Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Краткая общая характеристика антигельминтиков, производных бензимидазолкарбаматов 8
1.2. Эмбриотоксическое и тератогенное действие антигельминтиков из группы бензимидазолкарбаматов 9
1.3. Пути и способы модификации эмбриотоксического и тератогенного действия соединений из различных химических классов 20
1.4. Сведения об антигельминтных свойствах бензимидазолкарбаматов 24
1.5. Краткая информация о протипопаразитных препаратах из группы авермектинов 33
2. Собственные исследования 38
2.1. Материалы и методы 38
2.1.1. Схемы тератологических экспериментов. Скрининг производных авермектинов с целью предупреждения эмбриотоксического и тератогенного действия БМК 40
Опыты по оценке препарата БМК плюс на эмбрио токсическое и тератогенное действие 41
2.1.2. Методы приготовления композиций на основе БМК и аверсектина Сі 43
2.1.3. Схемы экспериментов по оценке токсических свойств и фармакокинетики препарата БМК плюс 43
Изучение острой токсичности 43
Изучение фармакокинетики БМК и его метаболита при введении крысам суспензии БМК и препарата БМК плюс 44
Схемы опытов по изучению цитогенетического действия препарата БМК плюс 45
Опыт по оценке подострой токсичности препарата БМК плюс
2.1.4. Опыт по оценке антигельминтной эффективности препарата БМК плюс 47
2.1.5. Статистическая обработка данных 48
2.2. Результаты исследований 48
2.2.1. Скрининг авермектинов, снимающих эмбриотокси-ческое и тератогенное действие БМК 48
2.2.2. Приготовление комбинированного препарата на основе БМК и авермектинов 57
2.2.3. Токсикологическая характеристика и фармако-кинетика препарата БМК плюс 62
Острая токсичность БМК плюс на крысах и мышах 62
Развернутая оценка БМК плюс на эмбриотоксическое и тератогенное действие на крысах 67
Особенности фармакокинетики и биотрансформации БМК у крыс при самостоятельном введении и в составе комбинированного препарата БМК плюс 75
Метод анализа БМК и его основного метаболита 5-ОН-БМК 76
Исследование фармакокинетики БМК при различных формах его введения 82
Влияние БМК и препарата БМК плюс на митоз клеток костного мозга у крыс и мышей 89
Подострая токсичность препарата БМК плюс 105
2.4. Антигельминтная эффективность препарата БМК плюс на овцах 133
3. Обсуждение 136
4. Выводы 145
5. Практические предложения 147
6. Список литературы
- Эмбриотоксическое и тератогенное действие антигельминтиков из группы бензимидазолкарбаматов
- Сведения об антигельминтных свойствах бензимидазолкарбаматов
- Изучение фармакокинетики БМК и его метаболита при введении крысам суспензии БМК и препарата БМК плюс
- Особенности фармакокинетики и биотрансформации БМК у крыс при самостоятельном введении и в составе комбинированного препарата БМК плюс
Введение к работе
Актуальность темы. Антигельминтики производные бензимидазолкарбаматов, несмотря на долголетнюю историю своего применения, продолжают занимать достойное место в ассортименте современных лекарственных средств. Причина заключается в высокой нематодоцидной эффективности соединений этого химического класса, а также в определенной активности против цестод и фасциол. Усовершенствование бензимидазолкарбаматов сводится, главным образом, не к синтезу новых производных, а к созданию разнообразных лекарственных форм, комбинированных препаратов и систем доставки.
БМК (метиловый эфир 2-бензимидазолилкарбаминовой кислоты) является не только ярким представителем данной химической группы, но и в определенной степени ее исходным соединением. Препарат и в настоящее время продолжают применять в качестве фунгицида. Хорошо известны его высокие антигельминтные свойства.
