Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Биологические и морфологические особенности эхинококка 12
1.2. Антигенный состав эхинококка 13
1.3. Иммодиагностика ларвального гидатидоза 16
1.4. Особенности строения генома эхинококка 22
1.5. Использование методов молекулярной биологии для оптимизации экспрессии клонированных генов 25
1.5.1. Амплификация генов в составе рекомбинантных плазмид 25
1.5.2. Конструирование "генов гибридных белков" как метод оптимизации трансляции 28
1.5.3. Стабилизация мРНК чужеродного гена 29
1.5.4. Стабилизация чужеродных белков в E.coli 30
1.5.5. Применение методов генной инженерии в гельминтологии 34
1.5.6. Генно-инженерные антигены в диагностике и вакцинопрофилактике цистных гидатидозов 35
2.Собственные исследования... 39
2.1. Материалы 39
2.2. Используемые реактивы 40
2.3. Методы исследований 40
2.3.1. Выделение геномной ДНК Е.granulosus из протосколексов паразита 40
2.3.2. Выделение ДНК векторного бактериофага Xgtll 41
2.3.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции 42
2.3.4. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле..44
2.3.5. Получение препаративных количеств ДНК векторной плазмиды 44
2.3.6. Проведение ДНК-ДНК гибридизации 46
2.3.7. Амплификация гомологичных фрагментов из генома эхинококка синтезированными олигонуклеотидньши праймерами , 46
2.3.8. Лигирование плазмидной векторной ДНК с фрагментом эукариотического гена 47
2.3.9. Проведение реакции трансформации 47
2.3.10. Скрининг рекомбинантных клонов 48
2.3.11. Экспрессия гибридного белка рекомбинантной плазмидой 49
2.3.12. Электрофорез в денатурирующих условиях 49
2.3.13. Электроперенос 52
2.3.14. Постановка иммуноферментной реакции 53
2.3.15. Иммунное выявление антигенов на фильтре 54
2.3.16. Изучение протективных свойств рекомбинантного антигена EgF 55
3. Результаты исследований 57
3.1. Наработка препаративных количеств ДНК Echinococcus granulosus для создания банка генов паразита 57
3.1.1.Создание и амплификация библиотеки Е.granulosus в фаге Xgtll 57
3.1.2. Элюция фрагмента кДНК эхинококка из геля легкоплавкой агарозы.. 61
3.1.3. Клонирование фрагмента гена Е. granulosus EgF в векторной системе фаг-клетки E.coliY-1088, Y-1090 65
3.1.4. Проведение ДНК-ДНК гибридизации 66
3.1.5. Особенности экспрессии рекомбинантых белков в векторной системе Xgtll/EgF-iaieTKHExoliY1089 69
3.1.6. Анализ рекомбинантных белков, синтезированных в векторной системе клетки E.coli штамма Y 1089-рекомбинантныйфагЯзШ/Р 69
3.1.7. Иммунологический анализ рекомбинантных белков, получаемых в векторной системе на основе рекомбинантного фага Xgtll/EgF методом Western-blot анализа 72
3.1.8. Синтез генно-инженерных белков в векторной системе на основе рекомбинантного фага Xgt 11 /EgF 72
3.1.9. Переклонирование фрагмента кДНК эхинококка в плазмидные векторные системы 74
3.1.10. Определение нуклеотидной и аминокислотной последовательности клонированного фрагмента EgF 78
3.1.11. Конструирование рекомбинантных плазмид EgF с использованием векторов семейства pGEX и pQE 81
3.1.12. Векторы семейства pGEX 82
3.1.13. Клонирование фрагмента гена EgF E.granulosus в плазмидной векторной системе pQE/SQ 13009 83
3.1.14. Использование ПЦР при получении фрагментов генов, кодирующих антигены эхинококка для оптимизации создания плазмидных векторных систем 86
3.1.15. Создание продуцента рекомбинантных белков в векторной системе плазмида pQE - клетки Е. coli SQ-13009 87
3.1.16. Протективная эффективность рекомбинантного антигена EgF 100
Обсуждение полученных результатов 103
Выводы .117
Практические предложения 119
Список литературы 120
Приложение 135
- Иммодиагностика ларвального гидатидоза
- Выделение геномной ДНК Е.granulosus из протосколексов паразита
- Электрофорез в денатурирующих условиях
- Особенности экспрессии рекомбинантых белков в векторной системе Xgtll/EgF-iaieTKHExoliY1089
Введение к работе
Актуальность проблемы. Эхинококкоз распространен повсеместно, является серьёзной медицинской, социально-экономической и ветеринарной проблемой (Бессонов А.С., 1979; Геллер Ю.И.,1989), в связи с чем в настоящее время во многих странах мира ведутся интенсивные исследования ларвальных гидатидозов (Fasihi Н.М., Hobbs R.P., Adams P.J., Mobedi I., Morgan-Ryan U.M./Thompson R.C.A., 2002; Deplazes P., Eckert J.,1996).
