Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
Актуальность темы 5
2. Аналитический обзор литературы 10
2.1. Функциональная значимость микроорганизмов воздушной среды закрытых помещений и их влияние на иммунобиологический статус животных 10
2.2. Гиперчувствительность как одна из форм иммунного реагирования. Условия формирования гиперчувствительности по замедленному и немедленному типу 23
2.3. Оценка функциональной активности клеток, позволяющая выявить иммунологическую несостоятельность организма 31
3. Собственные исследования 43
3.1. Материалы и методы исследований 43
3.2. Результаты исследований
3.2.1. Бактериальная обсемененность воздушной среды закрытых помещений 56
3.2.2. Чувствительность животных к антигенам микроорганизмов различной таксономической принадлежности 64
3.2.3. Зависимость между гиперчувствительностью и естественной резистентностью организма 68
3.2.4. Совершенствование методики определения гиперчувствительности организма 77
4. Обсуждение результатов 80
4.1. Особенности реагирования животных на микробные антигены воздушной среды помещения 80
5. Выводы 87
6. Практические предложения 90
7. Список литературы 91
- Гиперчувствительность как одна из форм иммунного реагирования. Условия формирования гиперчувствительности по замедленному и немедленному типу
- Оценка функциональной активности клеток, позволяющая выявить иммунологическую несостоятельность организма
- Чувствительность животных к антигенам микроорганизмов различной таксономической принадлежности
- Особенности реагирования животных на микробные антигены воздушной среды помещения
Введение к работе
Актуальность темы. Наряду с загрязнением окружающей среды промышленными предприятиями, сточными водами городов и населенных пунктов мощными источниками загрязнения биосферы стали крупные животноводческие фермы, комплексы и птицефабрики (Рыбаков Ю.А., 1997; Вершняк Т.В., Кузнецова СВ., Самуйленко С.А. и др., 2004; Дементьев Е.П., Казадаев В.А., 2004; Денисов А.А., 2005; Avram N.. 1999; Hartung J., 1999; Hartung J., WathesCM...2001;OndrasovicOva0.,OndrasovicM. etal.,2005).
Практика работы животноводческих ферм и птицеводческих предприятий свидетельствует о том, что при высокой степени загрязненности территорий и воздушной среды ферм биологическими и органическими отходами невозможно добиться полной реализации продуктивного и генетического потенциала сельскохозяйственных животных и птицы (Гущин В.Н. и др., ] 999; Лопата Ф.Ф., 2007; Seedorf J., Hartung J., 2002).
Значительная концентрация поголовья на ограниченных площадях, отсутствие активного моциона и ультрафиолетового облучения, низкий уровень санитарной культуры, несвоевременная организация и проведение ветеринарно-санитарных, профилактических и противоэпизоотических мероприятий* ряде случаев способствуют формированию в воздушной среде популяции микроорганизмов, которые в результате многочисленных пассажей изменяют свои биологические свойства, В результате этого повышается их болезнетворное действие на животных, что обусловливает возникновение болезней в первую очередь у животных с ослабленной резистентностью (Мозжерин В.И., 2004; Петров А.М., 2004; Медведев А.П., Вербицкий АА., Грибанова MB., 2006).
Большое значение при этом имеет иммунобиологическое состояние организма животного и совершенство его адаптивных механизмов, обеспечивающих необходимую функциональную перестройку и оптимальный режим функционирования. В этой связи микроорганизмы (в том числе и сапрофитные) и продукты их жизнедеятельности при значительной их концентрации в воздушной среде помещений представляют угрозу для животных и обслуживающего персонала, индуцируя возникновение сенсибилизации и повышенной чувствительности. Гиперчувствительность, и реакции клеточного иммунитета могут обусловливать различные патологические процессы, которыми иногда сопровождаются микробные инфекции (Воронин Е.С., Петров A.M. и др., 2002; Хаитов Р.М., 2003; Воробьев АЛ., 2004; Москалев А.В., Сбойчаков В.Б., 2006).
В связи с этим особую остроту и актуальность приобретает проблема количественной и качественной оценки микробного фона воздушной среды закры-' тых помещений и его влияние на иммунобиологическое состояние организма.
Недооценка важности диагностики и коррекции нарушений функции иммунной системы может приводить к развитию иммунодефицитных состояний и обострению течения патологического процесса. Это обусловлено тем, что иммунная система наиболее чувствительна к воздействию различных неблагоприятных факторов (Федоров Ю.Н., Верховский О.А. и др., 1999; Смирнов B.C., Фрейдлин И.С., 2000; Воронин Е.С., Петров A.M. и др., 2002; Золотарева Н.А., 2002; Хаитов P.M., 2006).
