Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Характеристика региона Республики Калмыкия 10
1.2. Краткие сведения о ценурозе 19
1.3. Профилактика ценуроза овец 38
Глава 2. Собственные исследования распространение, сезонная и возрастная динамики гельминтозов овец в условиях Мало-Дербетовского района Республики Калмыкия 52
2.1. Материалы и методы исследования 52
2.2. Результаты собственных исследований. Характеристика Мало-Дербетовского района Республики Калмыкия 54
2.2.1 Анализ гельминтологической ситуации по гельминтозам овец в хозяйствах в Мало-Дербетовском районе Республики Калмыкия 55
Глава 3. Технологический процесс изготовления модифицированной вакцины против ценуроза овец 78
3.1. Материалы и методы 78
3.2. Результаты собственных исследований 86
3.2.1. Получение исходного материала для производства вакцины против ценуроза 86
3.2.2. Изготовление вакцины против ценуроза овец. Изготовление модифицированной вакцины против ценуроза 92
Определение стерильности и безвредности модифицированной вакцины против ценуроза овец 98
Оценка иммуногенных свойств модифицированной вакцины против ценуроза овец 99
Глава 4. Производственные испытания вакцины против ценуроза овец в условиях Мало-Дербетовского района Республики Калмыкия 107
4.1. Литературная справка 107
4.2. Материалы и методы исследования 110
4.3. Результаты собственных исследований
Изучение эффективности модицированнои вакцины против ценуроза при иммунизации ягнят в возрасте 2-3 месяцев Изучение влияния модифицированной вакцины против ценуроза на организм ягнят
Изучение эффективности модифицированной вакцины против ценуроза овец при иммунизации ягнят 5-7 месячного возраста
Обсуждение результатов исследований 141
Выводы 151
Практические предложения 152
Список использованной литературы 154
Приложения 173
- Краткие сведения о ценурозе
- Анализ гельминтологической ситуации по гельминтозам овец в хозяйствах в Мало-Дербетовском районе Республики Калмыкия
- Изготовление вакцины против ценуроза овец. Изготовление модифицированной вакцины против ценуроза
- Изучение эффективности модифицированной вакцины против ценуроза овец при иммунизации ягнят 5-7 месячного возраста
Краткие сведения о ценурозе
Ценуроз церебральный - широко распространенное инвазионное заболевание овец, реже коз, крупного рогатого скота, диких жвачных (сайгаков, яков, джейранов, архаров, козерогов и др.), вызываемое па-разитированием в головном или спинном мозге личиночной стадии Coenurus cerebralis цестоды Multiceps multiceps сем. Taeniidae, локализующейся в тонком отделе кишечника собак, волков, шакалов, лисиц и других плотоядных.
Экономический ущерб, причиняемый ценурозом, значителен и складывается в основном из убытков от падежа и вынужденного убоя овец. Овцы, убитые в последний период болезни, недодают 50-60 % мяса, которое напрашіяется на техническую утилизацию. От больных ценурозом овец получаемая шерсть имеет низкое качество (А.К. Жура-вец, 1982; Г.М. Лазарев, 1998).
Изучением биологии, эпизоотологии, клиники, диагностики и профилактики ценуроза церебрального (Coenurus cerebralis) овец, вызываемого паразитированием личиночной стадии половозрелой цестоды Multiceps multiceps, занимались как отечественные, так и зарубежные ученые (Г.И. Ронжина, 1955; К.И. Скрябин, Р.С. Шульц, 1956, 1958; В.И.Бондарева, 1963; Р.Г. Исмаилова, В.И. Пухов, В.Р. Тарасов, Н.М. Матчанов, 1965; В.М Шамхалов, 1978, 1988, 1990; М.А. Аминжанов, 1978, 1988, 1990, 1999; А.С. Бессонов, 1986, 1992; Н.Е. Косминков, 1986, 1990, 1991, 1996; A.M. Биттиров, 1990; Б.К. Лайпанов, 1994; D. Hulincka, Z. Zdarska, M.D.Rickard, A. Adolph, 1976; Vester, 1982 и др.).
Ценуроз распространен среди восприимчивых животных во всех странах мира. В России ценуроз регистрируют на Кавказе, Нижней и Средней Волге, в Сибири (в Красноярском крае) и др., т.е. это заболевание характерно для зон с развитым овцеводством.