Прижизненная диагностика эхинококкозов основывается на
эпизотологических данных и результатах иммунологических реакций со
специфическим антигеном (Heath D.D., 1986; Irabiena О., Nieto A., Ferreira
J,,2000), однако применение последних ограничено отсутствием доступного
и стандартного антигенного материала, обладающего высокой
специфичностью и чувствительностью в серологических реакциях (Ito A.L et
al, 1999; Jiang L.,Wen H., Ito A., 2001). Данным требованиям может отвечать
антиген, кодируемый определённым геном в системе, в которой его можно
наработать и очистить, т.е. антиген, получаемый генно-инженерным путём
in vitro в требуемых количествах (Li J. et al., 2003). Практически ежегодно
ВОЗ организует Международные рабочие встречи паразитологов,
посвященные проблемам распространения, диагностики,
вакцинопрофилактики и лечения ларвальных гидатидозов, причём особое внимание уделяется развитию молекулярно-биологических методов исследования эхинококкозов (Gottstein В., 1987). Во многих странах мира проводятся работы по клонированию генов гельминтов в различных векторных системах, в том числе и эхинококка (Lightowlers М. et al., 1990). Основной целью этих исследований является создание рекомбинантных ДНК, кодирующих гибридные белки-антигены» являющиеся основой для производства генно-инженерных вакцин и диагностикумов (Mamuti W., Yamasaki Н., Sako Y. et al, 2004).
Глобальное значение ларвальных гидатидозов, их большое влияние на экономику и здоровье населения различных стран мира неоднократно подчеркивалось в докладах Всемирной Организации Здравоохранения, на регулярно проходящих Международных конгрессах по гидатидологии. В последнее десятилетие важное место в работе этих симпозиумов занимают молекулярно-биологические аспекты изучения ларвальных гидатидозов, создания генно-инженерных вакцин и диагностикумов для профилактики и прижизненной иммунодиагностики этих опасных гельминтозов (Rishi А.К., McManus D.P., 1987; Gauci С, Merli М., Muller V., Chow С, Yagi К., Mackenstedt U, Lightowlers M.W., 2002; Woollard D. J., Gauci C, Merli M., Muller V., Chow C, Yagi K., Mackenstedt U, Lightowlers M.W., 2002; Gonzalez-Sapienza G., Lorenzo C, Nieto A., 2000).
В последние годы в России отмечается рост заболеваемости людей и
животных ларвальными гидатидозами, что связано с резко возрастающими
миграционными процессами, массовым и бесконтрольным завозом
продуктов из южных регионов. В связи с этим, изыскание
биотехнологических способов получения неограниченных количеств
стандартного и высокоэффективного антигенного материала,
обеспечивающего результативность проведения прижизненной
иммунодиагностики и вакцинопрофилактики эхинококкоза, является насущной необходимостью как в научном, так и в практическом плане (Бережко В.К., 1990).
Использование методов молекулярной биологии, в частности технологий рекомбинантных ДНК, позволяет решить эту задачу путем клонирования генов, кодирующих основные антигены эхинококка и экспрессии их in vitro с целью получения стандартных высокоспецифичных белков-антигенов. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) значительно ускоряет процесс клонирования генов или их фрагментов в
оптимальных векторных системах и получения белков-антигенов E.granulosus.
Цели и задачи исследования. Основной целью настоящих исследований было получение рекомбинантных антигенов эхинококка, обладающих высокими диагностическими и протективными свойствами.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- создать представительный банк образцов суммарной ДНК
E.granulosus и E.multilocularis;
- получить клонотеку генов к ДНК эхинококка в экспрессирующей
фаговом векторе и осуществить её иммунологический скрининг;
выявить молекулярно-биологическими методами (ДНК-ДНК гибридизацией, реакцией рестрикции эндонуклеазами, электрофорезом в агарозном геле) наличие вставки кДНК эхинококка у рекомбинантных клонов;
подобрать оптимальную плазмидную векторную систему для экспрессии генов паразита, наработать препаративные количества плазмидной ДНК и фрагмента кДНК эхинококка;
на основе лианеризованной ДНК векторной плазмиды и фрагмента кДНК паразита создать генно-инженерную конструкцию;
создать продуцент гибридного белка паразита в экспрессирующей векторной системе рекомбинантная плазмида-клетки E.coli.
- повысить эффективность клонирования за счёт применения
полимеразной цепной реакции (ПНР), определить структуру
олигонуклеотидных праймеров, гомологичных фрагменту уникального гена
EgF E.granulosus и установить оптимальные условия проведения ПЦР;
- наработать в экспрессирующей векторной системе гибридный белок в
препаративных количествах и очистить рекомбинантный антиген EgF;
- дать характеристику иммунохимических свойств рекомбинантного
антигена;
- оценить диагностические и протективные свойства наработанного
рекомбинантного антигена.
Исследования проведены по программе фундаментальных и прикладных исследований по научному обеспечению АПК РФ, а также по Федеральной целевой НТП Минпромнауки России «Исследования и разработка по приоритетным направлениям развития науки и техники» (проект «Технологии биоконструирования препаратов для ветеринарии», № гос. регистрации 01.20.02 14534).
Научная новизна. Впервые в России клонирован фрагмент гена
паразита, кодирующий синтез родоспецифического антигена Echinococcus,
определены нуклеотидная и аминокислотная последовательности EgF и
изучены свойства рекомбинантного белка. Уникальность полученной
нуклеотидной последовательности подтверждена патентом РФ. Рассчитана
структура специфических олигонуклеотидных праймеров, отработаны
оптимальные условия проведения ПЦР для получения неограниченного
количества встройки кДНК эхинококка EgF. Создан продуцент гибридного
белка паразита в экспрессирующей векторной системе рекомбинантная
плазмида pQE/EgF-клетки Е.соН SG-13009. На основе полученного
стандартизированного рекомбинантного антигена разработан
иммунноферментный диагностикум для прижизненной диагностики ларвальных гидатидозов, обладающий достаточно высокой специфичностью и чувствительностью. Показана высокая протективная эффективность антигена EgF при ларвальном эхинококкозе в опытах на лабораторных животных.
