Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Распространение и особенности эпизоотологии токсокароза плотоядных 10
1.2. Патогенез: гематологические, биохимические и патоморфологические изменения при экспериментальном токсокарозе 14
1.3. Иммунодиагностика токсокароза. Антигены и способы их получения. Методы диагностики 21
1.4. Лечение и химиолрофилактика токсокароза плотоядных 28
2. Собственные исследования 34
2.1. Материалы и методы исследований 34
2.2. Результаты исследований 40
2.2.1. Эпизоотология токсокароза собак в г. Костроме и в ряде населенных пунктов Костромского, Красносельского районов 40
2.2.1.1. Особенности эпизоотического процесса при токсокарозе в городской и сельской популяциях собак 40
2.2.1.2. Сезонная динамика токсокароза собак 42
2.2.1.3. Показатели зараженности токсокарами собак разного возраста 43
2.2.2. Изучение патогенного действия и патоморфологических изменений в органах при токсокарозе (однократное заражение и суперинвазия) 47
2.2.2.1. Симптомы, гематологические показатели и патоморфологические изменения при экспериментальном токсокарозе собак 47
2.2.2.2. Симптомы, гематологические показатели и патоморфологические изменения в тканях собак при суперинвазии Т. canis (дозы от 500 до 2500) 58
2.2.3. Иммунодиагностика токсокароза собак. Разработка иммунореагентов для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), латексагглютинации (РЛА) и использование их в диагностике токсокароза 67
2.2.3.1. Получение компонентов для изготовления экскреторно секреторных, соматических, кутикул ярных антигенов Тохосага canis с целью применения в РИГА и РЛА 67
2.2.3.2. Параметры изготовления экскреторно-секреторного, соматического антигенов из личинок второй стадии Тохосага canis и кутикулярного антигена из половозрелых токсокар 68
2.23.3. Результаты апробации РНГА и РЛА с экскреторно секреторным, соматическим личиночным и кутикулярным антигенами Тохосага canis 70
2.23.4. Сопоставление результатов серологического и коп роовос конического исследований собак (щенных сук) на токсокароз 74
2.2.3.5. Динамика антител к Тохосага canis при экспериментальном токсокарозе собак в сыворотке крови и молоке лактирующей суки 76
2.2.4. Изучение влияния антгельминтных препаратов фебантела и альбендазола на собак, спонтанно и экспериментально зараженных токсокарами 80
2.2.4.1. Изменение параметров крови собак спонтанно и экспериментально зараженных токсокарами и дегельминтизированных фебантелом и альбендазолом 80
2.2.4.2. Эффективность антгельминтных препаратов при токсокарозе собак 90
2.2.4.3. Динамика титров антител в реакции непрямой гемагглютинации у собак, экспериментально зараженных инвазионными яйцами Тохосага canis и дегельминтизированных фебантелом 10 % гранулятом и альбендазолом 99,7 % 91
3. Обсуждение результатов исследований 93
Выводы 100
Практические предложения 102
Список литературы 1
- Патогенез: гематологические, биохимические и патоморфологические изменения при экспериментальном токсокарозе
- Лечение и химиолрофилактика токсокароза плотоядных
- Изучение патогенного действия и патоморфологических изменений в органах при токсокарозе (однократное заражение и суперинвазия)
- Иммунодиагностика токсокароза собак. Разработка иммунореагентов для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), латексагглютинации (РЛА) и использование их в диагностике токсокароза
Введение к работе
Токсокароз широко распространен среди собак во многих странах мира (P.M. Schantz, 1989).
В крупных городах наблюдается непрерывный рост численности плотоядных. Инвазированные животные контаминируют окружающую среду яйцами токсокар. Яйца и личинки гельминтов проникают в организм специфических и неспецифических хозяев алиментарно, при каннибализме, трансплацентарно и трансмаммарно.
В различных регионах России токсокароз регистрируется у 10-76 % собак (Ф.Л. Радун, 1973, С.Д. Клочков, 1995, Ю.Э. Мысливец и др., 1998, А.Я. Лысенко и др., 1999, А.Н. Шинкаренко, 1999, Т.Г. Козырева, 1999, А.Н.Воличев, 2000, СИ. Калюжный, 2000, Н.В. Есаулова, МЛН. Акбаев, 2001, В.Б, Игнатьева, 2001, И.М. Зубарева, 2001, А.В. Жабров, 2002, Н.С. Беспалова, 2003).
Щенки от 2 до 30 дней заражены токсокарами на 100 %. Высокая напряженность эпизоотического процесса является следствием пожизненного носительства личинок Тохосага canis и трансплацентарной передачей их во второй половине беременности (Л.Е. Верета, О.Г. Малышкова, 1984).