Как и большинство других бензимидазолкарбаматов, БМК оказывает выраженное эмбриотоксическое и тератогенное действие на многих лабораторных и сельскохозяйственных животных. В свое время в ВИГИСе имело место целое научное направление, целью которого была попытка модифицировать, точнее, отменить его эмбриотропное действие с сохранением антигельминтной эффективности. Для этой цели использовались многие эндогенные соединения, соли металлов и бензимидазолы (Скира В.Н., 1986; Оробец В.А., 1989; Новик Т.С., 1992). Практическим выходом этого научного поиска было создание препарата кубен, который нарабатывался и выпускался опытно-производственным отделом ВИГИС.
К настоящему времени возникли новые возможности создания антигельминтика на основе БМК без указанного побочного эффекта. Благодаря предварительным данным (Мосин В.А., Новик Т.С. и др., 1999) стало реальным получить комбинацию БМК и авермектинов, не обладающую эмбриотропным действием, получившую название препарат БМК плюс.
Цель и задачи исследований. В связи с вышеизложенным основной целью нашей работы было получение и детальная токсикологическая характеристика препарата на основе БМК и авермектинов.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи:
провести отбор авермектинов, наиболее эффективно снимающих эмбриотоксическое и тератогенное действие БМК;
отработать способ получения препарата БМК плюс на основе БМК и авермектинов, показавших наилучшие результаты в скрининге, в лабораторных условиях;
оценить токсические свойства препарата;
изучить особенности фармакокинетики препарата;
испытать его антигельминтные свойства.
Научная новизна. Получены новые данные по феномену отмены эмбриотоксического и тератогенного действия БМК под действием авермектинов; выдвинута и экспериментально обоснована гипотеза механизма данного эффекта. Определены авермектины, обеспечивающие наиболее оптимальное «снятие» побочного эффекта БМК, а также композиции с рациональным соотношением входящих в их состав компонентов. Установлены особенности фармакокинетики БМК и его влияния на митоз клеток костного мозга крыс и мышей при совместном введении с аверсектином С1. Оценены токсикологические параметры острого и подострого действия БМК плюс; выявлены высокие антигельминтные свойства препарата.
Практическая значимость работы. На основе исследований по отмене эмбриотропного действия БМК создан комбинированный препарат БМК плюс, имеющий реальную перспективу применения в ветеринарной практике. Способ приготовления препарата можно применить к другим производным бензимидазолкарбаматов и авермектинов. Апробирован и адаптирован «Метод анализа БМК и его метаболита 5-гидрокси-БМК в плазме крови на основе ВЭЖХ с УФ-детектированием» (одобрен секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол № 1 от 22 марта 2012 г.).
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на отчетных научных конференциях ВИГИС (2009-2011); на научно-практических конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями животных» (г. Москва, 2010; 2011 гг.).
Личный вклад соискателя. Представленная диссертационная работа является результатом трехлетних научных исследований автора. Исследования по созданию, оценке токсических свойств и антигельминтной эффективности препарата БМК плюс проведены аспирантом самостоятельно под руководством доктора биологических наук, профессора Новик Т.С., которая оказывала научно-методическую помощь в проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Статьи, написанные в соавторстве, включают не менее 80% материалов исследований аспиранта. Соавторы не возражают в использовании результатов совместных исследований (справки предоставлены в диссертационный совет).
Основные положения, выносимые на защиту:
скрининг производных авермектинов в отношении предупреждения эмбриотоксического и тератогенного действия БМК;
приготовление препарата БМК плюс;
токсикологическая характеристика БМК плюс;
особенности фармакокинетики и антимитотического действия БМК при совместном введении с аверсектином С1;
антигельминтная эффективность БМК плюс при нематодозах и цестодозах овец.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 научные статьи, в которых изложены основные положения и выводы по работе, 2 из них в рекомендованном ВАК РФ издании.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 168 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, включающего материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. В список литературы входят 80 отечественных и 166 иностранных источников. Работа иллюстрирована 41 таблицей и 90 рисунками.
Представлен анализ литературных данных по общей характеристике, токсическим и антигельминтным свойствам препаратов, относящихся к бензимидазолкарбаматам и авермектинам. Кроме того, приведена подборка данных по опыту снятия эмбриотоксичекого и тератогенного действия соединений различных химических классов, включая бензимидазолкарбаматы.
