Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Гиподерматоз крупного рогатого скота 8
1.2. Средства и методы борьбы с гиподерматозом крупного рогатого скота 14
1.3. Резистентность к противопаразитарным препаратам 18
1.4. Эприномектин и его применение в ветеринарной практике 23
2.Собственные исследования
2.1. Материалы и методы 35
2.2. Результаты исследования 54
2.2.1. Разработка лекарственной формы противопаразитарного препарата на основе эприномектина 54
2.2.2. Химико-фармацевтические исследования 56
2.2.3. Изучение стабильности противопаразитарного препарата эприномектина пур-он 62
2.2.4. Изучение острой токсичности препарата эприномектина пур-он в опытах на лабораторных животных 64
2.2.5. Изучение субхронической токсичности эприномектина пур-он в опытах на лабораторных животных 65
2.2.6. Изучение местно-раздражающего действия эприномектина пур-он при нанесении на кожу и слизистые оболочки 69
2.2.7. Изучение эмбриотоксических и тератогенных свойств эприномектина пур-он 70
2.2.8. Оценка аллергизирующего и иммунотоксического действия эприномектина пур-он 71
2.2.9. Изучение субхронической токсичности эприномектина пур-он в опытах на телятах з
2.2.10. Разработка методики определения эприномектина в плазме крови, молоке, органах и тканях животных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии 76
2.2.11. Изучение фармакокинетики эприномектина в плазме крови коров после однократного применения эприномектина пур-он 81
2.2.12. Определение остаточных количеств эприномектина в молоке коров после однократного применения эприномектина пур-он 83
2.2.13. Определение сроков выведения остаточных количеств эприномектина из организма телят после применения эприномектина пур-он 84
2.2.14. Терапевтическая эффективность эприномектина пур-он в производственных условиях 86
3. Обсуждение результатов 92
Выводы 111
Практические предложения 113
Список литературы
- Средства и методы борьбы с гиподерматозом крупного рогатого скота
- Разработка лекарственной формы противопаразитарного препарата на основе эприномектина
- Изучение субхронической токсичности эприномектина пур-он в опытах на лабораторных животных
- Определение остаточных количеств эприномектина в молоке коров после однократного применения эприномектина пур-он
Введение к работе
Актуальность проблемы. Паразитарные болезни животных имеют широкое распространение и наносят мясному и молочному скотоводству значительный экономический ущерб. Одним из основных энтомозов среди паразитарных болезней крупного рогатого скота является гиподерматоз.
Гиподерматоз - хронически протекающее инвазионное заболевание крупного рогатого скота, вызываемое личинками подкожных оводов Hypoderma bovis и Hypoderma lineatum, характеризующееся воспалительными процессами в местах их локализации и общей интоксикацией организма продуктами жизнедеятельности паразита. В результате, развивающегося патологического процесса, уменьшается мясная и молочная продуктивность, теряется ценность кожевенного сырья, а также снижается качество и биологическая ценность, получаемых от инвазированных животных продуктов. (М.В. Воронин, Е.В. Клементьева, 1964; В.П. Хлопицкий, Р.Т. Сафиуллин, 2006; P.J. Scholl 1993).
Учитывая серьезный ущерб, вызываемый личинками оводов, у нас в стране и за рубежом для лечения и профилактики гиподерматоза используется большой ассортимент лекарственных средств различных химических групп. (Ф.И. Василевич, СИ. Стасюкевич, 2013) Препараты отличаются между собой структурой, механизмом действия, характером метаболизма в организме и продолжительностью остаточного действия, токсичностью для животных и человека, уровнем вреда, наносимого окружающей среде.