Токсокароз - зооноз. Зараженные собаки представляют эпидемическую опасность. Патологические изменения в тканях людей, вызванные личинками токсокар, известны под названием синдрома «larva migrans» (Г.А. Котельников, 1984, Ю.А. Березанцев, В.В. Кривенко, 1986).
Установлено, что личинки токсокар при миграции проникают в капилляры легких, затем в большой круг кровообращения, центральную нервную систему, обусловливая патологические процессы в головном мозге (К.И. Скрябин, А.М. Петров, 1964).
В Болгарии зарегистрировано 723 больных с мигрирующими личинками токсокар. Описан случай менингита, индуцированный Тохосага canis (R. Jeleva et аЦ 1998).
Известны две формы токсокароза человека: висцеральный и глазной. Заболевание протекает с рецидивами и длительными ремиссиями (Л.С. Ходасевич и др., 1998).
В России и за рубежом для сероэпидемиологического обследования на токсокароз предложен иммуноферментный метод и другие иммунодиагностические тесты. Антитела к личинкам токсокар обнаруживают в сыворотках крови людей при помощи тест систем для ИФА «Тиаскар» (НПО «Вектор Бест», г. Новосибирск).
До настоящего времени недостаточно изучены особенности эпизоотологии, патогенез ларвального токсокароза собак, патоморфологические изменения в тканях, продолжительность персистенции и сохранения инвазионных свойств личинок токсокар у взрослых плотоядных.
За рубежом с 60-70 гг. прошлого столетия применяются различные диагностические тесты для выявления ларвального токсокароза.
В отечественной ветеринарной практике отсутствуют эффективные методы иммунодиагностики «larva migrans» при токсокарозе плотоядных.
В качестве источника антигена при иммунодиагностике ларвального токсокароза можно использовать взрослые особи Тохосага canis (С.С. Huntley et al., 1963, E.I, Jeska, 1967, R.F. Collins et al., 1975), личинки второй и третьей стадий (J.N. Annen et al., 1975), экскреторно-секреторные продукты личинок (D.H. Savigny, 1975, К. Matsumura et al., 1983).
В работах отечественных и иностранных исследователей подчеркивается трудность, длительность и невысокая эффективность лечения синдрома «larva migrans» у человека и животных (Н. Тумальская, 1997, А.Н. Воличев, 2000, S. Coman et al., 2000).
Актуальным для ветеринарной практики является научное обоснование комплексных профилактических и оздоровительных мероприятий при токсокарозе собак в питомниках служебного собаководства и в кинологических Центрах, включающих диагностические исследования и дегельминтизации сук перед наступлением беременности.
Цель и задачи исследований. Изучить особенности эпизоотологии токсокароза собак в г. Костроме, патоморфологические изменения в органах экспериментально зараженных токсокарами собак, разработать диагностические препараты из антигенов личиночных стадий Тохосага canis и адаптировать их для реакций непрямой гемагглютинаций и латексагтлютинации.
Задачи:
1. Изучить распространение, сезонную динамику и возрастные аспекты эпизоотологии токсокароза собак в г. Костроме, Костромском и Красносельском районах.
2. Разработать параметры культивирования яиц и получения экскреторно-секреторных и соматических антигенов личиночных стадий Тохосага canis.
Определить специфичность и активность иммунореагентов из личиночных стадий Т. canis, установить чувствительность, информативность РНГА и динамику антител при экспериментальном токсокарозе собак.
Изучить гематологические показатели при экспериментальном токсокарозе собак в различные периоды инвазии после дегельминтизации фебантелом и альбендазолом.
5. Выяснить патоморфологические изменения в органах экспериментально зараженных токсокарами собак.
Научная новизна работы. Впервые изучено распространение токсокароза среди собак в г. Костроме. Установлены сезонная динамика, возрастные аспекты эпизоотологии токсокароза, уровень зараженности в городских и сельских условиях, гематологический статус и патоморфологические изменения в органах собак, экспериментально зараженных Тохосага canis. Определены специфичность, активность иммунореагентов из личиночных стадий Тохосага canis и чувствительность,
7 информативность РНГА при экспериментальном токсокарозе собак. При помощи реакции непрямой гемагглютинации с экскреторно-секреторными и соматическими личиночными антигенами токсокар изучен иммунный ответ в различные периоды болезни.
Выяснены гематологические показатели при экспериментальном токсокарозе собак с пятикратной дегельминтизацией фебантелом 10 % гранулятом и альбендазолом 99,7 %. Разработана рациональная схема диагностических исследований и дегельминтизации сук перед наступлением беременности, как этап оздоровительных мероприятий при токсокарозе.
Практическая значимость. Результаты изучения эпизоотологии токсокароза собак, разработанные параметры культивирования яиц Тохосага canis и получения экскреторно-секреторных, соматических антигенов личинок токсокар являются основой для усовершенствования диагностики и профилактики болезни.