Практическая ценность работы. По результатам исследований по теме диссертации подготовлены и утверждены следующие нормативные документы:
1. Технологический регламент на выявление генома E.granulosus в
реакции dot-гибридизации с использованием специфического
радиоактивномеченного ДНК-зонда. Утвержден 5 февраля 1996 г. Ученым
советом ВИГИС, протокол № 9.
Лабораторный регламент на получение рекомбинантных белков для иммунодиагностики цистного гидатидоза. Одобрен Ученым советом ВИГИС 27 октября 2000 г., протокол № 40.
Лабораторный регламент на модифицированный способ получения рекомбинантного белка F для иммунодиагностики цистного гидатидоза. Одобрен секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН 25 мая 2001 года, опубликован в 38 томе (Труды ВИГИС).
Лабораторный регламент на модифицированный способ получения рекомбинантного белка EgB. Утверждён Ученым советом ВИГИС 6 июля 2003 г., протокол №14.
5. Патент на изобретение «Способ получения рекомбинантного
антигена F E.granulosus» № 2234533, зарегистрирован в Государственном
реестре изобретений РФ 20.08.2004 г.
Апробация результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на;
- научных конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 1993, 2001, 2003-2005 гг.);
объединённых сессиях Координационного совещания по
ветеринарной паразитологии Центрального совета Общества гельминтологов РАН и секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (1993-2005 гг.);
- заседаниях Ученого совета ВИГИС 1991-2005 гг.
Основные положения, выносимые на защиту:
создание представительного банка геномной ДИК Е. granulosus и Е. multilocularis;
получение клонотеки генов кДНК эхинококка в экспрессирующем векторе Igtl 1 и иммунологический скрининг рекомбинантных клонов;
- идентификация нуклеотидной встройки кДНК эхинококка в
полученных генно-инженерных конструкциях методами молекулярной
биологии (ДНК-ДНК гибридизации, рестрикции эндонуклеазами,
электрофорезом в агарозном и полиакриламидном гелях,
иммуноблоттингом);
создание продуцента гибридного белка EgF в экспрессиругощей векторной системе рекомбинантная плазмида pQE/EgF клетки E.coli SG13009;
поэтапный скрининг рекомбинантных клонов с использованием селективных сред, цветового теста и электрофореза в агарозном геле продуктов рестрикции ДНК эндонуклеазами;
оптимизация клонирования паразитарных генов за счёт применения ПНР, разработка структуры олигонуклеотидных праймеров и условий проведения этой реакции;
получение и иммунохимическая характеристика рекомбинантного белка эхинококка;
диагностические и протективные свойства рекомбинантного антигена EgF.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 работ.
Объём и структура работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.
Список литературы включает 165 источников, в том числе 36 отечественных и 129 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 19 рисунками.
Иммодиагностика ларвального гидатидоза
Методы иммунодифузии и иммунопреципитации обладают достаточной чувствительностью при диагностике эхинококкоза. Но из-за того, что они не основываются на демонстрации определенного преципитата (яйца, arc 5), они низкоспецифичны (Лейкина Е.С. и др.,1987).
Тест агглютинации латекса (LAT) также достаточно чувствителен, но часто даёт ложноположительные результаты.
Тест непрямой агглютинации достаточно чувствителен, но малопригоден из-за возникающих технических сложностей по фиксации антигенов на поверхности эритроцитов.
Наиболее приемлемым является тест ELISA. Однако специфичность этого теста зависит от качества очистки антигена. Кроме того, известные в настоящее время антигены Е. granulosus часто дают перекрестную реакцию с другими паразитами.
Диагноз эхинококкоза основывается на данных эпидемиологического анамнеза, результатах инструментальных исследований и серологических реакций со специфическим антигеном (РЛА - реакция латекс-агглютинации, РИГА - реакция непрямой агглютинации, ИФА - иммуноферментный анализ). Все-таки наиболее чувствительными и специфическими способами диагностики эхинококкоза можно считать иммунологические реакции, однако их применение ограничено отсутствием доступного постоянного источника высокоспецифичного и стандартного антигенного материала.
Неоднозначность иммунологических реакций при эхинококкозе обусловлена и тем, что антигены, получаемые различными методами и от разных животных и человека, варьируют по своим свойствам. Поэтому необходимо получить такие антигены, которые обладали бы не только высокой специфичностью, но и иммунологической стабильностью. Данным условиям может отвечать антиген, кодируемый одним (или несколькими) определенным геном в системе, в которой его можно наработать и очистить, т.е. антиген, полученный генно-инженерным способом. Этот путь сложен, однако, учитывая потенциал современных методов биотехнологии, вполне осуществим.
Прижизненная диагностика ларвального эхинококкоза, основанная на применении иммунологических реакций, остается одной из актуальных задач современной гельминтологии, несмотря на успехи, достигнутые как в плане получения высоко очищенных антигенов паразита, так и в применении новых эффективных иммунотестов (ELISA, dot-ELISA, иммуноблот и др.).
Эхинококкозы у людей лидируют по выработке действительно высокого уровня специфических антител у зараженных индивидуумов, что позволяет успешно проводить диагностику инвазии. Не все зараженные пациенты реагируют положительно в тестах по обнаружению специфических антител, и имеет место перекрестная реактивность между препаратами антигенов эхинококка и антителами из сыворотки крови от пациентов с другими инвазиями. Перекрестная реактивность - это основная проблема в дифференциальной диагностике между инвазиями, вызванными E.granulosus, E.multilocularis, T.solium (Craig P. S., Rogan M. Т., Allan J. C, 1996).