Ценуроз относится к биогельминтозам. Окончательный (дефинитивный) хозяин заражается при поедании голов павших или вынужденно убитых животных, пораженных ценурозом. В кишечнике дефинитивного хозяина цестоды достигают половозрелой стадии через 40-75 дней (В.И. Бондарева, 1963), однако, по данным других авторов, эти сроки могут варьировать от 35-40 до 45-60 дней в зависимости от возраста дефинитивного хозяина (А.К. Журавец, 1992; Б.К. Лайпанов, 1994).
Д.И.Иргашев (1956) сообщает о большей инвазированности половозрелыми тениями собак-самцов, которую он объяснял их более высокой физиологической активностью по сравнению с самками. М.М. Шальменов (1987) также установил, что приживаемость тений у самцов выше, чем у самок. При этом автор отмечал зависимость сроков развития гельминтов до половозрелой стадии от возраста хозяина: у щенков тении развивались быстрее, чем у взрослых собак.
По данным Greig and Holmes (1979) ценуроз у овец встречается чаще, чем у крупного рогатого скота и других животных, и поражает все породы любого пола и возраста (Jensen, 1974).
Заболевание протекает преимущественно хронически, характеризуется нарушением деятельности центральной нервной системы, внешне проявляется манежными и не координированными движениями, исхуданием, потерей стадного чувства и залеживанием. При этом отмечают резкие клонические и тонические судороги всей скелетной мускулатуры, скрежетание зубами, кружение, различные вынужденные позы, периоды бессознательного состояния, параличи. Развитие ценуруса, особенно в поверхностных структурах мозга, вызывает атрофию и размягчение костей свода черепа. При начальной стадии заболевания диск зрительного нерва несколько увеличен в объеме, резко гиперемирован, границы сливаются с отечной сетчаткой. При хронической форме диск уменьшен в размере, контуры его неотчетливые, цвет сероватый (Я.В. Бочкарев, В.М. Митрофанов, 1988).
Ранний период болезни, так называемая острая стадия ценуроза, характеризуется сильным угнетением животных, отказом от корма, поносами с примесью крови, появлением болезненности брюшной стенки, учащением пульса и дыхания.
Coenurus cerebralis имеет вид пузыря до 10 см в диаметре, объемом до 200 мл и более, круглой или овальной формы, размер которого зависит от степени развития и локализации паразита (Г.И. Ронжина, 1958; В.И. Бондарева, 1963; Н.Н. Матчанов, А.Т. Сагиева и др., 1977). Оболочка пузыря состоит из наружного (собственного) внутреннего (герминативного) слоя. На герминативной оболочке в виде розеток отдельными группами близко друг к другу располагаются сколексы на разной стадии развития (Г.И. Ронжина, 1958). Число их по мере развития возбудителя увеличивается. В одном пузыре насчитывается от 200 до 1000 экземпляров сколексов. По своем} строению они идентичны сколексам половозрелой стадии. В зрелом ценуре наряду со сколексами с хорошо развитыми крючками и присосками встречаются сколексы на стадии почкования в виде скоплений мелких белых шариков (d = 1,5 мм), без крючьев и присосок. Пузырь заполнен жидкостью, содержащей тирозин, триптофан, аргинин, калий, кальций, натрий, магний, хлор, фосфаты, аммоний. Количество ценурозных пузырей у овец бывает от 1 до 2-3 и редко более. Однако М.С.Черникова (1965) выявляла в головном мозгу овец до 28 ценурусных пузырей, а Н.Е. Косминков (1990) - до 36 величиной от горошины до фасолины.
Основную роль в эпизоотологии ценуроза играют, как известно, приотарные и бродячие собаки, выделяющие зрелые членики М. multiceps, заполненные яйцами, содержащими онкосферами. Как правило, приотарные собаки поражены мультицептозом на 30-50 %, поселковые - в 15 % случаев (А.К. Журавец, 1982; Г.М. Лазарев, 1998). К. Калмурзаев (1972) сообщает, что заражение собак имагинальными цес-тодами весной в два раза больше, чем осенью. В кишечнике собак, как правило, развивается почти столько же паразитов, сколько сколексов было на внутренней стенке пузыря (В.И. Бондарева, 1963). Срок жизни мультицепсов исчисляется в среднем 6-8 месяцами, однако, иногда они могут жить до 1,5 лет (Г.Й. Ронжина. 1955). Затем собаки самопроизвольно освобождаются от паразитов.