Целью наших исследований явилась микробиологическая оценка воздушной среды закрытых помещений и определение чувствительности организма животного к микробным антигенам биологического аэрозоля. ,,, Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Определить количественный и качественный состав биологического аэрозоля в животноводческих помещениях. ,:,.(,,.
Разработать способ определения чувствительности животного к антигенам микроорганизмов различной таксономической принадлежности.
Провести оценку чувствительности лабораторных и сельскохозяйственных животных к воздушной микрофлоре, накапливающейся в помещении.
Научная новизна. Разработано устройство «Прибор для улавливания микроорганизмов» (Патент на полезную модель № 37097 РФ, МІЖ7 С 12 N 1/00) и способ определения чувствительности лошадей к антигенам микроорганизмов различной таксономической принадлежности (Решение Роспатента № 2008139718/15(051324) от 05.10.2009 о выдаче патента на изобретение по заявке от 06.10.2008). Впервые проведена оценка чувствительности лошадей к микробным антигенам воздушной среды помещения конюшни. Установлено, что микроорганизмы, независимо от их патогенности, а также продукты их жизнедеятельности, воздействуя на организм, вызывают иммунологическую перестройку с появлением особей, проявляющих гиперчувствительность к микробным антигенам.
Теоретическая и практическая значимость работы. Разработано, изготовлено и испытано устройство для улавливания микроорганизмов в воздушной среде. Устройство может использоваться для определения количественного и качественного состава микрофлоры воздушной среды помещений, а также при разработке санитарно-гигиенических требований и нормативов по бактериальной обсемененности воздуха помещений, в которых по условиям технологии требуется определенная степень чистоты, и при разработке мероприятий, направленных на своевременное обнаружение возбудителей болезней и оздоровление воздушной среды. Предложен способ определения чувствительности организма животного к микробным антигенам воздушной среды закрытых помещений, позволяющий выявлять особей с повышенной чувствительностью к антигенам микроорганизмов различных фюиологических групп. Способ может использоваться для диагностики сенсибилизации при заболеваниях, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами.
Реализация результатов исследований. Основные результаты научных исследований вошли в отчеты по научно-исследовательской работе ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» за 2004-2009 гг. Разработанный прибор для улавливания микроорганизмов экспонировался на IV Московском Международном салоне инноваций и инвестиций (2004), неделе высоких технологий (г. Санкт-Петербург, 2004), дне высоких технологий (г. Санкт-Петербург, 2005), Международной выставке-конгрессе «Высокие технологии. Инновации. Инвестиции» (г. Санкт-Петербург, 2007).
Материалы исследований внедрены в ученый процесс при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по курсам кафедры эпизоотологии и микробиологии ФГОУ ВПО «Ставропольский ГАУ»: «Ветеринарная микробиология и иммунология», «Санитарная микробиология», по дисциплине «Теоретические основы биотехнологии», в научно-исследовательской работе лаборатории визуальной диагностики и патологии молодняка ГНУ «Северо-Кавказский зрнадьный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской, академии сельскохозяйственных наук», в бактериологическом отделе ГУКК «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория», ГУРО «Ростовская областная ветеринарная лаборатория».,
Апррбация работы. Основные положения диссертации доложены, обсуждены, одобрены на научных конференциях: IV Международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды», посвященной 295-летию MJ3. Ломоносова, (Москва, 2006); 71-й ежегодной научной конференции молодых ученых и студентов (Ставрополь, 2007); ежегодной Международной научно-практической конференции «Состояние, перспективы, стратегия развития и научного,обеспечения овцеводства и козоводства РФ», (Ставрополь, 2007); IX Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития», (Саратов, 2009); XVII Московском Международном Ветеринарном Конгрессе (Москва, 2009).
Публикации. По теме диссертации опубликовано,Э.иаучных работ, в
том числе 2 из них в периодическом издании из перечня ведущих рецензи
руемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования
,и науки РФ. Получен патент на полезную модель «Прибор для улавливания
микроорганизмов», решение о выдаче патента на изобретение «Способ оп
ределения чувствительности лошадей к антигенам микроорганизмов различ
ной таксономической принадлежности», г.
Положения, выносимые на защиту:
Количественная и качественная оценка состава биологического аэрозоля возможна при использовании разработанного нами устройства, позволяющего осуществлять осаждение микроорганизмов в улавливающую жидкость конической емкости прибора и на бактериальный фильтр при выходе воздушного потока.