Полученные иммунореагенты рекомендуется использовать в изготовлении диагностикумов для реакции непрямой гемагглютинации. РНГА следует применять для обнаружения у сук до наступления беременности антител к мигрирующим и инкапсулированным в тканях личинкам Тохосага canis.
Результаты испытания фебантела 10 % гранулята и альбендазола 99,7 % с целью профилактики токсокароза рекомендованы для включения в схему комплексных профилактических и оздоровительных мероприятий при паразитарных болезнях собак в питомниках служебного собаководства и в кинологических Центрах.
На защиту выносятся следующие положения:
Патогенез: гематологические, биохимические и патоморфологические изменения при экспериментальном токсокарозе
Токсокары оказывают существенное патогенное воздействие на организм животных: задерживается рост щенков, вследствие интоксикации отмечается нарушение пищеварения, координации движений, параличи, эпилептиформные судороги и др.
На экспериментальных моделях изучен путь миграции личинок Т. canis во внутренних органах животных. Установлено, что личинки Т. canis проходят через стенки желудочно-кишечного тракта на всем его протяжени (А. Терзийски, 1972). Под влиянием ферментов происходит освобождение от оболочки яйца. В последующем личинки проникают в лимфатические и кровеносные сосуды, по которым током крови и лимфы переносятся во внутренние органы. Попадают в мельчайшие сосуды, проникают через их стенки и продолжают миграцию непосредственно в ткани органа.
При гепато-пульмональной миграции небольшая часть личинок Т. canis попадает в тонкий отдел кишечника через дыхательные пути и претерпевает вторичную миграцию. В головном мозге обнаружено большее количество личинок, чем в других органах, что обусловлено, по-видимому, интенсивным кровообращением. Воспалительные очаги различной давности в органах указывают на непрерывную миграцию личинок. Отсутствие воспалительной клеточной реакции вокруг личинок также указывает на их продолжающуюся миграцию. Иногда с током крови личинки попадают в центральный сосуд глаза и сетчатку (N.I. Duquid, 1961; I. Karell et al., 1977; H. Huisraans, 1977).
Мигрирующие личинки токсокар оказывают на организм зараженного животного механическое и сенсибилизирующее воздействие.
Сенсибилизирующими свойствами обладают продуктыжизнедеятельности мигрирующих лчинок, а также соматические антигены личинок после гибели.R. НоеррН (1923) описал патоморфологические изменения в органах лабораторных животных и установил, что при экспериментальном заражении у них происходит инкапсулирование личинок Ascaris lumbricoides, Toxocara canis, Toxocara cati.
Г.Г. Смирнов (1927), Г.Г. Смирнов и М.Ф. Глазунов (1928) при экспериментальном заражении морских свинок и мышей яйцами Ascaris lumbricoides выяснили, что миграция личинок аскарид вызывает патологические изменения в печени и легких, нередко приводящие к гибели. Задержавшиеся в печени личинки окружаются капсулой состоящей из клеток соединительной ткани. Изменения в легких характеризуются клеточной инфильтрацией с большим количеством эозинофилов.
A.M. Петров, Н.А. Налетова (1949) провели экспериментальное заражение шести серебристо-черных лисиц личинками Т. canis. При патоморфологическом исследовании обнаружены клеточные гранулемы, содержащие иногда фрагменты личинок.
Паразитарные узелки (гранулемы), формирующиеся в органах и тканях при гельминтозах, - основной признак иммуноморфологических реакций и своеобразная защита хозяина, особенно при высокой интенсивности инвазии (Э.Х. Даугалиева, 2000).Н.С.
Беспалова (2003) при изучении влияния имагинальных и мигрирующих форм Т. canis на организм собак установила динамические изменения гематологических показателей: уменьшение количества эритроцитов на 16,4 %, гемоглобина - 17,8 %, сегментоядерных нейтрофилов - 13,5 %; увеличение числа лейкоцитов на 17,5 %, палочкоядерных нейтрофилов в 2,8 раза, эозинофилов - на 3 %, моноцитов - 2,1 %, лимфоцитов - 11,8 %.
Установлены изменения биохимических параметров крови: понижено содержание общего белка на 3,4 %, мочевины - 13,5 %, альбуминов - 15,7 %, у-глобулинов - 6,7 %, глюкозы - на 2,3 мМоль/л, общего кальция и неорганического фосфора - 25,2 и 5,8 %, повышено содержание а-глобулинов на 19,2 %, 3-глобулинов - 3,7 %, ПВК и лактата- 2,1 % и 15,4 %; активность ферментов: аспартатаминотрансферазы, ланинаминотрансферазы и щелочной фосфатазы повышена на 28,5 %; 34,4 % и 19,4 % соответственно.