В последние годы широкое распространение против личинок подкожных оводов получили лекарственные средства на основе авермектинов и, в первую очередь, ивермектина, более 20 которых зарегистрированы в Российской Федерации. Препараты на основе авермектинов обладают высокой эффективностью, широким спектром действия (инсектицидная, акарицидная и нематоцидная активность), относительно низкой токсичностью для млекопитающих и достаточной экологической безопасностью, поэтому по совокупности положительных свойств сегодня являются эталонными противопаразитарными средствами (J. Vercruysse, R.S. Rew 2002).
Авермектины ничем не отличаются от других лекарственных средств, к действию которых в соответствии с эволюционными процессами рано или поздно возникают устойчивые организмы. Поэтому, начиная с конца 80-х годов прошлого века, появились первые сообщения о формировании у паразитов резистентности к ивермектину. В последнее время количество таких публикаций резко возросло, особенно из стран, где ивермектин и другие авермектиновые препараты широко применяются. (I. Carmichael et al. 1987; N.C. Sangster 1999; С. Entrocasso et al, 2008; C.R. Reinemeyer et al, 2010; L.C. Perez-Cogollo et al, 2010). Учитывая, что в России, ивермектины используются очень широко и без ограничений, тем более, иногда в заниженных в десятки раз дозах, вероятность появления ивермектинрезистентных паразитов достаточно высока.
Одним из наиболее рациональных принципов современной химиотерапии в отношении воздействия на резистентных паразитов и повышения эффективности противопаразитарных лекарственных средств, является применение новых или модифицированных молекул известных химических соединений, к которым
паразиты еще не сформировали механизмов устойчивости. Поэтому нам представлялось актуальным разработать новое высокоэффективное лекарственное средство для лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота на основе структурно измененного ивермектина - эприномектина, представляющего собой полусинтетический макроциклический лактон, состоящий из двух гомологичных компонентов Віа - не менее 90% и Віь - не более 10%. (М.Н. Fisher 1990).
В доступной литературе отсутствуют сведения о возможной перекрестной резистентности между ивермектином и эприномектином, что, возможно, связано с наличием в молекуле эприномектина метиленовой группы в положении С-25.
При выборе лекарственной формы для борьбы с гиподерматозом крупного рогатого скота мы остановились на растворе для наружного применения «pour-on», применяемом путем нанесения на ограниченную поверхность кожи, как правило, в области позвоночника. Эприномектин, благодаря своей химической структуре и выраженными липофильными свойствами из пур-она должен диффундировать через кожу в подкожную клетчатку, откуда в дальнейшем разносится с током крови по всему организму. Высокие концентрации препарата, в первую очередь, в подкожной клетчатке - месте локализации гиподерм на личиночной стадии развития, обеспечат эффективное воздействие эприномектина на паразита.
Цель и задачи исследования.
Цель наших исследований заключалась в разработке лекарственного препарата на основе эприномектина в форме раствора для наружного применения пур-он (далее по тексту эприномектин пур-он), предназначенного для лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота
Для достижения поставленной цели нами были определены следующие задачи:
обосновать состав лекарственной формы, определить требования к показателям качества препарата и разработать методы их контроля;
изучить физико-химические свойства и стабильность эприномектина пур-он в процессе хранения;
определить параметры токсичности и изучить токсикологические свойства эприномектина пур-он в остром и субхроническом экспериментах на лабораторных животных и телятах;
изучить фармакокинетику и установить сроки выведения остаточных количеств эприномектина из организма крупного рогатого скота после применения эприномектина пур-он;
определить оптимальную терапевтическую дозу и разработать схему применения эприномектина пур-он при гиподерматозе крупного рогатого скота;
оценить эффективность и безопасность эприномектина пур-он в условиях производства при гиподерматозе крупного рогатого скота.
Научная новизна. Впервые разработан отечественный лекарственный препарат на основе эприномектина в форме раствора для наружного применения пур-он для лечения и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота.
Изучены физико-химические, фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность препарата при гипо дерматозе. Установлены особенности распределения, накопления в тканях и органах и сроки выведения остаточных количеств эприномектина из организма животных после применения эприномектина пур-он. В условиях животноводческих хозяйств подтверждена эффективность и безопасность препарата при оводовых инвазиях крупного рогатого скота.