Микрофлора воздушной среды закрытых помещений при значительной ее концентрации представляет определенную опасность для животных, поскольку она индуцирует повышенную чувствительность организма (гиперчувствительность) и обусловливает..врзникновение иммунопатологических состояний (полиаллергий). ,,,
3. Способ определения чувствительности лошадей к антигенам микроор
ганизмов различной таксономической принадлежности позволяет про
водить тестирование животных через различные временные интерва
лы, дифференцированно выявлять особей, с повышенной чувствитель
ностью к нескольким антигенам. --<>,,
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 118 страницах, содержит введение, аналитический обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения; Иллюстрирована 14 таблицами и 13 рисунками. Список использованной литературы включает 224 источника, в том числе 37 иностранных.
Гиперчувствительность как одна из форм иммунного реагирования. Условия формирования гиперчувствительности по замедленному и немедленному типу
Микрофлора воздуха закрытых помещений существенно отличается и в количественном, и в качественном отношениях от атмосферного воздуха. Наличие значительного количества микроорганизмов в воздухе животноводческих помещений обусловлено, прежде всего, жизнедеятельностью животных (Дмитриев А. Ф., 1986; Каштанов А. В., 2003; Поздняк С. Б., Медвецкий Н. С, 2005; Никульшина Ю. Б., Багманов М. А. и др., 2005; Лопата Ф. Ф., 2007; Zucker В.-А., Muller W., 2002).
Бактериальная обсемененность воздуха зависит от типа помещения, вида и возраста животных, плотности их размещения, принятой технологии разведения и содержания, эффективности работы вентиляции и канализации в помещении, комплекса мероприятий, проводимых по оздоровлению внешней среды, и других факторов (Рыбаков Ю. А., 1997; Гущин В. Н. и др., 1999; Поляков Ю. А., Стеблева Ю. А., 2004; Верещагин Д., 2006; Avram N., 1999; Ribikauskas V., Vaicionis G., 2001, 2003; Kim K.-Y., Ко H.-J. et al., 2007).
Количественный и видовой состав микроорганизмов в воздухе помещений подвержен изменчивости (Федорова М. П., 2001; Морозов В. Ю., 2005; Высоцкий А. Э., 2006; Поташева Л. Г., 2006; Петков Г., 2005; Crook В. et al., 1991; Jacobson L., 1993; Kiekhaefer M. S., Donham K. J. et al, 1995; Mackie R. I. et al., 1998; Zucker B.-A. et al., 2000, 2002; Ribikauskas V., Vaicionis G., 2003; Purdy C. W. et al., 2004; Kim K.-Y., Ко H.-J. et al., 2005).
Большинство видов условно-патогенных микроорганизмов относят к возбудителям-сапронозов, так как они не проявляют специфичности к определенному хозяину, поражая широкий круг животных, и характеризуются эпизодическим паразитизмом (Литвин В. Ю., 1986; Шкиль Н. А., Шкиль Н. Н., Шадрина М. Н., 2003; Тихомирова Е. И., 2005). Известно, что возбудители сапронозов способны не только длительно обитать во внеорганизменнои среде - в воде, почве, воздухе, кормах, предметах ухода за животными, но и накапливаться в них. При этом объекты внешней среды становятся не только фактором передачи, но и источником инфекции. При определенных обстоятельствах условно-патогенные микроорганизмы могут иметь этиологическое значение в возникновении и развитии факторных и ассоциативных инфекционных болезней (Литвин В. Ю., 1986; Сомов Г. П., 1997; Шкиль Н. А., Шкиль Н. Н., Шадрина М. Н., 2003; Туйгунов М. М., Габидуллин 3. Г. и др., 2003; Вершняк Т. В., Кузнецова С. В., Самуйленко С. А. и др., 2004; Павлова И. Б., 2005; Петков Г., 2005; Высоцкий А. Э., 2006; Горковенко Н. Е., 2006; Медведев А. П., Вербицкий А. А., Грибанова М. В., 2006).
Массовая вакцинация животных, широкое использование химиопрепаратов, антибиотиков, применение гербицидов, инсектицидов, удобрений,- воздействие техногенных факторов приводит к нарушению биоценозов, увеличивая вероятность возникновения гетероморфизма микроорганизмов с проявлением L-трансформации и образованием L-форм в окружающей среде (Бухарин О. В., 1994; Толяронок Г. Е., Лях Ю. Г., 2003; Павлова И. В., 2005; Бойко О. В., Терентьев А. А., Николаев А. А. и др., 2006; Медведев А. П., Вербицкий А. А., Грибанова М. В., 2006).