Трудности в широком применении серодиагностики имеют место при ограничении наличия антигенов паразита для тестов и качественный контроль за препаратами антигенов, полученных от разных групп гидатидных цист. Чувствительность, специфичность и наличие антигенов -наиболее важны для исследований и усовершенствования тестов для диагностики эхинококкоза человека. Методы, основанные на обнаружении антигенов паразита, которые циркулируют в крови пациента, зараженного E.granulosus, используются для диагностики, соотношения отрицательных результатов в других серологических тестах.
В производстве антигенов для иммунодиагностики используют технику рекомбинантных ДНК, которая потенциально улучшает специфичность, чувствительность диагнозов и, тем самым, облегчает проблемы, связанные с качественным контролем антигенов, полученных, в основном, из цист. Библиотека к-ДНК была приготовлена из м-РНК протосколексов E.granulosus и помещена в фаг, который клонировали и получали антигены, используемые в диагностике, которые были идентифицированы с сыворотками пациентов с диагнозами "цистный гидатиоз". Два клона показали высокую чувствительность для диагностики на планшетах в иммунном анализе с сыворотками пациентов.. Один из этих клонов был протестирован в ELISA. Другие клонированные антигены также проверяли в ELISA для улучшения чувствительности теста. Эти антигены не проявляли перекрестной реактивности с сыворотками пациентов с протозойными болезнями, нематодозами и трематодозами, но они проявляли перекрестную реактивность с сыворотками пациентов,зараженных E.multilocularis и T.solium. Эти клоны были происследованы для выявления возможного присутствия в них множества эпитопов, некоторые из которых могут представлять специфичность E.granulosus (Fakon В., Chamekh М., Dissous С, Carpon А., 1991).
Иммунохимические анализы и аффинная хроматография антител не идентифицировали антигены специфичные для E.granulosus, Gottstein с коллегами идентифицировал антигены, специфичные для E.multilocularis. Кроличьи антитела против E.granulosus использовались с родственным антигеном E.multilocularis, названным Ет2, который имеет высокую специфичность для различия сывороток пациентов, зараженных E.granulosus и E.multilocularis. Специфический компонент Em2a был очищен и выделена молекула с молекулярной массой 54,000, pi 4,8. Сыворотки от 50 человек, зараженных E.granulosus и 32 человек, зараженных E.multilocularis, были протестированы, и только три пробы E.granulosus были неправильно определены. Сыворотка крови от 120 доноров из эндемичного по E.multilocularis района Швейцарии были происследованы в ELISA с Ет2, из них 5 дали положительный результат, один из которых был с подтвержденным диагнозом "эхинококкоз" (Gottstein В., Eckert J., Fey EL, 1983).
ELISA со стабилизированным белком дает диагностическую специфичность 99%, а чувствительность 90%; перекрестная реактивность обнаруживается в одном случае из 108 сывороток при E.granulosus и два из 15 сывороток с T.solium (Gottstein В., Eckert J., Michael S.A., Thompson R.C.A., 1987).
Выделение геномной ДНК Е.granulosus из протосколексов паразита
К 50 мкг отмытых в физиологическом растворе и гомогенизированных в ступке с жидким азотом протосколексов эхинококка добавляли 10 мл лизирующего буфера следующего состава: 100 мМ трис-HCl, рН 7,4; 100 mM NaCl; 50 тМ ЭДТА. Суспендировали на шейкере 2-3 минуты, после чего вносили додецилсульфат натрия до конечной концентрации 1% и протеиназу К в количестве 1 мг на 1 мл буферного раствора.
Инкубацию проводили при 37С в течение 1-3 часов или при 56С -1час. Депротеинизацию нуклеиновых кислот проводили стандартным фенол-хлороформовым методом (Маниатис Т.,1984) вплоть до исчезновения интерфазы.
Освобожденную от протеинов ДНК осаждали 3 объемами этилового спирта, инкубировали при - 20С 15 минут и центрифугировали 10 минут при 7000 об/мин. Полученный осадок последовательно отмывали в 70, 80 и 96 %-ном этаноле, центрифугируя после каждого этапа по 5 минут при 10000 об/мин.
Осадок ДНК лиофилизировали и растворяли в ТЕ-буфере, содержащем 10 мМ ТРИС-НС1 (рН 7,4) и 1 мМ ЭДТА.
Последующее 40-минутное центрифугирование при 17000 об/мин позволяло осадить остатки протеинов и полисахаридов. Чистый супернатант переносили в новую пробирку и осаждали 3 объемами этанола. Полученный осадок тщательно высушивали, растворяли в деионизированной воде и сохраняли при +4С . 2.3.2. Выделение ДНК векторного бактериофага Xgtll.
Для получения требуемых для клонирования препаративных количеств ДНК фага использовали метод полного лизиса на чашках Петри, В качестве штамма-хозяина использовали клетки E.coli Y 1088. Одиночную колонию клеток переносили в пробирку с LB-средой (15мл), инкубировали в течение ночи на ротационной качалке при интенсивном встряхивании (250-300об/мин) при 37С. Полученную ночную культуру использовали для засева колб Эрленмейера, заполненных на 1А средой Лурия-Бертрани с добавлением ионов магния до концентрации ЮмМ и мальтозы до 0,2%. Колбы инкубировали 3-4 часа при интенсивном встряхивании при температуре 37оС до достижения оптической плотности при Д=600 0,5ед. Клетки осаждают центрифугированием при 3000об\мин в течение 10 минут. Осадок ресуспендируют в ЮмМ р-ре MgS04 и инкубируют ещё 1 час при 37С при интенсивном встряхивании. Приготовленные таким образом клетки при хранении при 4 С сохраняют свою жизнеспособность в течение недели.