Эмбриотоксическое и тератогенное действие антигельминтиков из группы бензимидазолкарбаматов
В 1970 году из сообщения O Brien J.J следует, что введение парбендазола овцематкам в дозе 60 мг/кг на 17 день суягности вызывало уменьшение плодовитости, а у 29% ягнят наблюдалось слияние тел грудных, поясничных и крестцовых позвонков. Введение препарата в дозе 30 мг/кг и выше на 12 день суягности приводило к повышенной гибели молодняка по сравнению с контролем. Однако при применении этого же препарата, но в терапевтической дозе - 20 мг/кг, эмбриотоксический и тератогенный эффекты не были выявлены.
Lapras М. et al. в 1973 году исследовали эмбриотропное действие парбендазола на 900 овцематках в дозе 30 мг/кг, при этом у ягнят от 150 овцематок наблюдали аномалии развития. Было установлено, что препарат при введении с 9 по 21 дни суягности вызывает уродства плодов. Установлено, что введение парбендазола овцам на 10-11 дни эмбриогенеза вызывало аноф-тальмию, агнезию почек, заращение ануса; на 12-13 дни - эктомию грудных органов; 14 день - циклопость; 17 день - сращение позвонков. Отклонения в развитии суставов проявлялись при введении с 12 по 15 дни, а аномалии позвоночного столба при введении препарата на 15-20 дни суягности.
Введение парбендазола в дозе 10-200 мг/кг мышам с 6 по 15 дни эмбриогенеза выявило ярко выраженное эмбриотоксическое и тератогенное действие. В верхней дозе - 200 мг/кг наблюдалась полная внутриутробная гибель, в дозе 100 мг/кг у 100% выживших плодов имели место аномалии развития (Lapras М. et al., 1973).
При введении парбендазола овцам в дозах 20 и 30 мг/кг на 12, 17, 21 и 23 дни суягности аномалии развития у потомства отсутствовали. Введение парбендазола на 12 день суягности в более высокой дозе 60 мг/кг приводило к повышенной гибели, что выражалось в увеличении числа овцематок, возвращающихся к повторной охоте. Тератогенный эффект наблюдали только у ягнят, матери которых получали препарат на 17 день суягности в дозе 60 мг/кг. Также после введения парбендазола были выявлены аномалии костной системы, атрезия наружного слухового отверстия, неполное развитие перегородки желудочков сердца, а также отсутствие анального отверстия (Middleton H.D. et al., 1974).
Duncan W.A.M., Lemon P.G. в 1974 году провели исследования с пар-бендазолом на крысах линии Вистар. Препарат вводили в дозах 12,5; 25 и 50 мг/кг с 6 по 15 дни беременности. В дозе 50 мг/кг эмбриональная гибель плодов составила 97%; у 75% выживших плодов наблюдали аномалии развития (гидроцефалию, микрофтальмию, анофтальмию, аномалии развития костей черепа и др.).
По данным разных исследователей (Saunders L.Z. et al., 1974; Szado K.T. et al., 1974; Mercier-Parot L., 1976) введение парбендазола в дозе 60 мг/кг на 16-24 дни суягности вызывало многочисленные патологические изменения в центральной нервной системе, костях таза, длинных трубчатых костях, суставах и пальцах.
Saunders L.Z. et al., (1974); Szado K.T., Miller C.R., Scott G., (1974); Middleton H.D. et al. (1974) проводили исследования на овцах различных пород и подтвердили отрицательное действие парбендазола на эмбрионы в дозе 60 мг/кг, а именно ярко выраженный эмбриотоксический и тератогенный эффект при введении с 12 по 22 дни суягности; в более поздние сроки препарат безопасен для данного вида животных.
Hancock N.H., Poulter D.A.L. (1974) доказали, что введение препарата в дозе 90 мг/кг супоросным свиноматкам не оказывает влияния на развитие плода. Аналогичные результаты получили Szado К.Т., Miller C.R., Scott G., (1974) в опытах на стельных коровах.