Поэтому существенно изменилась не только структура инфекционных заболеваний, но и роль различных серогрупп и серовариантов микроорганизмов в их возникновении и развитии (Мавзютов А. Р., Фиалкина С. В., Бондаренко В. М., 2002; Поздняк С. Б., Медвецкий Н. С, 2005). В результате наблюдается тенденция ко все более широкому распространению болезней, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, значение которых в инфекционной патологии ранее рассматривалось как случайное явление (Сомов Г. П., 1997; Медведев А. П., Вербицкий А. А., Грибанова М. В., 2006).
Своеобразие патологических процессов, вызываемых условно-патогенными микробами, состоит в том, что один и тот же вид микроорганизмов может быть причиной поражения многих органов и в то же время одна и та же клиническая форма болезни (пневмония, артрит, нефрит, мастит) может быть обусловлена разными видами условно-патогенных бактерий. Клиническая картина таких болезней малоспецифична и в большей степени зависит не от свойств микробов и их вида, а от пораженного органа и выполняемых им функций (Медведев А. П., Вербицкий А. А., Грибанова М. В., 2006).
При оценке влияния биологических загрязнений воздушной среды на организм животного необходимо учитывать одновременно состояние показателей, характеризующих химический состав и физические свойства воздуха. Принцип многокомпонентности при этом является весьма важным, тем более что значительная контаминация воздуха микроорганизмами, как правило, сопряжена со значительным накоплением в нем вредных газов (1МНз H2S, С02) и других продуктов метаболизма (Верещагин Д., 2006; Петков Г., 2005; Avrarn N., 1999; Hartung J., 1999; Ribikauskas V., Vaicionis G., 2001, 2003; Kim K.-Y., Ко H.-J. et al., 2007).
Исследованиями академика В. С. Ярных и член-корреспондента Г. К. Волкова установлено, что в течение 1 часа вытяжной системой вентиляции свиноводческих помещений в комплексе с поголовьем от 10 до 40 тысяч свиней выбрасывается до 6,05 кг пыли, 14,4 кг аммиака и до 83,4 млрд. микроорганизмов. В комплексе на 2 тыс. коров выбрасывается за 1 час: аммиака - 4,8 кг, пыли - 0,75 кг, микроорганизмов - 8,7 млрд. Птицефабрика на 720 тыс. голов птицы выбрасывает в воздух в час углекислого газа 1490 м3, аммиака — 13,3 кг, пыли — 41,1 кг и микроорганизмов - до 174,8 млрд. (Дементьев Е. П., Казадаев В. А., 2004).
Исследованиями Е. П. Дементьева и А. А. Кузнецова установлено, что вытяжной системой вентиляции на 54 тыс. голов свиней выбрасывается во внешнюю среду за 1 час 12,4 кг пыли, 22,8 кг аммиака, 120 млрд. микроорганизмов и до 250 тыс/см тяжелых ионов. Специфический запах распространяется на расстояние 2-3 км (Дементьев Е. П., Казадаев В. А., 2004).
По данным А. Э. Высоцкого (2006), общая бактериальная обсемененность воздуха в секции для супоросных свиноматок до проведения дезинфекции и мойки составляла 11250,0-118300,0 КОЕ/м\ После мойки и аэрозольной дезинфекции общая бактериальная обсемененность воздуха снизилась до 1290,0-1890,0 KOE/MJ. Изменялся и качественный состав микрофлоры, так концентрация бактерий группы кишечной палочки и энтеробактерий колебалась в пределах 645,0-1250,0 КОЕ/м3, стафилококков 7240,0-7690,0 КОЕ/м , а после проведения дезинфекции количество БГКП и энтеробактерий уменьшилось в 10-20 раз, стафилококков и бактерий рода Bacillus - в 4 раза. В течение всего подсосного периода в секторе, где регулярно проводилась профилактическая аэрозольная дезинфекция, отмечалось отсутствие падежа поросят, в то время, когда в секции, где дезинфекция не проводилась за период подсоса пало 58 голов.
Оценка функциональной активности клеток, позволяющая выявить иммунологическую несостоятельность организма
К недостаткам рассматриваемого способа следует отнести субъективность при учете результатов реакции, плохую воспроизводимость и большую трудоемкость. Одним из существенных источников ошибок этого способа являются погрешности в приготовлении фиксированных мазков, качестве их окрашивания, а также сложность обеспечения точного подсчета поврежденных клеток до и после их инкубации (Беклемишев Н. Д., Суходоева Г. С, 1979).