R. Hoeppli et al. (1949), J.F.A. Sprent (1951), J.D. Tiner (1953) заражали мышей инвазионными яйцами разных видов аскаридат: Тохосага canis, Ascaris lumbricoides и Parascaris equorum. При патоморфологическом исследовании печени отмечено, что в первую неделю после заражения ответные реакции хозяина, вызываемые изучаемыми видами аскаридат, сходны. В более поздний период инвазии личинки Тохосага canis обусловливают узелковые образования с инкапсуляцией личинок, что в меньшей степени выражено при заражении Ascaris lumbricoides и Parascaris equorum.
Работы M.H.D. Smith, P.C. Beaver (1953), H.F. Lee (1960), H. Higashikawa (1961), L.J. Olson (1962), B.N. Smha (1966) посвящены изучению патогенности личинок Тохосага canis для мышей и их способности длительное время оставаться инвазионными во второй стадии и не развиваться до имаго.
В.Л. Гербильский (1953), В.Л. Гербильский, В.В. Богданович (1956), Н. Munnich (1958), S. Tarcsynski (1962), G. Lupasco, D. Panaitesco, A. Soresco, A. Ciplea (1964) отметили, что после заражения мышей, крыс и морских свинок мигрирующие личинки аскарид вызывали изменения ткани кишечника в первые часы, печени - со 2-3 дня и легких - с 4-7 дня после заражения; отмечены увеличение веса надпочечников, селезенки и лимфатических узлов, эозинофилия и лимфоцитоз.
В результате экспериментальных работ по изучению патогенности аскарид - паразитов сурков и земляных белок В.В. ВаЬего (1960)
Лечение и химиолрофилактика токсокароза плотоядных
Химиотерапия до сих пор остается наиболее эффективным методом борьбы с гельминтозами плотоядных животных. В настоящее время применяется большое количество антгельминтных средств и их препаративных форм из разных групп химических соединений. До появления синтетических фармацевтических препаратов в качестве антгельминтиков применяли лекарственные средства растительного происхождения. Имеются сообщения об антгельминтной эффективности для плотоядных семян тыквы (В.И. Бондарева, Г.И. Диков, 1954), филиксана (Н.В. Демидов, 1987), корневища мужского папоротника (В.И. Пухов, 1935), ягод голубики (Н.П. Глумнев, 1956). На нынешнем этапе развития науки антгельминтики растительного происхождения в широкой ветеринарной практике не применяются. С развитием органической химии и увеличением объемов синтеза в мировой ветеринарной практике используют свыше 1500 антгельминтных препаратов и их лекарственных форм различного происхождения (Ф.А. Волков, 1996). Л.П. Хитенкова (1961) испытала пиперазина сульфат при токсокарозе песцов и лисиц. Получен 100 % эффект в дозах 0,2 г/кг живой массы и 2 г на гол. независимо от живой массы. Высокая эффективность пиперазина адипината в дозе 0,2 г/кг живой массы отмечена против токсокар у собак и кошек (J.F.A. Sprent, 1963; Л.А. Зыкин и др., 1968). Дегельминтизация пиперазином адипинатом 22-25 дневных щенков при токсокарозе в дозе 0,2 г/кг двукратно утром и вечером показала 100 % эффективность (Ф.Л. Радун, 1973). Нилверм (тетрамизола гидрохлорид, декарис) представляет собой смесь двух изомеров: правовращающего и левовращающего. Левовращающии изомер (левамизол) - активнодействующая часть нилверма. Нилверм в дозе 1мл/10 кг приводит к снижению интенсивности инвазии при токсокарозе в 19 раз. Препарат почти не оказывает негативного влияния на гематологические показатели собак, но воздействует на биохимический статус: снижается содержание альбуминов, у-глобулинов на 0,1-0,2 %, глюкозы, общих липидов - на 0,5 %, общего холестерина - на 1,6 % (Н.С. Беспалова, 2003). Нилверм в дозе 20 мг/кг живой массы животного при однократном пероральном применении 15-18 дневным щенкам обеспечивает 100 % гибель преимагинальных форм токсокар (Ф.Л. Радун, 1973). С.Д. Клочков (1995) определил 100 % эффективность против токсокар микрокапсулированной формы нилверма в дозе 10 мг/кг однократно.