В 1976 году Mercier-Parot L. провел исследования с парбендазолом при введении кроликам в дозах 30-50 мг/кг, на данном виде животных эмбриотоксический и тератогенный эффекты отсутствовали.
Prozesky L. G. et al. (1981) наблюдали паралич конечностей у ягнят, матери которых получали парбендазол на 30; 31; 37 и 53 дни суягности. У 2 из 5 ягнят с параличом, наблюдали гипоплазию головного мозга, у 2 ягнят имела место гидроцефалия. При патологоанатомическом исследовании было выявлено наличие глиолиза и очагов энцефаломиелии в белом веществе головного мозга. У 2 ягнят выявили патологические изменения спинного мозга, а именно гидромиелию, сирингомиелию, раздвоение спинномозгового канала и смещение его в вентральном направлении.
Таким образом, по данным Lapras М. et al., 1973; Delatour P. et al., 1974; Duncan W.A.M, Lemon P.G., 1974; Philip J.R., Birkhead H.A., 1974; Regnier В., 1975 парбендазол обладает высокой эмбриотоксической и тератогенной активностью. Однако, Duncan W.A.M. et al., 1974; Hancock N.A., Poulter D.A.L., 1974; Szado K.T., et al., 1974 сообщили о том, что при введении парбендазола свиньям, коровам, овцам, кроликам и хомякам, в отличие от крыс, он не оказывает тератогенного действия на эмбрионы этих видов животных.
Переходим к анализу данных по эмбриотропному действию камбенда-зола. . Структурная формула камбендазола При ежедневном пероральном введении крысам камбендазола (МК 905) с 8 по 15 дни беременности в опытах Delatour P., Lorgue G. et al. (1974) препарат оказывал выраженный тератогенный и эмбриотоксический эффект. Аналогичные результаты получили Fave A., Maillet М. (1974) при подкожном введении препарата. По данным Delatour P. et al.(1974) препарат вызывал уродства и гибель плодов у крыс линии Charles River CD при его введении в дозах 5,03-15,12 мг/кг. Камбендазол проявил тератогенный эффект при введении овцам на 21 день суягности в дозах 50 и 75 мг/кг (Delatour P., Lorque G et al., 1974). При подкожном введении камбендазола в период органогенеза регистрировали аномалии развития у крыс (Fave A., Maillet М., 1974). При введении препарата овцам на 14-21 дни суягности в дозе 50-75 мг/кг проявлялось ярко выраженное эмбритропное действие, при этом имела место четкая зависимость «доза-эффект» (Delatour P. etal., 1975). Drudge J.H. (1963) при введении препарата пони в дозе 20 мг/кг в первые 16 недель эмбриогенеза наблюдали аномалии развития конечностей у родившихся жеребят. Отрицательный эффект был выявлен при введении препарата кобылам (Durez J., Pechur М., 1972). Следующим препаратом, о котором также хорошо известно, что он проявляет данный побочный эффект, является мебендазол.
Сведения об антигельминтных свойствах бензимидазолкарбаматов
Препараты исследовали под микроскопом Zeiss Axio Imager (Германия), оснащенным цифровой камерой Axio Cam MRm. Обработку изображений производили с помощью пакета программ анализа изображения Axio Vision, версия 4.6.3.
В основные регистрируемые показатели входило: число одиночных и парных фрагментов, ахроматических пробелов (гэпов) и расхождений по центромере, число клеток с полной деструкцией хромосом.
Оценку результатов цитогенетического анализа проводили при сравнении количества клеток с хромосомными аберрациями в опытных и контрольных группах. Всего было проанализировано 200 стекол.