Известен способ определения бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ), заключающийся в способности малых лимфоцитов периферической крови через 72-96 часов после первичного контакта с митогенами (фитогемагглютинин (ФГА), конканавалин А (КонА), митоген лаконоса (МЛ), бактериальные липополисахариды (ЛПС), антилимфоцитарная сыворотка, ферменты и др.) или после вторичного контакта с микробными и тканевыми антигенами превращаться в крупные недифференцированные клетки-бласты. Учет реакции проводят морфологическим (определением процента бластных клеток в мазке по отношению к числу сосчитанных лимфоцитов) или радиологическим методами (выявлением количества меченной тимидином ДНК в стимулированных клетках по увеличению числа импульсов в минуту в сцинтилляционном счетчике — индекс стимуляции) (Nowell Р., I960; Bach F., Hirschorn К., 1963; Перчикова Г. Е., Виноградов А. В. и др., 1968; Когосова Л. С, Чернушенко Е. Ф., 1970; Григорьева М. П., Копелян И. И., 1972; Сохин А. А., Чернушенко Е. Ф., 1984; Федоров Ю. Н., Верховский О. А., Слугин И. В., 2000; Москалев А. В., Сбойчаков В. Б., 2006; SU 1635141 С1, 15.03.91; RU 2263317 С2, 27.10.05; RU 2315315 С2, 20.01.08).
Известен способ определения торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) и макрофагов (РТММ), основанный на том, что сенсибилизированные лимфоциты под влиянием специфического антигена выделяют в окружающую среду растворимые медиаторы — ряд цитокинов (фактор торможения миграции макрофагов, ФНО-а, ИНФ-у) и хемокины, влияющие на миграцию гранулоцитов, лимфоцитов. Результаты реакции учитывают под микроскопом путем измерения высоты столбика миграции клеток (в мм) с поверхности клеточного осадка в питательную среду (George М., Vaughan J., 1962; David J., 1965, 1968; Rosenberg S., David J., 1970; Brown E. W., Burdash N. M. et al., 1978; Pinegin B. V., Olkov E. G. et al., 1993; Rodrhguez-Sosa M., Rosas L. E., David J.R. et al., 2003; Китаев M. И., 1978; Денисов В. H., 1981; Белая О. Ф., Черкасов В. Л. и др., 1996; Белая О. Ф., Герасимова И. Е., Малов В. А. и др., 2001; Симонова А. В., Латышева Т. В., Чирвон Е. А. и др., 2006; SU 1076090 А, 28.02.84; RU 2094805 С1, 27.10.97).
Приведенные выше способы диагностики повышенной чувствительности к различным антигенам (РБТЛ, РТМЛ, РТММ), а также реакция связывания комплемента (РСК) (SU 676277 А, 30.07.79), непрямой (пассивной) гемагглютинации (РПГА) (Boyden S. V., 1951; Gordon J. et al., 1958; Чернушенко E. Ф., Когосова Л. С, 1978; SU 1534401 Al, 07.01.90; RU 1640652 Al, 07.04.91; RU 2142807 CI, 20.12.99), альтерации лейкоцитов (Медуницин H. В., Гервазиева В. Б., 1967; Титова С. М., 1971; Китаев М. И., 1978; Воробьев А. А., Афанасьев С. С, Патрикеев Г. Т. и др., 1978; Сохин А. А., Чернушенко Е. Ф., 1984; Новиков Д. К., 1979, 1987; RU 2157537 С2, 10.10.00; RU 2007128465/13 А, 27.01.09), агломерации лейкоцитов (SU 1464088 А1, 07.03.89; RU 2280872 С2, 27.07.06; RU 2302634 С1, 10.07.07); восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) (Хамзин А. 3., 2003; Москалев А. В., Сбойчаков В. Б., 2006; RU 2156465 С1, 20.09.00), иммунофлюоресценции (Кубица Ю. Ф., 1967; Михайлов И. Ф., 1968; Егоров А. М., 1991; SU 1197640 А, 15.12.85; SU 1220176 А1, 28.02.94; RU 2061241 С1, 27.05.96; RU 2140085 С1, 20.10.99; RU 2222814 С1, 27.01.04; RU 2223498 С1, 10.02.04; RU 2295726 С2, 20.03.07; RU 2312353 С2, 10.12.07), хемилюминесцентного свечения нейтрофилов (Егоров А. М., 1991; Вознесенский Н. К., Манеркина Н. С, 2000; Митерева Д. Е., Агафонов В. Е., 2003; Грачева Т. А., Рудой Б. А., Рассанов В. П. и др., 2005, 2006; SU 1464089 А, 07.03.89; SU 1532875 А1, 30.12.89; SU 1569705 А1, 07.06.90; RU 2009505 С1, 15.03.94; RU 94024336 А1, 27.09.96; RU 2153673 С2, 27.07.00; RU 2289138 C2, 10.12.06; RU 2296334 C2, 27.03.07; RU 2324942 C2, 20.05.08) и другие при своей достаточно высокой информативности и специфичности обладают методической сложностью, технической трудоемкостью, необходимостью наличия специальных стандартных аллергенов и реактивов, сложных питательных сред и других компонентов, необходимостью стерильной работы и отсутствием стандартизированной технологии проведения исследований, длительностью учета реакции по времени.