Половозрелую форму мультицепсов часто находят в кишечнике волков, реже лисиц (М.С. Черникова, 1965; В.И. Бондарева, 1963; A.M. Биттиров, 1990). По мнению А.К. Журавца (1990), волки играют второстепенную роль в распространении ценуроза. Автор объясняет это относительно небольшой зараженностью волков M.multiceps и менее тесным контактом с овцами. Однако A.M. Биттиров (1990) сообщает, что в распространении ценуроза в Кабардино-Балкарии большую роль играют одичавшие собаки и волки, популяции которых в настоящее время растут.
Ленточная форма Multiceps multiceps (Leske, 1780) представляет собой плоскую белую членистую ленту длиной 30-80 см, состоящую из сколекса диаметром 1,5 мм с четырьмя присосками яйцевидной формы с двумя рядами хитиновых крючьев, имеющих характерную форму, короткой шеи и длинной стробилы, насчитывающей 200-300 члеников шириной до 5 мм. Крючки первого ряда достигают 0,15-0,17 мм длины и снабжены острым изогнутым лезвием. Последние 15-20 члеников цес-тоды зрелые и содержат от 40 до 60 тыс. яиц в каждом. Яйца мультицепсов имеют размеры 0,029-0,037 мм в диаметре, округлой или овальной формы, с толстой радиально исчерченной оболочкой, внутри содержат зародыш (онкосферу) с тремя парами крючьев. При исследовании под СКАНом на наружной поверхности эмбриофора яиц выявлялась мелкая волнистая рябь. На одном из полюсов у части яиц на эмбриофоре обнаруживали хорошо заметные углубления кратерообразной формы. Таким образом, яйца мультицепсов представляют собой развившуюся онкосферу, находящуюся под защитой трех (скорлуповой, радиально-исчерченной и липоидной) или двух (радиально-исчерченной и липоид-ной) оболочек (Н.Е. Косминков, 1991).
Зрелые членики отторгаются от цестоды и вместе с фекалиями попадают во внешнюю среду, где членики разрушаются, рассеивая большое количество яиц на траве пастбищ, загрязняя водоемы и прико-шарные территории. Подсчитано, что в отдельных случаях в кишечнике одной собаки может паразитировать до 200 и более мультицепсов, причем один экземпляр возбудителя способен выделять в день около 18 члеников, содержащих от сотен тысяч до нескольких миллионов зародышей (В.И. Бондарева, 1963; А. Ревенко, 1986).
По данным М. Аминжанова (1999), в Узбекистане наибольшая зараженность мультицепсами обнаружена у кишлачных собак (30,1 %). Р.Э. Бекиров (1990) в своих исследованиях показал, что инвазирован-ность чабанских и прикишлачньж собак мультицептозом составляет 41,9 %. По данным A.M. Биттирова (1990), экстенсивность поражения приотарных собак мультицептозом в Кабардино-Балкарии составляет 39,4-42,8% при интенсивности инвазии 21-86 экземпляров на голову.
По данным С.А. Кенжебаева (1985), зараженность собак имаги-нальными тениями в Алма-Атинской области составляет 26,5 %, при этом эхинококки обнаружены у 3,7 %, мультицепсы у 6,1 %, а тении ги-датигены у 20,1 % животных. В Талды-Курганской области инвазиро-ванность тениями приотарных собак составила 26,3 %, в том числе эхинококками - 4,4 %, мультицепсами - 10,0 %, тениями гидатигенными -15,7 %. У городских собак были выделены только тении гидатигенные (5,8 % от числа обследованных).
Анализ гельминтологической ситуации по гельминтозам овец в хозяйствах в Мало-Дербетовском районе Республики Калмыкия
В табл. 2.1 приведены данные ветеринарной отчетности по заболеваемости овец гельминтозами за 1995-1997 гг.