Azhar Maqbool (1998) при дегельминтизации собак, зараженных токсокарами, левамизолом гидрохлоридом в дозе 15 мг/кг получил 100 % эффект. Однако левамизол и тетрамизол токсичны для плотоядных, поэтому их редко применяют (И.А. Архипов, 2002). Введение нилверма усугубляет морфофункциональные изменения в органах и тканях. Наблюдается тенденция к усилению процессов дистрофии и некроза, наряду с которыми отмечаются защитно-адаптационные реакции, обусловленные раздражающим и токсическим действием нилверма (Н.С. Беспалова, 2003). Пирантел - нематодоцидный препарат, применяемый для всех видов животных. Пирантел памоат в дозе 5 мг/кг живой массы, по данным Azhar Maqbool (1998), при токсокарозе показывает 95 % эффективность. A. Umar et al. (1986), TJ. Nolan et al. (1992) и J.N. Clark et al. (1992) отмечают 90-95 % эффективность пирантела памоата против Т. canis. Фенбендазол - препарат широкого спектра действия, производное бензимидазол - карбаматов. А.Н, Шинкаренко (1999) при испытании фенбендазола (фенкура) в дозах 10, 20 и 30 мг/кг живой массы получил 100 % эффект при токсокарозе, анкилостомозе и унцинариозе. По данным А.Н. Воличева (2000) препарат фебтал, содержащий в одной таблетке 150 мг фенбендазола в дозировке 1 таблетка на 1,5 кг живой массы при однократном применении, способствует уменьшению количества яиц Т. canis на 83 %. Экстенсэффективность препарата составляет 80 %. Эффективным антгельминтным средством ларвоцидного действия при токсокарозе (Toxocara canis, Т. cati) из группы бензимидазол - карбаматов является фенбендазол. Для получения полного терапевтического эффекта препарат назначают 3-5 кратно в дозе 25 мг/кг живой массы (Ф. Бене, 1999), S. Coman, V. Doana, A. Milu (2000) при испытании ромбендазола (альбендазола) при токсокарозе собак в дозе 10 мг/кг в течение двух дней получили 92-93 % эффект. Учитывая одновременное паразитирование в организме животных нематод и цестод в последние годы разработаны десятки комбинированных антгельминтиков широкого спектра действия, в том числе для плотоядных. Применение этих средств позволяет полностью освободить животных от гельминтов разных видов, родов и классов (И.А. Архипов, 2002). Комбинированный препарат «альбен С», в состав которого входит 250 мг альбендазола и 25 мг празиквантела, вызывает 95,6 % уменьшение числа яиц токсокар в 1 г фекалий, экстенсэффективность составляет 96 %. Одна таблетка рассчитана на 5 кг живой массы (А.Н. Воличев, 2000). Результаты исследований Н.С. Беспаловой (2003) показывают, что препарат «альбен С» при токсокарозе собак обеспечивает 100 % терапевтический эффект в дозе 1 табл. на 5 кг живой массы, однократно. Препарат не вызывает серьезных изменений гематологических показателей, биохимического и иммунного гомеостаза, а также значительных патоморфологических и патофизиологических последствий в организме собак. Альвет - антгельминтик широкого спектра действия, выпускаемый ЗАО «Нита-Фарм» в виде гранулированного порошка, 1 г которого содержит 200 мг альбендазола, 50 мг витамина Е, 1,25 мг кобальта, 0,5 мг селена. У щенков в возрасте до 6 мес. препарат в дозе 37,5 мг (7,5 мг по ДВ) на кг живой массы при токсокарозе показал интенсэффективность (ИЭ) 61,5 %, от 6 мес. до четырех лет - ИЭ=98,6 %, ЭЭ=75 %, старше четырех лет -ИЭ=90 %, ЭЭ=50 % (А.В. Жабров, 2002). Для дегельминтизации при токсокарозе СИ. Калюжный (2000) предложил два новых препарата дикетонового ряда: оксодион и метоксодион. При двукратном введении препаратов с интервалом 24 часа установлена 93,3, 97,9 и 100 % эффективность оксодиона в дозах соответственно 0,3, 0,35 и 0,4 г/кг и 90,2, 98,3 и 100 % эффективность метоксидиона в дозах соответственно 0,2, 0,25 и 0,3 г/кг. Комбинированный препарат каниквантел в дозе 1 таблетка на 10 кг массы при токсокарозе собак показывает 100 % эффект (И.Н. Ратникова, 2002).
Изучение патогенного действия и патоморфологических изменений в органах при токсокарозе (однократное заражение и суперинвазия)
Опыты выполнены на щенках 2,5-3 месячного возраста. Животных заразили различными дозами (от 150 до 900) инвазионных яиц Т. canis (схема опыта №1 в гл. «Материалы и методы исследований»).