Бурное развитие гибридомной технологии за последние десятилетия и создание огромного количества разнообразных моноклональных антител (МКА) было, есть и будет основной предпосылкой для развития перспективных и высокоспецифических методов диагностики аллергических состояний in vitro. Важную роль будет иметь интенсивно развивающееся направление многоцветной лазерной флюоцитометрии с определением одновременно большого количества биологических продуктов. Очевидны перспективы развития диагностики in vitro аллергических заболеваний на основе генетических и иммуногенетических исследований, которыми сегодня располагает наука. Большим достижением в последние годы было внедрение молекулярно-диагностических методов, таких как real time PCR и дот-блот анализ, в частности для определения аллельной специфичности данного локуса - HLA генотипа пациента (Кисленко В. Н., Колычев Н. М., 2007; Петрунов Б., 2008).
Чувствительность животных к антигенам микроорганизмов различной таксономической принадлежности
Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2004-2009 гг. на кафедре эпизоотологии и микробиологии Ставропольского государственного аграрного университета, в лабораториях обмена веществ, биохимии и иммуногенетики СНИИЖК, в Ставропольской межобластной ветеринарной лаборатории.
Объектами исследования были микроорганизмы воздушной среды помещений конноспортивной школы университета и вивария кафедры, представленные различными физиологическими группами {Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus, Escherichia, Proteus, Serratia, Bacillus), в том числе микроскопические грибы {Aspergillus, Penicillium, Candida, Mucor, Rhizopus, Cladosporium), лабораторные белые крысы линии «Wistar», спортивные лошади. В опыте использовались здоровые животные.
В исследовании было использовано 80 крыс обоего пола, 14 лошадей тракеннинской, ахалтекинской, буденновской и кабардинской пород.
В помещениях определяли общее количество микроорганизмов, содержащихся віл воздуха (КОЕ) и качественный состав микрофлоры.
Из наиболее представительных культур микроорганизмов воздушной среды по методам, изложенным в справочных руководствах Пастера Е. У., Овода В. В. и др. (1989), Воронина Е. С, Петрова А. М. и др. (2002), Ашурововой 3. Д. (2005), нами были приготовлены корпускулярные {Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Micrococcus luteus, Serratia marcescens) и водорастворимые {Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli) антигены, стандартизированные по стандартным образцам мутности ГНИИСиКМБП им. Л. А. Тарасевича с концентрацией 1-1,3 млрд. микробных клеток в 1 мл. Для сравнения использовали разведенные в 40 раз стандартные водорастворимые антигены {Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Candida albicans), полученные из Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии. Лабораторные крысы при достижении физиологической и половой зрелости (4 месяца) с массой самок 180-220 г, самцов 230-280 г по принципу аналогов были разделены на 4 группы: первые три — опытные, четвертая — контрольная.
Для определения чувствительности лабораторных животных к антигенам микроорганизмов, накапливающейся в помещении, провели аэрозольное воздействие водорастворимыми антигенами воздушной среды вивария на опытные группы животных в настольном портативном боксе. Так, 1 группу животных (п=20) подвергли воздействию микст антигеном {Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus), 2 группу (n=20) — Staphylococcus aureus, 3 группу (n=20) — Streptococcus faecalis, 4 группа (n=20), контрольная, воздействию не подвергалась. Распыление жидкого антигена в количестве 2 мл осуществляли при помощи металлического коаксиального распылителя, обеспечивавшего относительно равномерное дробление жидкости и перемещение аэрозоля в боксе. Размеры частиц создаваемого аэрозоля относились к среднедисперсным, не превышали 4-6 мкм. Экспозиция воздействия на животных опытных групп была равна 30 мин.
Состояние гиперчувствительности организма крыс к микробным антигенам воздушной среды вивария определяли до и на 30, 60 и 90-й дни после воздействия путем постановки реакции лейкоцитолиза (Сохин А. А., Чернушенко Е. Ф., 1984) в нашей модификации.
Чувствительность организма лошадей к антигенам микрофлоры воздуха помещения конноспортивной школы проводили в период с марта по апрель двукратно с интервалом в 2 недели путем постановки реакции лейкоцитолиза -с использованием корпускулярных, водорастворимых и стандартных антигенов.