Анализ данных ветеринарной отчетности за 1995-1997 гг. показал, что в районе ежегодно регистрируют следующие гельминтозы овец: мо-ниезиоз при средней ЭИ за исследуемый период 0,7 %, ценуроз (ЭИ 0,39 %), диктиокаулез (ЭИ 0,5 %), нематодироз (ЭИ 0,3 %), эхинококкоз (ЭИ 0,2 %) и гемонхоз (ЭИ 0,1 %). При этом ЭИ перечисленными гельминтозами в эти годы находилась практически на одном и том же низком уровне (2,19, 2,1 и 1,89 соответственно), что связано, по нашему мнению, с одинаковыми климатическими условиями (влажная весна, сухое жаркое лето и осень). Наиболее низкая ЭЙ (0,1 %) в период наблюдений отмечена для гемонхоза, что связано с жаркцм сухим летом, когда при родные и пастбищные сенокосы освобождаются полностью или частично от инвазионного начала не только гемонхусов, но и большинства геогельминтов. На такую причину колебаний ЭИ желудочно-кишечных стронгилятозов у овец в Калмыкии указывал Г.М. Лазарев (1998).
Анализ заболеваемости овец ценурозом показал значительное снижение уровня заболеваемости овец в 1997 г. (в 10,87 раза по сравнению с 1995 г.), что связано, на наш взгляд, с проведением профилактических работ в районе по вакцинации против ценуроза в 1996 г..
Проведенные нами исследования проб фекалий от животных опытных групп в начале июня до проведения плановой дегельминтизации позволили установить экстенсивность и интенсивность заражения овец разных возрастных групп гельминтами. Результаты исследований показали, что у ягнят 2-3 месячного возраста в 31,1 % проб фекалий обнаружены яйца гельминтов, у молодняка прошлого года рождения -в 17,7 % проб и у овцематок - в 24,4 % исследуемых проб.
Экстенсивность инвазии трихостронгилидами у ягнят текущего года рождения составила в начале июня 24,4 %, у молодняка прошлого года рождения 8,8 % и у овцематок 13,3 %, при этом в пробах фекалий ягнят текущего года рождения в основном выявляли яйца нематодиру сов (табл. 2.2).
Экстенсивность инвазии мониезиозом у ягнят текущего года рождения в начале июня состаатяла 6,6 %; у молодняка прошлого года рождения - 8,9 % и у овцематок -11,1 %. Результаты опытов представлены в табл. 2.3.
Таким образом, в начале июня ягнята текущего года рождения заражены желудочно-кишечными стронгилятозами и мониезиозом, при этом экстенсивность заражения желудочно-кишечными стронгилятоза-ми превышает зараженность ягнят мониезиозом. При этом в 2,2 % проб выявлено одновременное заражение нематодирами и мониезиями, т.е. установлена смешанная инвазия этими гельминтами.
Результаты гельминтологического исследования сычуга и тонкого отдела кишечника 12 ягнят текущего года рождения в возрасте 2-3 месяцев, 9 голов молодняка прошлого года рождения и 5 овцематок, проведенные в этот период, показали, что у животных всех возрастных групп отмечена смешанная трихостронгилидозная инвазия, включающая нематодирусов, трихостронгилюсов, кооперий, гемонхусов и остертагии. При этом у ягнят текущего года рождения средняя интенсивность инвазии составила 447+216 экземпляров при ЭИ 83,3 %. Доминирующее по численности положение занимали нематодирусы (до 7 І % от общего числа гельминтов), они обнаружены у 75 % животных. Трихостронгилюсы составили 23 % от общего числа гельминтов при ИИ 93+72 экземпляра и были выявлены у 66,66 % ягнят. Гемонхусов выделено не было, кооперий и остертагии обнаружены у 33,33 и 41,66 % ягнят соответственно в 2-3 % от общего числа гельминтов при средней ИИ 14+6 и 2+1 экз.
У молодняка прошлого года рождения средняя ИИ трихостронги-лидами составила 283+67 экземпляров при преобладании трихостронгилюсов, они составили 50 % от общего числа гельминтов при интенсивности 96+12 экземпляров и ЭИ 66,66 %. Нематодирусы составили 29 % от общего числа гельминтов при средней ИИ инвазии 57+26 экземпляров и ЭИ 77,7 %. Кооперий и остертагии составили 4-6 % от общего количества гельминтов при ИИ 31+15 и 8+3,5 экз. соответственно. Гемонхусов при вскрытии нами не обнаружено.