Практическая значимость работы. Разработан, стандартизирован и предложен для лечения гиподерматоза крупного рогатого скота новый отечественный препарат на основе эприномектина в форме раствора для наружного применения пур-он.
Для стандартизации препарата разработаны качественные и количественные методы контроля эприномектина пур-он. Установлен срок годности лекарственного средства.
Разработан метод высокоэффективной жидкостной хроматографии определения остаточных количеств эприномектина в плазме, молоке, органах и тканях животных, позволивший установить сроки возможного использования в пищу человека продукции животноводства, полученной от животных обработанных эприномектина пур-он.
Установлены эффективные терапевтические дозы и разработана схема обработок крупного рогатого скота эприномектином пур-он при гипо дерматозе.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на следующих научно-практических конференциях:
III Международная научно-практическая конференция: «Ветеринарные препараты: разработка, контроль качества и применение», доклад «Фармакокинетика эприномектина в плазме крови коров», г. Львов, 2009 г.
III Международная научно-практическая конференция «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях», стендовый доклад «Эффективность Эпринель пур-он при гиподерматозе крупного рогатого скота», г. Москва, 2011 г.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа является результатом научной работы в период 2009-2013 гг. Работа по разработке новой лекарственной формы эприномектина форме пур-она основана на проведении комплекса исследований, связанных с оценкой качества готового препарата, изучения его стабильности в процессе хранения, оценки безопасности препарата в острых и хронических опытах на лабораторных и сельскохозяйственных животных, изучении фармакокинетики и сроков выведения остаточных количеств эприномектина из организма животных, изучении терапевтической эффективности лекарственного средства в производственных условиях при гиподерматозе крупного рогатого скота выполнены автором самостоятельно под научно-методическим руководством академика РАН, д.вет.н. Ф.И. Василевича и к.вет.н., старшего научного сотрудника Б.В. Виолина, которые оказывали помощь в выборе современных методов исследований и анализе полученных результатов.
В четырех публикациях включено более 80% материалов исследований, представленных в диссертационной работе. Соавторы не возражают против использования результатов совместной работы.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- научное обоснование состава и лекарственной формы препарата на основе
эприномектина, показатели качества и методы их контроля, результаты изучения
стабильности препарата в процессе хранения;
- характеристика фармакологических и токсикологических свойств
эприномектина пур-он по результатам исследований в опытах на лабораторных
животных и телятах;
- результаты изучения фармакокинетики и динамики выведения остаточных
количеств эприномектина из организма животных после применения
эприномектина пур-он;
- практические предложения по применению пур-она на основе
эприномектина в ветеринарной практике.
Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре научные работы, в том числе, три в изданиях, рекомендованных ВАК России, и одна статья в издании, рекомендованном ВАК Украины.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 142 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 9 графиками. Список литературы содержит 306 источников, в том числе 201 иностранных.
Средства и методы борьбы с гиподерматозом крупного рогатого скота
Во Франции привесы бычков, пораженных 11-15 личинками овода, за месяц составляли 84±18 кг, тогда как животные, пораженных меньшим количеством личинок (меньше 10), давали привесы 102±15 кг (153, 274). В Америке средние привесы здоровых животных составляют 1,03 кг в сутки, тогда как больных - 0,89 кг (201).
При зачистке поверхности туш, поврежденных личинками оводов и непригодных в пишу тканей, потери мяса сильно колеблются - от 200 г при слабом поражении и до 6-7 кг при гнойно-некротическом поражениям в местах локализации личинок на одну зачищенную тушу (22, 41). В Канаде при зачистке туши, пораженной 1-5 личинками, потери составляют 0,7 кг, а при зачистке туши, пораженной 11 и более личинками - до 1,2 кг (247). R.S. Collins и L.W. Dewhirst (1971) сообщают, что потери от зачистки мяса 111893 пораженных туш в 1968 году составили 413188 долларов (143).