Готовили серии десятикратных разведений стоковых препаратов фагов Л-gtl 1 (стандартная методика, Маниатис Т., 1984). В стерильных пенициллиновых флаконах смешивали по 100 мкл каждого разведения с равным объёмом ресуспендированных клеток штамма-хозяина, инкубировали при 37С в термостате в течение 15 минут, добавляли 3 мл расплавленного и охлаждённого до 43 С верхнего агара (0.6%). 2.3.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.
Эти ферменты особенно часто используются в генной инженерии, поскольку расщепляют ДНК по строго определённым олигонуклеотидным последовательностям, в результате чего образуются характерные наборы фрагментов в эквимолярных количествах. За единицу активности принято количество фермента, способное за 1 час в оптимальных для него условиях полностью гидролизовать 1 мкг ДНК. Большинство рестриктаз хорошо расщепляют двунитевую ДНК, предпочтительно релаксированной или лианеризованной формы в соответствующем буфере, рекомендованном фирмой-производителем конкретного фермента. В данной работе использовался универсальный способ приготовления 10-кратных буферных смесей для всех 3-х типов используемых рестриктаз (табл.1).
Реакции рестрикции проводили в конечном объёме 20 мкл, в зависимости от используемого в каждом конкретном случае фермента подбирали соответствующий тип буфера и добавляли его в количестве 2 мкл. ДНК добавляли в количестве 0,5 мкг, растворяя её в бидистиллированоой воде, эндонуклеазу вносили с соотвествием с рекомендациями фирмы-производителя, исходя из указанной активности. Инкубацию реакционной смеси проводили при 37С в течение 1-3 часов (в зависимости от используемого фермента). Реакцию останавливали добавлением 0,5М ЭДТА до конечной концентрации ЮмМ или быстрым замораживанием. Результат реакции оценивали электрофоретически, заранее добавляя к аликвоте рестриктов 2-3 мкл смеси красителей: 0,25% бромфенолового синего и 0,25% ксиленцианола в 30% глицерине. 2.3.4. Электрофоретическое разделение фрагментов ДЬЖ в агарозном геле.
Этот метод с успехом используется для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. Окрашивание флуоресцирующим и интеркалирующим в ДНК красителем — бромистым этидием в низкой концентрации позволяет визуализировать в ультрафиолетовом свете положение фрагментов нуклеиновых кислот, их нативность, определять примерную концентрацию в препарате.
В стандартный трис-ацетатный буфер добавляют порошок агарозы до концентрации 0,8-1,3% по объёму и нагревают при постоянном перемешивании в водяной бане до полного растворения агарозы. Смесь охлаждают до 40-45С, добавляют бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и заливают в прибор для электрофореза, сразу же вставляют гребёнку для формирования лунок. Полимеризация геля длится 20-40 минут, после чего необходимо внести такое количество трис-ацетатного буфера, чтобы он полностью покрыл весь гель и заполнил обе камеры. Затем гребёнку вынимают, в образовавшиеся лунки вносят образцы ДНК с красителем. При анализе простого набора молекул ДНК в 0,5 см лунку вносят 0,2-0,5 мкг нуклеинового материала. Электрофорез проводят при постоянном наряжении 80-100 вольт в течение 4-6 часов. 2.3.5. Получение препаративных количеств ДНК векторной плазмиды.
Засевали 5 мл среды LB в пробирке отдельной колонией бактерий, содержащей плазмиду. Инкубировали 30 минут при 37С и добавляли антибиотик ампициллин (50-70 мг/мл). Далее ночную культуру инкубировали при той же температуре при интенсивном встряхивании в течение 16 часов. Бактериальные клетки собирали после центрифугирования при 4000 об/мин в течение 10 минут, надосадочную жидкость удаляли, полученный осадок бактерий ресуспендировали в 2 мл охлажденного раствора, содержащего 50мМ глюкозы, 25мМ трис-HCl (рН 8,0), 10 мМ ЭДТА и 5 мг/мл лизоцима. Время инкубации при 20С составляло 5 минут. Затем в пробирки добавляли 4 мл раствора, содержащего 1% SDS и 0,2 Н NaOH, ставили на 10 минут в лед, суспензию периодически перемешивали. Не вынимая пробирки из ледяной бани, добавляли 3 мл холодного раствора 5М ацетата калия, перемешивали содержимое на вортексе, после чего инкубировали при 0 С в течение 10 минут.