Опыт по оценке подострой токсичности препарата БМК плюс. Сформировали 4 опытных и 1 контрольную группы по 7 крыс массой 180-200 г в каждой. В настоящем опыте использовали дозы, кратные установленному значению LD50, т. е. 2400 мг/кг (для взрослых крыс). Препарат БМК плюс вводили опытным крысам перорально в следующих дозах: группа 1 - 480 мг/кг (1/5 от LD50); группа 2 - 240 мг/кг (1/10 от LD50); группа 3 - 120 мг/кг (1/20 от LD5o); группа 4-48 мг/кг (1/50 от LD50). Препарат вводили в виде водной суспензии с добавлением твина 80. Крысы группы 5 получали дистиллированную воду, и они служили контролем. Во всех случаях препарат вводили в течение 7 суток. В течение всего опытного периода наблюдали за гибелью крыс, общим состоянием животных, приростом массы тела, видимыми физиологическими функциями. В конце опыта (через 1 сутки после последнего введения) животных всех групп подвергали эвтаназии дислокацией шейных позвонков; отбирали пробы крови для определения гематологических и биохимических показателей; взвешивали основные органы для определения массовых коэффициентов; проводили макро- и микроскопическое исследование печени, лег ких, сердца, селезенки, головного мозга, почек, лимфатических узлов, желудка, тонкого и толстого кишечника.
Основные показатели периферической крови крыс определяли на гематологическом анализаторе «Abacus JuniorVet» (Diatron, Австрия); лейкоцитарную формулу - общепринятым методом. Биохимические показатели крови определяли на анализаторе А-15/25 (BioSystems S.A., Испания).
Опыт провели в частном хозяйстве Смоленской области ООО «При-горское». По результатам копро- и ларвоскопических исследований отобрали 30 овец романовской породы, спонтанно инвазированных гемонхами, нема-тодирами, мюллериями, мониезиями. Животных разделили на 4 равноценные группы. Обработку зараженных животных проводили следующим образом: овцам группы 1 вводили БМК в виде порошка в дозе 150 мг/кг; группы 2 -БМК в дозе 100 мг/кг; группы 3 - БМК в дозе 50 мг/кг; группы 4 - препарат БМК плюс в дозе 100 мг/кг; группы 5 - БМК плюс в дозе 25 мг/кг, и группа 6 служила контролем без обработки (во всех случаях дозы выражены по БМК).
Препараты вводили индивидуально из расчета массы тела. Эффективность препаратов учитывали по результатам исследования проб фекалий овец через 14 суток после введения препаратов. Расчет эффективности проводили по типу «контрольный тест» согласно «Руководству по оценке эффективности антгельминтиков у жвачных (крупного рогатого скота, овец, коз)», 1995. В период испытаний учитывали переносимость препаратов. 2.1.5. Статистическая обработка данных
Статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с помощью простого сравнения средних по двухстороннему t-критерию Стьюдента. Различия определяли при 0,05 уровне значимости.
Расчеты выполняли на персональном компьютере с использованием приложения Microsoft Exel 2010 (Microsoft Inc., USA).
Введение одного БМК привело к проявлению выраженного эмбрио-тропного действия препарата, которое выражалось в повышенной общей эмбриональной гибели плодов (56,58±5,69 по сравнению с 10,08±2,77% в контроле). У эмбрионов от крыс-самок, которым вводили БМК, были достоверно снижены масса и размеры (1,75±0,06 по сравнению с 2,47±0,02 г в контроле и 2,63±0,04 против контрольного значения 3,12±0,02 см).
Имело место 2 случая полной внутриутробной гибели плодов (таблица 4). Как следует из приведенных выше данных, при совместном введении БМК с ивермектином постимплантационная гибель и общая эмбриональная смертность была несколько ниже по сравнению с БМК (27,27±7,04 и 40,06±7,75 по сравнению с 31,25±5,32 и 56,58±5,69% для БМК), однако, все-таки, эти показатели были выше, чем в контроле (таблица 4).
Далее перейдем к рассмотрению варианта опыта, в котором беременным крысам-самкам в критические сроки эмбриогенеза вводили БМК (150 мг/кг) в сочетании с другим производным авермектинов, т.е. с абамектином (2,0 мг/кг) (таблица 5).