Стоимость шкур крупного рогатого скота, поврежденных личинками овода, значительно снижается. После выпадения личинок происходит лишь видимое заживление свищей, но полного восстановления структуры кожи не происходит. Поэтому товарная стоимость шкур резко снижается. Потери от открытых свищей составляют от 8% до 30% от всех заготовленных шкур крупного рогатого скота. При этом негодной для кожевенного сырья оказывается самая востребованная «хребтовая» часть шкуры. Ценность шкур со свищевыми отверстиями снижается на 60-80% (57, 62).
В кожевенной промышленности Германии гиподерматозные шкуры или не используются, или их потенциальная стоимость уменьшается на треть, в связи с чем потери составляют ежегодно более миллиона немецких марок (207).
В результате паразитирования личинок подкожного овода снижается иммунитет у животных (275). Вынужденный убой скота из-за паразитирова 11 ния личинок оводов в спинномозговом канале, приводящий к параличу, также приводит к значительным убыткам (293).
Ущерб, вызванный гиподерматозом, является серьезной национальной проблемой в странах, где животноводство составляет существенную часть экономики. В США в 1972 году потери были оценены в 192 миллиона долларов (206), а уже в 1980 г. - в 600 миллионов долларов (154). Потери Франции от гиподерматоза крупного рогатого скота в 1984 году составили, примерно, 200 миллионов франков (216), в Австрии - 100 миллионов шиллингов, в Греции в 1992 году - 42 миллиона долларов (202). В России потери от гиподерматоза оцениваются примерно в 6,5 млрд. рублей в год (5).
Таким образом, подкожные оводы, даже при низкой численности, наносят огромный ущерб животноводству и перерабатывающим предприятиям (35).
Для достижения успеха в борьбе с гиподерматозом необходимо определить оптимальные сроки проведения обработок животных, которые могут быть обоснованы только с учетом биологического цикла развития паразита (50,58).
Свой жизненный цикл оводы проходят в течение года за четыре фазы -яйца, личинки (1, 2-ой и 3-ей стадий), куколки и имаго (28, 77, 259). Отсутствие ротового аппарата у взрослых особей не позволяет им питаться, и продолжительность их жизни в течение 3-28 дней во многом определяется запасом питательных веществ накопленных в личиночную стадию (28 , 82, 273).
Лет оводов Hypoderma bovis начинается с мая, позже, чем у оводов Hypoderma lineatum, лет которых начинается с конца апреля (82).
Оплодотворенная самка Hypoderma bovis откладывает в течение жизни до 670 яиц, прикрепляя их к волосу животного по одному яйцу, в то время как самка Hypoderma lineatum откладывает до 490 яиц, прикрепляя их по 5-20 яиц в один ряд. Откладку яиц самки осуществляют на участки тела животного с коротким волосяным покровом: в области голодной ямки, паха, передней части ребер, мягкой стенки живота (28, 39, 82). Развитие личинок внутри яйца при оптимальной температуре 30-32 С у Hypoderma bovis завершается за 3-5 дней, а у Hypoderma lineatum - за 3-6 дней (34, 38, 213).
На месте внедрения личинки образуется ранка, которая через некоторое время покрывается струпом. Сразу после проникновения через кожу личинки 1-стадии в процессе своей жизнедеятельности начинают раздражать ткани, вызывая зуд, боль и отек подкожной клетчатки (27, 28, 33, 52, 86, 120). Перемещаясь вдоль нервов и крупных сосудов через межпозвоночные отверстия личинки Hypoderma bovis локализуются в жировой ткани спинномозгового канала, а личинки Hypoderma lineatum - в подслизистом слое пищевода (12, 23 , 33, 53, 94). Во время своего перемещения личинки вызывают повреждение тканей, разрывы кровеносных сосудов с выпотеванием экссудата и форменных элементов крови, что в дальнейшем приводит к развитию воспалительных процессов, характеризующихся отечностью, болезненностью, нарушением функций пораженного органа.
