на одном растении, размер плодов, окраска околоцветника (В.М. Тюленев, 1998).
В наших исследованиях мы наблюдали за стабильностью некоторых хозяйственно-полезных признаков у земляники сортов Женева и Трибьют, полученных из листовых дисков и пыльников.
Растения сорта Женева цвели в течении всего сезона. В первую волну цветения не наблюдали существенных различий между опытными и контрольными растениями (табл. 17). Однако, необходимо отметить, что число генеративных образований было больше у растений-регенерантов из пыльников. Длина цветоноса была выше у растений, полученных из листовых зксплантов. Это способствовало предохранению цветков от повреждающего действия поздних весенних заморозков, так как повреждались в основном нижние цветки, поскольку холодный воздух застаивался в надпочвенном слое (рис. 29,30).
Во вторую волну цветения также обильно цвели растения из пыльников, а длина цветоносов значительно выше была у р астений-регенерантов из дисков. Также существенны были различия по числу цветоносов.