Приведенные данные позволяют сделать вывод о том, что введение БМК вместе с абамектином ослабляет эмбриотоксическое действие первого. Об этом свидетельствуют более низкие показатели гибели плодов (так, например, общая эмбриональная смертность составила в случае испытуемой комбинации 27,10±3,57 по сравнению с 56,58±5,69% для одного БМК); однако они не достигали контрольных значений. Кроме того, у эмбрионов от опытных самок имели место более низкая масса и размеры (таблица 5).
Однако следует отметить, что, несмотря на отсутствие полного снятия эмбриотропного эффекта БМК при совместном введении с абамектином, результат с последним соединением был лучше по сравнению с ивермектином (таблицы 4 и 5). Однако имело место 3 случая полной внутриутробной гибели плодов, и это обстоятельство побудило нас предпринять еще одну попытку предупредить побочный эффект БМК с помощью абамектина. В данном случае эмбриотропный агент вводили в аналогичной дозе 150 мг/кг, но дробно, т.е. в несколько приемов; дозу абамектина не изменяли, и она осталось равной 2,0 мг/кг. Результаты такого варианта комбинированного введения приведены в таблице 6.
Изучение фармакокинетики БМК и его метаболита при введении крысам суспензии БМК и препарата БМК плюс
Основные параметры, характеризующие биодоступность соединений, AUCt и AUCo , свидетельствуют о том, что биодоступность неизмененного БМК была существенно выше при введении суспензии по сравнению с введением БМК плюс (16,13; 16,14 против 3,39; 3,47 мкг/млхч). В то же время биодоступность его основного метаболита в случае введения суспензии БМК была ниже (5,08; 5,24 против 8,09; 9,36 мкг/мл ч). Фармакокинетический анализ подтвердил, что максимальная концентрация БМК при его введении в виде суспензии имеет место на 2 часа, в то время как при введении БМК плюс несколько раньше, точнее через 1 час. В противоположность этому максимум продукта метаболизма БМК наблюдали позднее при введении БМК плюс соответственно через 4 и 6 часов (таблица 28).
Фармакокинетические параметры БМК и его метаболита 5-ОН-БМК в плазме крови крыс после однократного перорального введения суспензии БМК и БМК плюс в дозе 300 мг/кг (по БМК) (п=3) vz л 20,23 - 136,30 Расчет фармакокинетических параметров позволил интерпретировать и саму максимальную концентрацию обоих продуктов. Значение Стах БМК было выше при введении суспензии по сравнению с вариантом опыта, когда вводили БМК плюс (6,96 по сравнению с 2,13 мкг/мл). Очень интересная ситуация складывается с концентрацией 5-ОН-БМК. Максимальный уровень метаболита при введении одного БМК был выше (1,16 против 0,96 мкг/мл). Однако наиболее примечательным фактом является то, что в случае БМК плюс параметр MRT, характеризующий среднее время удерживания соединения в организме, был существенно выше (12,05 по сравнению с 3,50 ч).
Рассмотрим еще один фармакокинетический параметр Vz, кинетический объем распределения, и в этом случае имеется своего рода интрига. Поясним это положение. Значение Vz для БМК при введении суспензии существенно ниже по сравнению с БМК плюс. Это означает, что при введении комбинированного препарата БМК лучше проникает через биологические мембраны и в большей степени распределяется в периферических органах и тканях. Последнее несколько настораживает и противоречит нашим представлениям о том, что более низкая концентрация БМК и является причиной отмены эмбриотропного действия соединения. Однако следует учитывать, что одновременно шла интенсивная биотрансформация БМК в продукт де-токсикации, т.е. 5-ОН-БМК, и его выделение. Об этом свидетельствует более высокое значение клиренса С1ро (86,89 против 18,59 л/ч).
Последнее, что хотелось бы упомянуть при анализе фармакокинети-ческих параметров, так это период полураспада. Значение х /2 БМК и 5-гидрокси-БМК при введении БМК плюс было выше по сравнению с суспензией одного БМК (таблица 28).