Полученную смесь центрифугировали в роторе Becman JS-I3 при 13000 об/мин в течение 30 минут. Бактериальная ДНК и обломки клеток на дне пробирки образовывали плотный осадок, надосадочная жидкость, содержащая плазмидную ДНК, оставалась полностью прозрачной. Ее переносили в чистые пробирки и добавляли по 0,6 объема изопропанола, инкубируя при комнатной температуре не менее 20 минут. Плазмидную ДНК осаждали центрифугированием при 13000 g при комнатной температуре в течение 30 минут. Полученный осадок подсушивали под вакуумом, несколько раз промывали 70%-ным и 1 раз 96%-ным этанолом, спирт тщательно сливали, а осадок помещали в термостат при 56С до полного высыхания. Сухой осадок растворяли в 200 мкл деионизованной воды. Очистку плазмидной ДНК осуществляли ЮМ раствором хлористого лития, добавляя равный объем в каждую пробирку. Инкубация во льду длилась не менее 20 минут, центрифугирование при 1200 об/мин-10 минут. Супернатант, содержащий плазмидную ДНК, с помощью водоструйного насоса переносили в чистые пробирки и добавляли по 1 мл 96%-ного этанола, инкубировали 15 минут при —20С, после чего центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 минут. Чистоту полученного препарата оценивали электрофорезом в 1% агарозном геле.
Электрофорез в денатурирующих условиях
В данной работе использовали прибор для вертикального элекрофореза в мини-гелях Mini Protean, производства фирмы BioRad. Размер стекол прибора равен 72 х 1000 мм, толщина геля 0,75 мм. Электрофорез в денатурирующих условиях проводили по методу Laemmli (1970). Приготовление гелей.
Для приготовления разделяющих гелей исходные растворы смешивали в следующих пропорциях (табл.2).
Приготовленный раствор разделяющего геля разливали по пластинкам и наслаивали поверх раствора немного разбавленного раствора ДДС-Na. Гель полимеризовался в течение 30 мин. при комнатной температуре. О завершении полимеризации судили по появлению резкой границы между гелем и разбавленным раствором ДДС-Na, который наслаивали сверху. По окончании полимеризации акрил амида раствор ДЦС-Na удаляли, после этого заливали концентрирующий гель.Электродный буфер.
В состав электродного буфера входили 0,025 М Трис-HCl, рН 8,3; 0,192 М глицин; 0Д% ДДС-Na.Приготовление проб.
При приготовлении проб для электрофореза смешивали 3 объема раствора белка с одним объемом 4-кратного буфера для приготовления проб. Буфер для приготовления проб содержал 62,5 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 2,5% ДДС-Na; 12% сахарозу; 1% ДДТ. Перед электрофорезом пробу белка инкубировали при 56С в течение 15 мин и добавляли бромфеноловый синий.
Проведение электрофореза.После внесения проб в лунки, на прибор подавали ток с силой 10 мА и напряжением около 35 В. После того, как пробы входили в гель, ток увеличивали до 30 мА и 100 В. Электрофорез продолжался около 50-60 мин. После того, как краска выходила из геля в нижний буфер, форез останавливали, гель вынимали из прибора, фиксировали и окрашивали.Фиксация и окрашивание гелей после электрофореза.
После завершения электрофореза гель для фиксации помещали на 20-30 мин в 12,5%-ный раствор ТХУ, после чего заливали его на ночь раствором, содержащем 0,25% Кумасси R-250, 25% изопропанола и 10% уксусной кислоты. После окрашивания гель обесцвечивали 7%-ной уксусной кислотой, нагревая несколько часов на огне. 2.3.13. Электроперенос.
Белковые продукты разделяли с помощью денатурирующего электрофореза в 12%-ном разделяющем геле. По окончании электрофореза гель помещали на 2-3 мин в дистиллированную воду.
Электроперенос проводили по методу Тоубина (Towbin et al, 1979) с модификациями (Kyhse - Andersen, 1984). Использовали нитроцеллюлозные фильтры (Schleicher- Schuell, Германия) с диаметром пор 0,2 мкм. Перенос осуществляли в камере для полусухого переноса. При этом контакт «сендвича» из геля и нитроцеллюлозы с пластинчатыми графитовыми электродами обеспечивается за счет прокладок из фильтровальной бумаги, смоченных в соответствующих буферах. Использовали три разных буфера:фильтровальной бумаги, смоченных в буфере 1, а потом б листов, смоченных в буфере 2. Поверх такой стопки последовательно укладывали нитроцеллюлозный фильтр (который предварительно погружали в воду на 1 мин.) и 6 листов фильтровальной бумаги, смоченных в буфере 3. На всех этапах укладки «сэндвича» следили, чтобы не было пузырей воздуха между самими бумажными прокладками, между бумажными прокладками и нитроцеллюлозным фильтром, между фильтром и гелем. Такой «сэндвич» плотно прижимали сверху верхней пластиной прибора (катод). Электроперенос проводили при комнатной температуре сначала при 60В (при этом, сила тока падала с 280 мА до 140 мА) в течение 30 мин., и затем в течение 1,5 ч при 120 В.
По окончании переноса, «сэндвич» вынимали из камеры и осторожно разбирали. Для определения набора белков в препарате и оценки полноты их переноса на нитроцеллюлозную мембрану, часть фильтра отрезали и окрашивали Кумасси бриллиантовым синим, а затем отмывали смесью метанол/уксусная кислота/вода (5:1:5). Оставшуюся часть фильтра использовали для иммунного окрашивания. 2.3.14. Постановка иммуноферментной реакции.
Планшеты сенсибилизировали антигенами из расчета 0,5 мкг на лунку. Непосредственно перед нанесением готовили раствор антигенов в КБК 0,05 М из расчёта 5 мкг/мл, после чего в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл раствора и инкубировали 18 ч в холодильнике при 4С.
После инкубации раствор выливали из лунок планшета одним резким движением и трижды промывали планшет, внося в лунки по 100 мкл дистиллированной воды с 0,05% Твин-20 на 5 минут. По окончании промывки планшеты просушивали с помощью фильтровальной бумаги.