Основные симптомыВ первые три дня после заражения, у животных каких-либо симптомов, свойственных для токсокароза не наблюдали. На четвертый день повысился аппетит, а к 15-17 дн. отмечена анорексия. С 13 дня опыта проявлялись беспокойство, угнетение, тусклый и взъерошенный шерстный покров, анемичность слизистых оболочек, учащение пульса, дыхания, ослабление тонов сердца, частый сухой кашель, болезненная реакция при пальпации грудной клетки и брюшной стенки в области печени, диарея, в двух случаях нарушение координации движения. Зараженные щенки заметно отставали в росте и развитии от контрольных животных. К 28 дню опыта живая масса подопытных животных уменьшилась в среднем в 2,1 раза по сравнению с контролем и составила 2150 г (в контрольной группе в среднем - 4600 г). Начиная с 23 дня опыта, у двух щенков наблюдали парез задних конечностей, неадекватные ответные реакции на раздражители, отказ от корма. К 48 дню после заражения погибли все животные подопытной группы (табл. 6.).
Как видно из таблицы 6, гибель свободных от гельминтов щенков при однократном экспериментальном заражении инвазионными яйцами Т, canis (опыт №1) наблюдается в более ранние сроки, чем при суперинвазии высокими дозами спонтанно зараженных токсокарами собак (опыт №2),Гематологические показатели
Изменения состава крови отмечены на 14 день инвазии (табл. 7). Установлено уменьшение количества эритроцитов на 12,7 % (3,93±0,88 х10,2/л), снижение концентрации гемоглобина на 28,75 % (57±1,05 г/л) и увеличение числа лейкоцитов на 35,2 % (16,9±0,95 х10%) по сравнению с такими же показателями у контрольных животных. Выявлено значительное уменьшение количества сегментоядерных нейтрофилов до 25,3±1ДЗ %, увеличение числа палочкоядерных нейтрофилов - 2,6 ±1,13 %, эозинофилов -17,6±0,40 %, моноцитов - 2,6±0,58 % и лимфоцитов - 51,9± 1,01 %.
На 25 и 37 дни после заражения наблюдалось уменьшение количества эритроцитов с 3,5±0,2 х1012/л (24,2 %), снижение концентрации гемоглобина до 47 % (45±0,9 г/л), увеличение числа лейкоцитов на 94,6 % (23,3±1,0 х109/л) по сравнению с аналогичными показателями у контрольных животных. У подопытных животных зарегистрированы лейкоцитоз и лимфоцитоз: палочкоядерные нейтрофилы - 3±0,6 %, сегментоядерные — 20,3±0,75 %, эозинофилы — 17,4±0,71 %, моноциты - 2,3±1Д7 %, лимфоциты 57±1,0 % (табл. 8).увеличилось - до 3±0,6 %, эозинофилов - 17,4±0,71 %, моноцитов - 2,3±1,17% и лимфоцитов - 57±1 %. Изменение гематологических показателей у щенков опытной группы является следствием патогенного, сенсибилизирующего воздействия личиночных и имагинальных форм токсокар.
Патологоанатомические и патоморфологические изменения в органах, тканях собак, экспериментально зараженных инвазионными яйцами Т. canisРис. 4. Эозинофильно-плазмоцитарные инфильтраты в легких собакипри экспериментальном токсокарозе (доза - 750 яиц Т. canis)
При патологоанатомическом исследовании легкие воздушные, неоднородно окрашены (бледно-розового или темно-красного цвета), гладкие, блестящие. Под плеврой - множественные кровоизлияния. На разрезе ткани легких сочные, кровенаполнены. У животных (доза заражения 450 и 750, яиц Т. canis) во всех долямх - множественные ограниченные, точечные очажки серого цвета до 1 -2 мм в диаметре с зоной гиперемии до 2-3 мм в диаметре (рис. 4, 5).
Печень несколько увеличена в объеме, с поверхности и на разрезе -пестрый мозаичный рисунок. Наряду с участками нормальной красно - бурой окраски имеются множественные очаги желтовато-белого цвета неправильной формы; среди них встречаются участки темно-красного цвета. Консистенция печени - дряблая. На разрезе - соскоб обильный.
В тонком отделе кишечника щенков обнаружено до 37 токсокар различного размера (рис. 6), слизистая оболочка гиперемирована, набухшая и рыхлая. Гиперемия неравномерная, очаговая. Складки кишечника утолщены, имеются диффузные кровоизлияния. На поверхности слизистой оболочки значительное количество густого экссудата. У щенков зараженных по 300 и 750 яиц Т. canis установлена инвагинация петель тонкого отдела кишечника
При гистологических исследованиях препаратов из легких, печени и тонкого кишечника установлены следующие патоморфологические изменения.