Дополнительный анализ полученных данных приводится в разделе «Обсуждение». Таким образом, суммируя результаты настоящего раздела в целом, можно сделать следующие выводы. Имеются очевидные особенности фарма-кокинетики и метаболизма БМК при его введении в виде суспензии и в составе комбинированного препарата, которые, на наш взгляд, и объясняют предупреждение эмбриотропного действия бензимидазолкарбамата. Каким образом, это повлияло на возникающие при этом феномене нарушения на клеточном уровне, мы попробуем выяснить в следующем разделе. Влияние БМК и препарата БМК плюс на митоз клеток костного мозга у крыс и мышей
Известно, что антимитотическое действие бензимидазолкарбаматов, т.е. способность нарушать клеточное деление, лежит в основе эмбриотропно-го эффекта соединений этого класса.
Таким образом, отмена этого эффекта, по сути дела, будет означать отсутствие эмбриотоксического и тератогенного действия.
Необходимо также отметить, что само отрицательное влияние БМК на клеточное деление можно исследовать в нескольких тесно связанных аспектах, в частности, на митотический аппарат и сами хромосомы.
Антимитотическое действие испытуемого препарата в сравнении с самим БМК и контролем оценивали на двух лабораторных моделях, крысах и мышах, в дозе 300 мг/кг по БМК.
В таблице 29 приведены данные по влиянию БМК на показатели мито-тической активности клеток костного мозга крыс при его различном введении. Выделим основные моменты. Введение одного БМК привело к достоверному увеличению относительного количества метафаз и снижению доли других стадий митоза. Так, например, число метафаз через 3; 6 и 24 часа после введения суспензии БМК составило соответственно 76,29±2,68; 72,14±2,86 и 72,73±3,03 против 37,97±7,81% в контроле (таблица 29; рис. 26-29). Также имело место повышение митотического индекса за счет остановки клеточного деления на стадии метафазы (таблица 29; рис. 25).
Иная ситуация сложилась при введении препарата БМК плюс. В данном случае относительное количество метафаз на все периоды исследования, т.е. 3; 6 и 24 часа, составило соответственно 48,98±7,22; 48,98±7,22 и 38,04±8,21% против контрольного значения 37,97±7,81%. Кроме того, статистически значимым образом не изменилось количество других стадий митоза, профаз, анафаз и телофаз, по сравнению с контролем (таблица 29; рис. 26; 30-32).
Особенности фармакокинетики и биотрансформации БМК у крыс при самостоятельном введении и в составе комбинированного препарата БМК плюс
При исследовании субхронической токсичности препарата БМК плюс было проведено макро- и микроскопическое исследование органов (печени, легких, почек, сердца, селезенки, головного мозга, брыжеечных лимфатических узлов, желудка, тонкого и толстого кишечника), образцы которых отбирали у 3 крыс из каждой группы.
Печень. Нормальная ткань печени, имеет молочно-шоколадный цвет, более темные участки ткани соответствуют центральным зонам долек, кровеносные сосуды не видны. Легкие. Имеют вид пористой, губчатой структуры бело-розового цвета. Почки. Имеют характерно темно-красный цвет, плотного на ощупь строения. Сердце. Сердце крыс имеет темно-красный цвет и форму неправильного конуса. Хорошо видны протоки артериальных и венозных соудов. Селезенка имеет блестящую поверхность темно-красного цвета с сероватым оттенком. Наружная поверхность селезенки гладкая и выпуклая. Головной мозг. Плотная, дольчатая ткань серовато-розового цвета с прожилками кровеносных сосудов. Лимфатические узлы (брыжеечные). Имеют бледно-желтоватый цвет с небольшими вкраплениями кровеносных сосудов, плотные на ощупь. Желудок. При введении препарата БМК плюс в дозе 480 мг/кг наблюдали скопление пищевых масс; кровоизлияния на слизистой. Введение БМК плюс в других дозах не отразилось на макроскопической картине желудка и описание можно представить следующим образом: полый орган серо-розового цвета, железистый по ощущениям, без особенностей.