Исследуемые и контрольные сыворотки разводили 0,1 М ФСБ с добавлением 0,05% БСА и 0,05% Твин-20 в соотношении 1:100. Разведенные сыворотки вносили по 100 мкл в каждую лунку планшета и инкубировали 30 мин при температуре 37С. По окончании инкубации растворы выливали из лунок планшета одним резким движением, после чего планшет трижды промывали, внося в лунки по 100 мкл дистиллированной воды с 0,05% Твин-20 на 5 минут. Оставшийся отмывочный раствор удаляли энергичным встряхиванием и просушивали с помощью фильтровальной бумаги.
Для разведения коньюгата, содержимое ампулы растворяли в 200 мкл 0,1 М ФСБ. Этот концентрированный раствор хранили при -20С. Непосредственно перед использованием коньюгата, его разводили до рабочего титра (1:12 000), разбавляя концентрированный раствор 0,1 М ФСБ с добавлением 0,05% Твин-20 и 0,5% БСА.
Особенности экспрессии рекомбинантых белков в векторной системе Xgtll/EgF-iaieTKHExoliY1089
Для анализа гибридных белков, синтезированных рекомбинантнымифагами Xgtll/EgF, были проведены денатурирующие электрофорезы в 12%полиакриламидном геле. Контролем служили белки, синтезированные темиже клетками E.coli, но зараженные обычными фагами Xgtll безклонированных вставок кДНК эхинококка. В зараженных рекомбинантными фагами клетках синтезируется небольшое количество белка, поэтому его сложно обнаружить на фоне тотальных белков клеточного лизата E.coli. Однако проведенный градиентный денатурирующий электрофорез в ПААГе (с концентрацией от 4 до 12,5%) показал, что белки клеточных лизатов имеют достаточно гетерогенное распределение в геле, основная масса белка обнаруживается в области 70-200 кДа (рис.7).
Для сравнения в лунки геля № 3 были нанесены тотальные белки клеток E.coli, лизогенизированных обычным фагом gtll, а в лунку №2 -сконцентрированные ГГЭГ-8000 тотальные белки цистной жидкости Е. granulosus. Индукцию синтеза рекомбинантного белка в клетках кишечной палочки проводили изопропилтиогалактозидом (IPTG), эти пробы нанесены в лунки № 5,6,7. В качестве контрольной пробы в лунку № 4 были нанесены тотальные белки этого же штамма клеток, лизогенизированного обычным, "диким", фагом, также предварительно индуцированным IPTG, При анализе пептидных полос на геле у клеток подвергшихся индукции четко видны полосы, соответствующие В-галоктозидазе, размером 1 ІбкДа. Кроме того, на фоне большинства совпадающих по подвижности, количеству, и интенсивности окрашивания белковых полос в индуцированных IPTG рекомбинантных лизатах заметны дополнительные полосы размером 131 кДа. К сожалению, количество рекомбинантного белка оказалось значительно меньше ожидаемого и составляло менее 0,5% от тотальных белков (см. рис. 5 , треки 5-7). Исходя из структуры клонов, рекомбинантные белки представляют собой гибридные молекулы, состоящие из В-галоктозидазы и эхинококк-специфического пептида, находящегося на С-конце химерной белковой молекулы. Размер пептида определяется размером и структурой вставки ДНК в рекомбинантном фаге (т.е. равен 16,7 кДа) плюс 116 кДа, приходящихся на В-галоктозидазу. На электорофореграмме можно видеть соответствие теоретического предсказания на основании известного kD—
Для доказательства того, что в клетках E.coli Y-1089, инфицированныхрекомбинантными фагами, все-таки происходит синтез эхинококк-специфических пептидов, был осуществлен перенос (блоттинг) белков клеточных лизатов с ПААГ гелей на нитроцеллюлозные фильтры, которые затем окрашивали с помощью антител как к р-галактозидазы, так и сыворотками больных эхинококкозом людей.
На рис.8 показаны результаты электроферетического распределения белков E.coli,зараженных векторным и рекомбинантным бактериофагами.
Результаты иммунологического анализа полученных белков иммуноблоттингом показали, что антителами против эхинококка окрашивается протеины молекулярной массой около 131 кДа, соответствующие рекомбинантному фагу EgF. Это свидетельствует о том, что в клетках E.coli, заражённых рекомбинантными фагами, происходит синтез рекомбинантного белка в виде слитого объединённого продукта, состоящего из р-галактозидазы (116 кДа) и пептида эхинококка (16,7 кДа).
На основании этого можно судить о высокой чувствительности метода, поскольку детектируются даже микроколичества рекомбинантного белка, присутствующего в одной пептидной полосе. Данный эксперимент доказывает, что зараженные рекомбинантным фагом клетки E.coli способны продуцировать белки-антигены эхинококка, хотя и в небольших количествах.