Скопление большого количества личинок Hypoderma bovis в спинномозговом канале в случае их гибели приводит к выделению высокотоксичного протеолизина, вызывающего паралич задних конечностей животного. Погибшие личинки постепенно рассасываются, а их кутикулы инкапсулируются с последующим обызвествлением.
Разработка лекарственной формы противопаразитарного препарата на основе эприномектина
Фармакокинетику эприномектина пур-он изучали на 10 коровах черно-пестрой породы (возраст от 2 до 5 лет, масса от 470 до 550 кг), разделенных по принципу аналогов на две равные группы в ОНО «Московская селекционная станция» (Московская область, Серебряно-Прудский район). Первой группе животных в области позвоночника однократно накожно наносили пур-он в дозе 0,5 мг/кг массы тела (1 мл препарата на 10 кг массы тела), второй группе - в дозе 0,2 мг/кг массы тела (1 мл препарата на 25 кг массы тела).
Отбор проб крови проводили до нанесения препарата и через 12, 24, 72, 120, 168, 240 и 336 часов после нанесения.
Количественное определение эприномектина в плазме крови проводили методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием после деривати-зации в соответствии с пунктом 2.1.10 и 2.2.10.
Определение остаточных количеств эприномектина в молоке после однократного нанесения пур-она изучали на 10 коровах черно-пестрой породы (возраст от 2 до 5 лет, масса от 470 до 550 кг), разделенных по принципу аналогов на две равные группы в ОНО «Московская селекционная станция» (Московская область, Серебряно-Прудский район). Первой группе животных в области позвоночника однократно накожно наносили пур-он в дозе 0,5 мг/кг массы тела (1 мл препарата на 10 кг массы тела), второй группе - в дозе 0,2 мг/кг массы тела (1 мл препарата на 25 кг массы тела).
У коров обеих опытных групп в утреннюю дойку отбирали средние пробы молока через 0, 12, 24, 72, 120, 168, 240 и 336 часов после нанесения препарата. До анализа образцы хранили при температуре минус 20С.
Количественное определение эприномектина в молоке проводили методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием после дериватизации в соответствии с пунктом 2.1.10 и 2.2.10.
Изучение сроков выведения остаточных количеств эприномектина проводили на 12 телятах голштино-фризской породы 1-2 месячного возраста массой тела 80-100 кг. Содержание животных было привязным. Температура в помещении составляла 20+2С, влажность воздуха - 65+5%. Рацион состоял из объемистых кормов (силос и сенаж) с добавлением концентратов (размолотый ячмень и пшеница). Потребление животными воды было без ограничений.
Телятам однократно наружно на спину, распределяя вдоль позвоночного столба (от холки до крестца) наносили эприномектина пур-он в максимальной терапевтической в дозе 1 мл/10 кг массы тела (0,5 мг/кг по действующему веществу).
На 1, 3, 5 и 7 сутки после нанесения препарата проводили убой 3-х телят. От каждого животного в отдельные контейнеры с этикетками отбирали для исследования пробы печени, почек, мышечной (из задней части туши и непосредственно под местом нанесения препарата) и жировой ткани. До анализа пробы хранили при минус 20С.