У взрослых овцематок ИИ трихостронгилидами составляла в среднем 165+52 экземпляра. У 80 % животных преобладали остертагии с ИМ 59127 экз., у 60 % были выявлены трихостронгилюсы в количестве 56 29 экземпляров и нематодирусы в количестве 42+23 экз. Кооперии составили 5 % от общего числа гельминтов и были выявлены у 20 % овцематок в количестве 9+5 экземпляров. У І овцематки в сычуге были выявлены гемонхусы в количестве 5 экземпляров.
Результаты гельминтологического вскрытия овец разных возрастных групп по изучению интенсивности инвазии трихостронгилидами до начала плановой дегельминтизации в июне месяце представлены в табл. 2.4.
Интенсивность инвазии мониезиями овец разных возрастных групп в этот период года составила 1 -2 экземпляра у ягнят текущего года рождения и от 1-3 у молодняка и овцематок. У ягнят цестоды длиной до 1 м диагностировались нами как Moniezia expansa, их обнаруживали в тощей кишке тонкого отдела кишечника. У молодняка и овцематок обнаруженных мониезий диагностировали как М. expansa, так и М. bene-deni.
При гельминтологическом вскрытии 5 ягнят текущего года рождения, павших с клиническими признаками диареи, в тонком отделе ки шечника были выделены трихостронгилиды, интенсивность инвазии которыми составила 1254+241 экземпляров, мониезии выделены не были.
Таким образом, результаты наших исследований показали, что в начале июня ягнята текущего года рождения заражены трихостронги-лидами и мониезиями. То есть, ягнята первого года жизни заражаются данными гельминтозами с первых дней выгона их совместно с овцематками на прикошарные пастбища.
В ветеринарной отчетности района паразитарные болезни не выделены в отдельную графу, а входят в общее число заболеваний органов пищеварения и дыхания, а также нарушений обмена веществ. По данным ветеринарной отчетности в 1996 г. болезни органов дыхания зарегистрированы у 801 голов или в 2,1 % случаев, органов пищеварения у 501 или у 1,3 % , обмена веществ - у 42 или в 0,1 % случаев, вынужденно убито 3452 гол. или 9,1 %. Пало 1422 гол. взрослых и 106 гол. ягнят текущего года рождения, что составило около 4 % от общего количества овец в Мало-Дербетовском районе Калмыкии. В 1997 г. болезни органов пищеварения зарегистрированы у 1175 голов или в 4,9 % случаев, органов дыхания - у 1629 или в 6,8 % случаев, обмена веществ — у 162 или в 0,7 % случаев.
За период 1996-1997 гг. нами было выборочно проведено гельминтологическое вскрытие 125 туш и органов ягнят 2-4 месячного возраста, павших или вынужденно убитых в хозяйствах с признаками заболеваний желудочно-кишечного тракта. Результаты исследований выявили у животных смешанную инвазию различными видами гельминтов. ЭИ инвазии составила 61,6 %, при этом в 70,12 % случаев в желудочно-кишечном тракте были выявлены трихостронгилиды, в 14,2 % случаев -мониезии и в 10,3 % случаев отмечена смешанная трихостронгилидозная и мониезиозная инвазия. В 1,6 % случаев были выявлены цистицерки тенуикольные (рис. 2.1).
Изготовление вакцины против ценуроза овец. Изготовление модифицированной вакцины против ценуроза
Результаты наших исследований позволили предложить изменения в этапы изготовления и состав вакцины против ценуроза.
Измельчение члеников мультицепсов до однородной массы осуществляли на мясорубке с d отверстий решетки 2-3 мм.
Подготовку к освобождению онкосфер от оболочек яйца проводили в искусственном желудочном соке, приготовленном по прописи Н.Е. Косминкова (1986; 1991), а освобождение онкосфер - в искусственном кишечном соке. Измельченную массу мультицепсов, залитую искусственным желудочным соком в соотношении 1:20, помещали в термостат на 1,5-2 часа при температуре +37-38 С. По истечении указанного срока искусственный желудочный сок сливали так, чтобы освободившиеся яйца мультицепсов оставались в осадке.