Вставки кДНК E.granulosus EgF клонированны в фаг kgtll по сайту расщепления EcoRI, расположенного внутри гена LacZ на расстоянии пары нуклеотидов от терминирующего код она {3-галактозидазы. Вследствие такого расположения фрагмента EgF ДНК паразита в рекомбинантном фаге клонированная последовательность экспрессировалась в виде полипептида, включенного в состав фрагмента р-галактозидазы, что позволяло ожидать значимый уровень экспрессии чужеродной последовательности. Предполагалось, что стабильность экспрессии будет обуславливаться тем, что участок внутри гена, куда встраивалась чужеродная ДНК, расположен вблизи С-концевой области р-галактозидазы. Немаловажное значение для сохранения гибридного белка имел выбор клеток-хозяев (генно-инженерного штамма E.coli Y-1089), который может нарабатывать белки, чувствительные к Lon-протеазе (именно она обеспечивает деградацию чужеродных белков). Кроме того, этот штамм имеет генетическую мутацию (hflA 150), увеличивающую частоту лизогенизации. Но, к сожалению, теоретические предположения не получили своего подтверждения в экспериментах. На практике пришлось постоянно сталкиваться с явлением отрицательных реверсий у рекомбинантных фагов, из-за чего не представлялось возможным наработать препаративные количества белка-антигена эхинококка.
В дальнейшей работе с экспессирующей векторной системой рекомбинантный фаг gtll/EgF - клетки E.coli Y-1089 возникло много трудностей. Во-первых, фактическая экспрессия рекомбинантного пептида составляла менее 0,5% от тотальных белков, в то время как согласно литературным данным, могла бы составлять от 5 до 7%. Во-вторых, огромную проблему представляла реверсия рекомбинантных фагов со встройкой к ДНК E.granulosus, Фактически через 2-3 поколения большинство фагов возвращалось к исходному, "дикому" типу. Сохранять рекомбинантов путем пересевов и перезаражений клеток-хозяев стало невозможно, поскольку трудно было предугадать, какой клон ревертировал к "дикому" типу, а какой еще имеет встройку кДНК эхинококка. В связи с этим вся клонотека рекомбинантных фагов EgF сохранялась в виде векторной ДНК, а не живых фагов. Для заражения клеток Е.соІІ и получения гибридных лизатов каждый раз приходилось "упаковывать" фаговую ДНК в белковые оболочки, что обуславливало большие затраты средств и рабочего времени (рекомбинантную фаговую ДНК "упаковывали" in vitro, синтезируя белковые оболочки фага с помощью упаковочных экстрактов фирмы Amersham).
Проводился подбор перспективных плазмидных векторных систем для переклонирования встройки кДНК эхинококка из рекомбинантного фага Xgtl 1 с целью обеспечения экспрессии достаточного количества гибридного белка. Анализ зарубежной литературы по экспрессии паразитарных генов показал, что плазмиды семейства pMAL снабжены системой для экспрессии и наработке белка клонированного гена в открытой рамке считывания. Вставка чужеродного гена входит в ген mal Е, который кодирует мальтозосвязанный белок ММР. Таким образом, в результате экспрессии получается ММР-слитый белок. Сильный промотор tac является инициатором трансляции гена MAL Е, что даёт высокий уровень экспрессии клонированного отрезка. Благодаря этому в дальнейшем возможна одноступенчатая очистка гибридного белка с использованием сродства ММР к мальтозе. Клонируемая последовательность Е.granulosus встраивается в сайтах между сплавленными генами MAL Е и LAC-Z, что существенно облегчает проведение скрининга рекомбинантных клонов бактерии-хозяина (клетки E.coli штаммов JM-109 или ТВ-1) за счет наличия белых и голубых колоний. В отсутствие индуктора IPTG продукт гена lac-Z не экспрессируется, т.к. эти векторы несут репрессор LAC, который регулирует работу гена lac-Z. Векторы семейства pMAL сконструированы таким образом, что несут последовательность на 5 конце полилинкера, являющуюся сайтом для специфической протеазы фактора "Ха", белка, получаемого из яда афганской гадюки. Для эксперимента фактор "Ха" удобен тем, что после успешного клонирования чужеродного гена и получения гибридного белка, сплавленного с продуктом гена lac-Z, можно легко расщепить 4 аминокислоты, освободив химерный белок от большого отрезка гена В-галактозидазы размером 70 кДа.
В ходе эксперимента было получено 700 мкг рекомбинантной ДНК фага X.gtl 1 EgF. Полученная ДНК была разделена на аликвоты, рестрицирована ферментом EcoRl, из неё методом препаративного электрофореза в геле легкоплавкой агарозы выделен фрагмент ДНК эхинококка EgF размером 453 н.п, В результате применения усовершенствованного метода электроэлюции (см. ст. Одоевской И.М., 1994г.) было наработано 24 мкг очищенной вставки Eg F, пригодной для дальнейшего клонирования. Исходная векторная плазмида pMAL R1 была любезно предоставлена сотрудниками Института биологии гена АН СССР Луканидиным Е.М. и Шустером А.А. Плазмидная ДНК, амплифицированная в клетках E.coli JM-109, выделялась методом щелочного лизиса, после очистки её количество (при Дощ бО) составило 1 Юмкг. Векторная молекула подверглась реакции рестрикции по сайту EcoRl, концы лианеризованной плазмиды для снижения вероятности замыкания в кольцо были дефосфорилированы. Подготовленные таким образом плазмидный вектор и фрагмент кДНК эхинококка сшивались in vitro ферментом ДНК-лигазой в течение 14 часов при температуре 8С в конечном объёме реакционной смеси 75 мкл.
Схема конструирования гибридной плазмиды pMAL с фрагментом гена эхинококка EgF представлена на рис.9.
Эффективность лигирования оценивалась по результатам трансформации компетентных клеток, в этом опыте она составила 10б. К сожалению, полученные рекомбинантные клоны отличались от "диких" не только цветом колоний, но и пониженной жизнеспособностью, слабым ростом, видоизменённой морфологией клеток штамма-хозяина. Получать