Состояние факторов неспецифической защиты и иммунного статуса лабораторных животных и лошадей оценивали по показателям: бактерицидной и лизоцимной активности сыворотки крови, содержанию белка и его фракций, морфологическому составу крови, фагоцитарной активности и интенсивности нейтрофилов, количеству Т- и В-лимфоцитов, концентрации циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), общего Ig Е в сыворотке крови. Микробиологическая оценка воздушной среды закрытых помещений
Концентрацию микроорганизмов в воздухе закрытых помещений определяли с помощью разработанного нами прибора для улавливания микроорганизмов (RU 37097 U1, 10.04.04) и методических рекомендаций «Исследование микробной обсемененности воздуха животноводческих помещений» (Дмитриев А. Ф., Морозов В. Ю. Ставрополь: Агрус, 2005. 28 с). Принцип индикации основан на улавливании микроорганизмов в емкость с улавливающей жидкостью, отделении аэрозольных частиц от газовой фазы и последующей концентрации их в улавливающей жидкости либо на поверхности фильтра (рис. 1-6). В приборе создается замкнутая для микроорганизмов, но воздухопроводная камера.
Прибор для улавливания микроорганизмов состоит из емкости 1 (рис. 1), выполненной в виде цилиндра, переходящего в конус, в нижней части которого находится улавливающая жидкость 2, а в верхней части под сеткой 3 устанавливается фильтр 4, и с помощью уплотнительного резинового кольца 5 прижимается крышкой 6. В средней части циклона имеется жиклер 7, расположенный под острым углом к его вертикальной оси (например, под углом 45), причем ось жиклера 7 в горизонтальной плоскости А не пересекает ось симметрии и расположена касательно его вертикальной оси, с дополнительной насадкой 8, выполненной в виде конуса снабженного фильтром 9, который устанавливается с помощью уплотнительного резинового кольца 10 и прижимается крышкой 11, причем дополнительная насадка 8 с фильтром 9 установлены перед жиклером 7.
Особенности реагирования животных на микробные антигены воздушной среды помещения
Одним из индикаторов состояния иммунного статуса организма и развития аутоиммунных процессов является уровень циркулирующих иммунных комплексов в крови. Известно (Овсепян М. Р. И др., 2004), что длительная циркуляция в организме ЦИК даже при незначительном повышении их уровня приводит к формированию их отложений в тканях, повышенной агрегации и адгезии тромбоцитов, что в свою очередь приводит к нарушению микроциркуляции крови и закупорке сосудов, повреждению и некрозу тканей. Согласно полученным данным, средние значения концентрации ЦИК в сыворотке крови лабораторных животных всех опытных групп в течение всего времени наблюдения после антигенного воздействия имели достоверное увеличение по сравнению с контролем, а к 60-му дню отмечено максимальное их значение и превышение уровня контрольной группы животных в 2,8-3,4 раза (р 0,001). Поскольку формирование ЦИК является обязательным компонентом нормального иммунного ответа, то данное обстоятельство, как можно предположить, с одной стороны, является свидетельством повышенной антигенной нагрузки на иммунную систему животных опытных групп, подвергшихся сенсибилизации микробными антигенами, а с другой - говорит об активации иммунокомпетентной системы. Достоверные различия концентрации специфического Ig Е у опытных групп лабораторных животных по сравнению с контрольной отмечались на протяжении всего периода исследования, что свидетельствовало об активации гуморальной системы иммунитета, поскольку иммуноглобулины этого изотипа участвуют в сенсибилизации клеток слизистых оболочек, в частности носовой полости, бронхов и конъюнктивы при проникновении генетически чужеродных субстанций, в качестве которых в нашем случае выступали микробные антигены при аэрогенно индуцированной сенсибилизации (Хаитов Р. М. и др., 1995; Новиков Д. К., 2005; Воробьев А. А. и др., 2006).
Повышение концентрации Ig Е в сыворотке крови крыс контрольной группы в течение исследования (фоновое значение составило 0,40±0,06 МЕ/мл, к концу наблюдения - 0,65±0,17 МЕ/мл) позволяет полагать, что Ig Е-ответ является постоянно функционирующей системой организма, которая активизируется в ходе индивидуального развития (Воробьев А. А. и др., 2006; Хаитов Р. М., 2006).
Установленная тенденция повышения концентрации специфического Ig Е в сыворотке крови лошадей при гиперчувствительности к одному (378,80±64,40 МЕ/мл), двум (586,52 МЕ/мл), трем и более (507,79±32,15 МЕ/мл) микробным антигенам по сравнению с низкочувствительными особями (294,66±41,12 МЕ/мл) свидетельствовала об активной секреции плазматическими клетками Ig Е-антител в ответ на антигенный стимул микроорганизмов, накапливающихся в значительном количестве в закрытом помещении.