Яйца мультицепсов переносили в искусственный кишечный сок и вновь помещали в термостат при температуре 37-38 С на 15-20 минут. Таким способом достигается необходимое для освобождения онкосфер мультицепсов чередование кислой среды - желудочного сока и щелочной - кишечного сока. Температура, оптимум которой находится в пределах 37-38 С, способствует разрушению радиальной оболочки яиц мультицепса и вылуплению онкосфер из липоидной (Н.Ь. Косминков, І991; Н.С. Шумова, 1995).
После инкубации в искусственном кишечном соке надосадочную жидкость сливали, а пробы с активированными онкосферами дважды промывали средой культивирования. В качестве среды культивирования использовали среду, состоящую из среды 199, сыворотки крови крупного рогатого скота и антибиотиков - бензилпенициллина натриевой соли, стрептомицина сульфата и нистатина в количестве 150 ЕД/мл, 100 мг/мл и 500 ЕД/мл на 500 мл раствора соответственно.
После отмывания онкосферы центрифугировали при 1,5-2 тыс. об/мин и переносили в свежую среду культивирования.
В ней еще раз промывали свободно движущиеся онкосферы и вновь переносили в свежую среду для культивирования и помещали в термостат с температурой +37-38 С на 48 часов с периодическим перемешиванием культуры. За указанный срок онкосферы превращались в проценурусы.
Через сутки матрасы с культурой просматривали с целью выявления возможного роста посторонней микрофлоры. В случае обнаружения в культуре роста банальной микрофлоры культура уничтожалась. К концу вторых суток матрасы с культурой вновь просматривали на наличие роста банальной микрофлоры. При отсутствии роста микрофлоры в культуре с развившимися в ней проценурусами подсчитывали их число в 1 мл, проводили расчет на одну дозу, затем добавляли адъювант, консервант и разливали вакцину по флаконам.
Одним из факторов, влияющих на развитие онкосфер в среде культивирования, является содержание сыворотки крови в ее составе. Нами бьшо изучено влияние различной концентрации сыворотки крови крупного рогатого скота на процесс культивирования онкосфер. С этой целью часть питательной среды готовили с различными концентрациями в ней сыворотки крови крупного рогатого скота. Были приготовлены растворы с добавлением 5, 8, 10, 15 и 20 % сыворотки крови к общему объему раствора. Результаты опытов представлены в табл. 3.3.
Как видно из данных, представленных в табл. 3.3, концентрация сыворотки крови от 8 до 20 % к общему объему, не приводит к гибели значительного количества онкосфер. При микроскопировании через 48 часов культивирования нами были выявлены сформировавшиеся проце-нурусы, у которых четко просматривалась серповидная полость, расположенная на краю пузыря. Концентрация сыворотки крови 5 % к объему неблагоприятно действует на развитие онкосфер М. multiceps и приводит к гибели до 25,9 % онкосфер в поле зрения. Погибшие онкосферы были сморщенными, темно-серого цвета и уменьшались в размере почти вдвое.
Содержание сыворотки крови крупного рогатого скота в среде культивирования 8 % повышало количество проценурусов в поле зре ния на 4,9 % по сравнению с количеством проценурусов в среде с 5 %-ной концентрацией сыворотки крови. При 10 % -ном содержании сыворотки - на 9 %, при 15 %-ном - на 9,3 % и при 20 %-ном содержании -на 14,5 %. Однако увеличение концентрации сыворотки крови в среде культивирования от 10 до 20 % приводило к более высокой гибели онко-сфер, чем при 8 %-ной концентрации.
Динамика нарастания уровня развившихся проценурусов с учетом погибших в зависимости от концентрации сыворотки крови представлена на рис. 3.3.
Как показано на рис. 3.3, концентрация сыворотки крови 8 % вызывает значительное нарастание уровня развившихся проценусов в среде культивирования. Количество развившихся проценурусов было выше в 1,36 раза, чем при 5 %-ной концентрации сыворотки. Увеличение числа развившихся проценурусов при концентрации от 10 до 15 % незначительное и составляет по отношению к 8 %-ной концентрации 3,8 % и 3,1 % соответственно. При концентрации сыворотки крови 20 % в среде культивирования уровень развившихся проценурусов увеличивается на 8,0 % по сравнению с уровнем проценурусов в среде культивирования при 8 %-ной концентрации. Однако при этом отмечали 5,78 % погибших онкосфер.