В отдельных участках легочной ткани выпажена пролиферация клеток соединительной ткани и утолщение межальвеолярных перегородок, капилляры в них кровенаполнены, диапедезы, инфильтрация эозинофилами и лимфоидными клетками. Вокруг сосудов - разрыхление соединительной ткани с эозинофилами между коллагеновыми волокнами и фибробластами. В ряде случае межальвеолярные перегородки разрушены. В местах локализации личинок токсокар - участки некроза с эозинофилами. Бронхи расширены их слизистая набухшая, складчатая (рис. 7). В просвете бронхов скопление погибших эпителиальных клеток и эритроцитов (рис. 8). Лимфоциты и плазматические клетки равномерно распределены по всей ткани легких, но максимальное их количество в перибронхиальной и периваскулярной ткани.
Обнаруженные в тканях легких изменения являются основанием для патоморфологического диагноза: гиперемия, гранулематозный альвеолит, эмфизема, периваскулиты и перибронхит.
Междольковые и центральные вены печени кровенаполнены. В некоторых дольках гепатоциты сдавлены, их цитоплазма гомогенная, интенсивно окрашена, ядра большей частью сохранены, иногда заметны их контуры. В некоторых участках ткани печени - скопления гистиоцитов, плазмоцитов с единичными эозинофилами среди них. Имеются отдельные клеточные гранулемы с преобладанием эозинофилов и некрозом в центре, возможно с личинками Т. canis. Вокруг некротических участков формируются соединительнотканные капсулы, содержащие фибробласты и гистиоциты (рис. 9). Отмечено небольшое количество эозинофильно -плазмоцитарных инфильтратов и лимфоэкстравазатов в междольковой соединительной ткани. Соединительнотканные перегородки незначительно утолщены.
Рис. 9 Некроз гепатоцитов в местах локализации личинок токсокар с полиморфноклеточным инфильтратом по периферии и формированием вокруг соединительнотканной капсулы из фибробластов и гистиоцитов
Иммунодиагностика токсокароза собак. Разработка иммунореагентов для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), латексагглютинации (РЛА) и использование их в диагностике токсокароза
В качестве антигенов для иммунодиагностических тестов тестов -реакций непрямой гемагглютинации и латексагглютинации апробированы экскреторно-секреторные и соматические компоненты личинок второй стадии Тохосага canis. Получение и культивирование яиц Тохосага canis а) Выделение яиц токсокар из фекалий собак Фекалии от спонтанно зараженных токсокарами собак измельчали, заливали водопроводной водой и отстаивали в течение суток. Такие манипуляции повторяли 8-9 раз до полной прозрачности осадка. Полученный осадок ресуспензировали в соответствующем объеме воды и центрифугировали в течение 30 минут при 2500 об./мин. для получения высокой концентрации яиц токсокар. После 3-4 кратного отмывания центрифугированием осадок отделяли и разводили в небольшом количестве физиологического раствора. Суспензию содержащую яйца Тохосага canis, смешивали в чашках Петри с песком, промытым и просушенным в сушильном шкафу, затем помещали на культивирование при комнатной температуре 23-25 С с периодическим увлажнением дистиллированной водой. Два раза в неделю проводили наблюдения за процессом формирования личинок в яйцах (микроскопические исследования). Личинки полностью формировались к 4-5 месяцу культивирования. Инвазионность яиц определяли по наличию чехлика на головном конце личинок, осторожно выдавленных из яиц. б) Получение яиц токсокар из маток половозрелых самок Матки половозрелых самок токсокар (2/3 конечного участка) измельчали в ступке при добавлении небольшого объема фосфатно-солевого буферного раствора, затем полученный гомогенат смешивали в чашке Петри с промытыми просушенными в термостате древесными опилками и оставляли при комнатной температуре (23-25С) с условием периодического увлажнения дистиллированной водой. Еженедельно проводили микроскопические исследования. Формирование личинок завершалось на 25-30 дни с начала культивирования. Получение личинок токсокар Субстраты, содержащие яйца Т. canis, помещали в марлевые мешочки, которые погружали на 2/3 в химические стаканы с фосфатно-солевым буферным раствором и инкубировали в термостате при 37-38С в течение 72 часов. Затем надосадочную жидкость аккуратно сливали в чистую посуду, осадок исследовали под микроскопом на наличие личинок токсокар. Последних в небольшом объеме фосфатно - солевого буферного раствора собирали и помещали в чистые флаконы, которые хранили при температуре -18С в морозильной камере. Надосадочную жидкость фильтровали с помощью воронки «Микропор» (0 15 мкм) центрифугировали при 7000 об./мин., отделяли от осадка, помещали в чистые флаконы и замораживали при -18С. Хранили до использования. Экскреторно-секреторный антиген личинок второй стадии T.canis Экскреторно-секреторные антигены T.canis получали после культивирования личинок второй стадии в фосфатно-солевом буферном растворе. Белок, растворенный в фосфатно-солевом буферном растворе рН = 7,2 - 7,4, выделяли методом высаливания с использованием насыщенного раствора сульфата аммония и с последующим диализом. Все манипуляции выполняли на холоде для предотвращения денатурации белка. Полученный после диализа и центрифугирования экскреторно-секреторный антиген личинок токсокар помещали в чистые флаконы и хранили в морозильной камере при -18С до использования. С помощью ФЭК определяли содержание белка в 1 мл раствора. В разных сериях антигенов концентрация белка (ЭСАг) варьировала от 70 до 95 мкг/мл. Получение соматического антигена из личинок второй стадии Т. canis Личинки токсокар измельчали в ступке с мелким стеклом, с добавлением фосфатно-солевого буферного раствора рН = 7,2-7,4. Полученный гомогенат центрифугировали в течение 30 минут при 7000 об/мин. Надосадочную жидкость отделяли и проводили выделение белковых компонентов насыщенным раствором сульфата аммония. Полученный соматический антиген личинок второй стадии Т. canis (САг) помещали в чистые флаконы и хранили при -18С до использования.