Отсутствие различия по показателям морфологического состава крови, белковой картины сыворотки крови, естественной резистентности лошадей в зависимости от проявляемой чувствительности к антигенам микроорганизмов воздушной среды помещения можно объяснить небольшим количеством исследуемых животных (выборки), высоким уровнем обменных процессов и неспецифической резистентности организма спортивных лошадей, находящихся в постоянном тренинге, индивидуальными особенностями особей.
Неспецифическая резистентности организма лабораторных крыс опытных групп после сенсибилизации характеризовалась активацией своих показателей, так на 30-й день отмечено увеличение в 2 раза бактерицидной активности сыворотки крови, фагоцитарной активности и интенсивности нейтрофилов, в то же время угнетение лизоцимной активности сыворотки крови, которая к окончанию исследования приближалась к значению контрольной группы. Повышение бактерицидной активности сыворотки крови крыс контрольной группы в течение всего периода исследования, по нашему мнению, также свидетельствовало об активации факторов неспецифической защиты у интактных животных на действие накапливающихся микроорганизмов в воздухе вивария. Волнообразный характер изменения фагоцитарной активности нейтрофилов крови у крыс опытных групп в динамике можно объяснить особенностями реакции крыс на изменение условий внешней среды и общую бактериальную обсемененность помещения.
Отмеченная тенденция снижения абсолютного количества Т-супрессоров у крыс всех групп свидетельствовала об ответной реакции иммунной системы организма на индуцированное и естественное воздействие микроорганизмов воздушной среды вивария. К 60-му дню после сенсибилизации у крыс опытных групп отмечалась активация В-клеточного звена иммунитета (абсолютное содержание В-лимфоцитов у крыс, сенсибилизированных микст антигеном, составило 2,77±0,32хЮ9/л, у крыс сенсибилизированных антигеном Staphylococcus aureus — 2,29±0,34хЮ9/л и у крыс третьей опытной группы, сенсибилизированных антигеном Streptococcus faecalis - 2Д9±0,27хЮ9/л, в то время как у крыс контрольной группы - 1,96±0,ЗбхЮ9/л), что сопровождалось усилением продукции антител и иммунных комплексов, принимающих участие в элиминации экзогенных антигенов.
Изменения гематологических показателей у сенсибилизированных крыс позволяют сделать заключение о наличии лейкоцитоза со сдвигом влево, аллергениндуцированном изменении соотношения базофилов, эозинофилов, палочкоядерных и сегментоядерных форм нейтрофилов и моноцитов.
Таким образом, лейкоцитолиз, индуцированный специфическим комплексом антиген-антитело у животных, сенсибилизированных к микробным антигенам воздушной среды, характеризовался значительным увеличением процента гибели клеток. Данное наблюдение согласуется с мнением большинства авторов о том, что воздействие иммунных комплексов на лейкоциты сенсибилизированных животных приводит к существенному изменению их функциональной активности (Воробьев А. А. и др., 1978; Чернушенко Е. Ф. и др., 1978; Фрадкин В. А., 1985; Новиков Д. К., 2005). Этот феномен проявлялся усилением реакции лейкоцитолиза, увеличением уровня общего Ig Е и циркулирующих иммунных комплексов.
Иммунологические механизмы такого влияния антигенов на функциональную активность иммунокомпетентных клеток связаны, прежде всего, с неспецифическими факторами, действующими на разных уровнях развития иммунного ответа. Способность вспомогательных клеток (макрофагов, дендритных клеток и др.) фагоцитировать (пиноцитировать) антигены и расщеплять их до фрагментов, узнаваемых лимфоцитами, влияет на силу иммунного ответа (Хаитов Р. М., 2006).
Сравнительный анализ выявил высокую положительную корреляционную связь показателя лейкоцитолиза с концентрацией Ig Е в сыворотке крови как у лабораторных крыс, так и у спортивных лошадей, причем коррелятивные связи показателя лейкоцитолиза и специфического Ig Е с показателями естественной резистентности, белковой и лейкоцитарной картины крови, иммунного статуса идентичны, что подтверждает отрицательную роль сенсибилизации микробными антигенами воздушной среды на иммунобиологический статус организма животных и возможность использования реакции лейкоцитолиза для диагностики повышенной
![Комплексная гигиеническая оценка ионизации воздушной среды закрытых помещений [Электронный ресурс]](/i/i/4503/200199.png "Комплексная гигиеническая оценка ионизации воздушной среды закрытых помещений [Электронный ресурс] Гуськов Андрей Сергеевич")