В результате проведенных исследований выяснилось, что попытки снизить содержание сыворотки крови крупного рогатого скота в среде культивирования до 5 % не оправданы, т.к. значительное количество (25,9 %) их погибает и не превращается в проценурусы. По всей видимости, такая концентрация сыворотки крови в среде культивирования не является достаточной для всей массы онкосфер.
Концентрация сыворотки крови в среде культивирования в 8, 10, 15 и 20 % практически не влияет на количество развившихся проценурусов. Но, на наш взгляд, безусловно, следует отдать предпочтение 8 %-ной концентрации сыворотки. . Во-первых, вакцина, приготовленная с такой концентрацией сыворотки, содержит меньшее количество балластных белков, вносимых с сывороткой. И, во-вторых, это меньшие экономические затраты на изготовление одной дозы вакцины.
Количество общего белка в надосадочной жидкости, содержащей экскреторно-секреторные антигены, полученные при культивировании онкосфер в среде с содержанием 8 % сыворотки крови, составило 21-23 мг/мл, тогда как в среде с содержанием 10 % сыворотки крови и разрушенных ультразвуком проценурусов (вакцине-прототипе) - 23-25 мг/мл.
Результаты наших исследований позволили предложить следующий состав кулыуральной среды: среда 199 + 8 % сыворотки крови крупного рогатого скота +150 ЕД/мл бензилпенициллина натриевой соли, 100 мг/мл стрептомицина сульфата и 500 ЕД/мл нистатина из расчета на 500 мл среды.
После окончания культивирования визуально просматривали полученный материал на наличие роста банальной микрофлоры. При отсутствии последней проводили подсчет количества развившихся проценурусов в 1 мл полученной культуры. В 1 мл готовой вакцины доллшо содержаться не менее 1900-2100 экземпляров сформировавшихся про-ценурусов (Косминков Н.Е. с соавт., 1986). На основании количества проценурусов в 1 мл вакцины рассчитывали конечный объем полученной партии вакцины.
Изучение эффективности модифицированной вакцины против ценуроза овец при иммунизации ягнят 5-7 месячного возраста
Вторую серию опытов для определения оптимального срока иммунизации ягнят текущего года рождения против ценуроза мы проводили на ягнятах 5-7 месячного возраста, сформированных в третью и четвертую опытные группы по принципу аналогов и выпасавшихся на пастбищах в течение всего выпасного сезона, за 10 дней до отбивки от маток.
Копрологические исследования, проведенные нами, показали, что ягнята опытных групп заражены трихостронгилидами на 71,1 %. Интенсивность инвазии составила в среднем от 49±8 яиц в одном грамме фекалий.
Для подтверждения развития у иммунизированных ягнят 5-7 месячного возраста напряженного иммунного ответа мы провели изучение динамики накопления специфических антител. Исследованию подвергали сыворотки крови 10 ягнят, поставленных в опыт. Исследования проводили до вакцинации, через 20 дней после первого введения вакцины, на 30 и 60 дни после второго. Контролем служили сыворотки крови ягнят до иммунизации.
Сравнительный анализ показаний на мультискане при X = 492 нм с различными разведениями исследуемых сывороток показал, что оптимальным яшшется разведение 1:200 (62,5 мкг белка) и антигена 1:400. Поэтому дальнейшее определение содержание антител в исследуемых сыворотках проводилось в этом разведении.
Содержание антител к модифицированной вакцине против ценуроза (третья опытная группа) и вакцине-прототипе (четвертая опытная группа) в сыворотке крови ягнят, изменялось следующим образом: через 20 дней после первого введения вакцины у животных третьей группы составило 2,92 от первоначального уровня (0,095±0,0004) и 2,84 (0,098±0,004) у ягнят четвертой группы.
Результаты исследований приведены в табл. 4.5.
После повторной вакцинации к 30 дню содержание антител день в сыворотке ягнят третьей и четвертой групп продолжало увеличиваться и составило 0,476+0,023 и 0,490±0,024 (или 5,03 и 5,0 от первоначального уровня соответственно).
К 60 дню после повторной вакцинации содержание антител в сьгооротке крови у вакцинированных животных обеих групп снизилось и составило 0,158±0,002 и 0,151±0,001 соответственно.
Из полученных результатов видно, что модифицированная вакцина против ценуроза обладает иммуногенной активностью, которая сопоставима с антигенной активностью вакцины прототипа и практически не отличается от нее.