Тонкий кишечник. Розового цвета с многочисленными прожилками кровеносных сосудов. Стенки кишечника прозрачны. Толстый кишечник. Серовато-розового цвета; без особенностей. Приводим описание гистологических препаратов органов у контрольных животных. Печень. Различают эпителиальную паренхиму и соединительнотканную строму. Печеночные дольки имеют форму шестигранной пирамиды, в центре которой находится центральная вена; в дольке четко выделяются центральная, периферическая и находящаяся между ними промежуточная зоны.
Гепатоциты имеют неправильную многоугольную форму. Своими латеральными поверхностями гепатоциты формируют печеночные балки. В центре клеток лежат одно-два округлых ядра. В цитоплазме хорошо развита гранулярная эндоплазматическая сеть. Видны гранулы гликогена. Хорошо видны желчные протоки и кровеносные сосуды - они без патологии. Легкие. На препаратах отчетливо видны легочные дольки полигональной формы, друг от друга отделены соединительной тканью, содержат эластичные волокна. Стенки альвеол выстланы однослойным эпителием, в котором различают многоугольные клетки с ядром и зернистой протоплазмой.
Хорошо видна в альвеолах густая сеть капилляров. Бронхи со свободным просветом, кровеносные сосуды полнокровны.
Почки. На микроскопических препаратах почек видно, что паренхима почки неоднородна, в ней выделяются два слоя - корковое и мозговое вещество. Мозговое вещество более светлое, расположено внутри почки отдельными островками — почечные пирамиды. Корковое вещество более окрашено, богато сосудами. Основной структурно-функциональной единицей почки является неф-рон. Эпителиальные клетки округлые, полигональные, слегка удлиненные. Округлые ядра компактны и располагаются эксцентрично. В ядрах видно маленькое ядрышко. Цитоплазма относительно широкая, окрашена в серо-сиреневые тона. Сосудистая система почки без патологии. Сердце. Клетки сердечной мышечной ткани, кардиомиоциты, уплощены, содержат крупное ядро, светлую цитоплазму. Периферическую часть цитоплазмы кардиомиоцитов занимают поперечно исчерченные миофибриллы, снаружи покрыты сарколеммой, в составе которой выделяются плазмолемма и базальная мембрана.
Дистрофических изменений ткани, расширения сосудов микроциркулярного русла не выявлено. Селезенка. Селезенка снаружи покрыта капсулой, состоящей из мезо-телия, волокнистой соединительной ткани и гладких миоцитов. От капсулы внутрь отходят перекладины — трабекулы, анастомозирующие между собой. Между трабекулами видна пульпа селезенки.
Различают белую и красную пульпу селезенки, или Т-зависимые и В-зависимые зоны. В белой пульпе лимфоидные фолликулы представлены ретикулярными клетками, лимфобластами, макрофагами, которые хорошо окрашены в фиолетовый цвет. Красная пульпа состоит из ретикулярного остова (эритроцитов, тромбоцитов, плазматических клеток).
Красная зона лимфатических узелков окружена синусоидальными капиллярами, стенка которых пронизана щелевидными порами.
Головной мозг. Головной мозг покрывают мягкая (сосудистая), паутинная и твердая оболочки. Строма оболочки представлена рыхлой, неоформленной соединительной тканью с большим количеством кровеносных сосудов и нервных волокон. Паутинная оболочка выстлана однослойным плоским эпителием. Видны крупные кровеносные сосуды, ветви которых проникают в мягкую мозговую оболочку. Кровеносные сосуды, проникающие в ткань головного мозга, идут по каналам, выстланным мягкой мозговой оболочкой.
Лимфатические узлы (брыжеечные). Разделены на корковую и мозговую части. В корковой части располагаются лимфатические фолликулы, от которых в мозговую часть отходят мозговые тяжи. Центральная часть лимфатических фолликул на препаратах окрашена светлее. Хорошо видна капсула, содержащая много коллагеновых волокон. В корковом веществе имеется скопление лимфоидной ткани. Мозговое вещество лимфоузлов является местом созревания плазматических клеток, В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов и макрофагов, которые хорошо видны на препаратах.