Получение антигена из кутикулы имагинальных форм токсокар Антиген из кутикулы половозрелых токсокар получали следующим образом: кутикулярный мешок отделяли, промывали изотоническим раствором хлорида натрия и измельчали в ступке с мелким стеклом при добавлении небольшого объема фосфатно-солевого буферного раствора рН=7,2-7,4. Затем гомогенат центрифугировали, надосадочную жидкость собирали, помещали во флаконы и хранили при -18.
Получение эритроцитарных антигенных диагностикумов для реакции непрямой гемагглютинации антигенов для реакции латексагглютинации и постановка серологических методов описаны в главе «Материалы и методы исследований». Материалом для экспериментальных исследований служили сыворотки крови щенков, зараженных токсокарами в экспериментальных и естественных условиях. Отрицательный и положительный контроля -соответствующие компоненты из набора «Тиаскар» для исследования на токсокароз в иммуноферментном анализе (производство НПО «Вектор-Бест» г. Новосибирск). Наиболее специфичными и активными антигенами токсокар оказались экскреторно-секреторные и соматические личиночные. Кутикулярный антиген, полученный из кутикулы половозрелых токсокар, показал неспецифические результаты в РНГА и РЛА (рис 19). Изучение специфичности полученных диагностических препаратов Тохосага cams в опытах с гетерологичными иммунными сыворотками против Ascaris suum и Toxascaris leonina показало положительные перекрестные результаты РЛА и РНГА в титрах 1:4 — 1:20 соответственно. Таким образом, диагностический титр при исследовании на токсокароз в РЛА составляет 1:10, а в РНГА-1:40. Результаты изучения активности экскреторно-секреторного (ЭСАг) и соматического (САг) антигенов токсокар представлены в таблицах 11, 12. Из таблиц следует, что экскреторно-секреторные и соматические личиночные антигены максимально активны в РНГА (разведения позитивного контроля Т. canis из набора «Тиаскар» 1:2560). В реакции латексагглютинации получен положительный результат в титре - 1:80. Параметры оценки результатов реакций непрямой гемагглютинации и латекс агглютинации приведены в главе «Материалы и методы исследований». При использовании сывороток крови зараженных токсокарами щенков в гомологичной системе установлены положительные результаты РЛА и РНГА с экскреторно-секреторным и соматическим антигенами личинок второй стадии Тохосага canis: реакция латексагглютинации - 1:40 и 1:20, реакция непрямой гемагглютинации 1:160 - 1:2560 и 1:80 - 1:640 соответственно. Максимальные уровни антител к Тохосага canis в сыворотках крови подопытных щенков (дозы заражения от 150 до 2500 яиц гельминтов) установлены на 25 и 37 дни инвазии. РЛА оказалась менее чувствительной, чем РНГА. В реакции непрямой гемагглютинации экскреторно-секреторный личиночный антиген Т. canis показал более высокие параметры специфичности и чувствительности по сравнению с соматическим антигеном. Изучение специфичности, чувствительности РНГА и РЛА при токсокарозе собак по принятой схеме позволило определить высокую диагностическую эффективность методов. Материалом для экспериментальных исследований служили сыворотки крови щенков, экспериментально и спонтанно зараженных токсокарами. При апробации также использованы положительные и отрицательные контрольные диагностические образцы из набора для ИФА «Тиаскар». На основании тестирования сывороток крови от 40 спонтанно и экспериментально зараженных Т. canis щенков, а также скрининга трех серий собственных диагностических препаратов установлена высокая специфичность и активность экскреторно-секреторных и соматических личиночных антигенов токсокар. Сохранение активности нативных антигенных препаратов из личинок Т. canis и эритроцитарных диагностикумов имеет большое значение в лабораторной практике. Материал для приготовления диагностикумов (первично обработанные, отмытые центрифугированием антигены)