Как показали результаты наших исследований, значительных отличий в динамике накопления специфических антител в сыворотке крови вакцинированных модифицированной и вакциной-прототипом овец не отмечается.
Динамика антител в сыворотке вакцинированных модифицированной вакциной против ценуроза и вакциной-прототипом овец представлена на рис. 4.3..
На графике просматривается резкое увеличение содержания антител в сыворотке крови как при иммунизации против ценуроза модифицированной вакциной, так и вакциной-прототипом на 20 день после первого введения вакцины примерно в 2,92 и 2,84 раза, а к 30 дню после второго введения вакцины в среднем в 5 раз. Затем уровень антител в сыворотке начинает снижаться и к 60 дню после второго введения модифицированной вакцины был ниже чем на 30 день в 3 раза, вакцины- прототипа - в 3,2 раза, но выше первоначального уровня в 1,66 и 1,54 раза соответственно.
На 90 день после второго введения модифицированной вакцины против ценуроза и вакцины-прототипа уровень специфических антител снизился до 0,1013+0,001 и 0,100±0,002, что выше первоначального уровня в 1,06 и 1,02 раза соответственно.
Гематологические исследования показали, что у вакцинированных ягнят через 20 дней после первого введения вакцины отмечено пониженное содержание в крови эритроцитов и гемоглобина, и увеличенное содержание лейкоцитов, такие же изменения в крови мы наблюдали и у невакцинированных, спонтанно зараженных трихостронгилидами ягнят по сравнению с невакцинированными, неинвазированными животными (табл. 4.6).
Как видно из представленных данных, у вакцинированных ягнят против ценуроза 5-7 месячного возраста отмечается достоверное (Р 0,05) снижение количества общего белка, эритроцитов, гемоглобина (Р 0,05) по сравнению с контролем. Такая же динамика гематологических показателей отмечена у невакцинированных инвазированных ягнят такого же возраста, у которых в 1 грамме фекалий насчитывали в среднем 36±7 яиц трихостронгилид. Количество лейкоцитов в сыворотке крови вакцинированных ягнят возрастало незначительно (в 1,1 раза) по сравнению с контролем.
Среди вакцинированных 90 голов ягнят 1996 года рождения в возрасте 5-7 месяцев ценуроз в декабре-марте не был зарегистрирован ни у одного животного. При дальнейшем наблюдении за вакцинированными животными было выявлено в апреле следующего года 7 голов (7,7 % от числа вакцинированных) с клиникой ценуроза. У животных отмечали признаки возбуждения, сменяющиеся угнетенным состоянием, отказ от корма, резкое исхудание. Пульс плохого наполнения, слабый, учащенный от 63 до 85 ударов в минуту. Дыхание поверхностное, до 60 движений в минуту. У одного ягненка наблюдали тонические судороги дорсальных мышц шеи и конечностей При патологоанатомическом исследовании мы обнаруживали в головном мозге ценурусные пузыри размером 2,1x2,3 см в диаметре, заполненные прозрачной жидкостью и содержащие розетки сколексов. В участках мозга наблюдали кровенаполнение сосудов мозга. У 2 овец ценурусные пузыри находились в стадии обызвествления. У 1 животного отмечена ценурозно-эстрозная инвазия.
Ценуроз же среди 1800 невакцинированных животных был зарегистрирован в декабре-феврале и в марте-мае следующего 1997 г. Было выявлено 114 овец с признаками ценуроза или 6,3 % от числа невакцинированных. 21,9 % заболело в осенне-зимний период и 78,1 % в весенний. При патологоанатомическом исследовании головного мозга у животных обнаружены ценурусные пузыри с прозрачной жидкостью и сформированными сколексами, при этом в 14 случаях (12,2%) сколексы находились в зачаточном состоянии. У 28 голов отмечена картина воспаления головного мозга в виде слипчивого менингита и гнойного энцефалита. Отмечена также картина атрофии вещества головного мозга. В 7,89 % выявляли наличие личинок оводов в лобных пазухах без обнаружения ценурусньгх пузырей..
Наши данные совпадают с данными Н.Е. Косминкова (1991) и Б.К. Лайпанова (1994), которые также отмечали при исследовании головного мозга гибель ценурусньгх пузырей у овец, вакцішированньгх против ценуроза.