Пробы органов и тканей анализировали на содержание эприномектина, разработанным методом ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием после дериватизации в соответствии с пунктом 2.1.10и2.2.10. 2.1.14. Терапевтическая эффективность эприномектина пур-он в производственных условиях
Терапевтическую эффективность и определение оптимальной терапевтической дозы эприномектина пур-он изучали в Саратовской области в 4 хозяйствах Лысогорского района (КФХ «Филиченков О.В.» село Бутырки; «КФХ Науменко» и «КФХ Гресева» село Широкий Карамыш; СГЖ «Колхоз Красавский» село Новая Красавка) и 4 хозяйствах Марксовского районов (ЗАО «Агрофирма» Волга» село Звонаревка, ЗАО «Зоринское» село Поля-ковское, КФХ «Опыт» село Каменка и КФХ «Ягода» поселок Колос), которые являются неблагополучными по гиподерматозу крупного рогатого скота. В шести хозяйствах оценивали эффективность эприномектина пур-он при осенней обработке (сентябрь-октябрь 2009 г) с профилактической целью и в двух хозяйствах - при весенней обработке (март 2010 г) с лечебной целью. Учет результатов проводили в апреле-мае 2010 г. Экстенсивность инвазии в данных хозяйствах составляла 75-93,6 %, интенсивность варьировала от 5,8 до 11,5 личинок на голову.
Поражение животных опытной и контрольных групп личинками подкожного овода устанавливали методом осмотра и пальпации кожи в области спины и крупа.
Критерием оценки эффективности эприномектина пур-он служили рассчитанные значения экстенсэффективности (ЭЭ) и интенсэффективности (ИЭ), полученные сравнением опытных и контрольных групп по показателям экстенсивности и интенсивности инвазии определенные по общепринятой методике, разработанной А.А. Непоклоновым и Г.А. Талановым (1967). Экстенсивность инвазии - это процент животных, пораженных личинками оводов по отношению к количеству исследуемых животных. Интенсивность инвазии - это количество личинок оводов на одну пораженную голову, которую определяли по среднему количеству желваков на одно животное в контрольной группе. Для установления оптимальной дозы коров массой тела 450-550 кг обрабатывали эприномектина пур-оном в дозах 0,2 или 0,5 мг/кг массы животного по ДВ, что соответственно составляло 20 или 50 мл/голову. Препарат наносили однократно путем поливания тонкой струйкой вдоль позвоночного столба с профилактической целью против личинок I стадии перед постановкой животных на стойловое содержание (сентябрь-октябрь) и с лечебной целью против личинок II и III стадий - весной (март).
В качестве препаратов сравнения использовали 0,01 % ивермектин пур-он «гиподектин-н» в дозе 20 мл/голову (0,004 мг/кг по ДВ) и 1% раствор ивермектина для инъекций (ивермек) в дозе 1 мл/50 кг массы животного (0,2 мг/кг по ДВ), которые применяли в соответствии с инструкциями, утвержденными Россельхознадзором в установленном порядке. Контрольные группы животных лекарственными средствами против гиподерматоза не обрабатывали. Статистический анализ полученных результатов выполняли с помощью вариационной статистики по методу Стьюдента.
Изучение субхронической токсичности эприномектина пур-он в опытах на лабораторных животных
Кратность нанесения эприномектина пур-он (5 суток) не оказывала влияния на проявление побочных эффектов.
В течение всего опытного периода температура тела у телят группы 1 находилась в пределах 38,7- 38,8С; группы 2 — 38,54-38,7С; группы 3 — 38,4-г38,9С, в то время, как средняя температура тела у телят всех групп до применения эприномектина пур-он составляла 38,5-г38,8С.
До опыта у опытных животных частота пульса равнялась 554-65 ударов/мин; во время и после применения препарата значения данного показателя у телят, которым эприномектина пур-он наносили в терапевтической дозе, находились в пределах 55-г61 ударов/мин; в двукратной терапевтической дозе — 55- 65 ударов/мин, в пятикратной терапевтической дозе — 55-г65 ударов/мин. Во всех случаях разброс значений клинических показателей у телят в период после применения эприномектина пур-он был сопоставим с исходным уровнем. Все клинические показатели во всех случаях находились в пределах физиологической нормы и соответствовали данной возрастной группы.
В таблицах 2.1.-2.3. приложения 1 приведены результаты определения гематологических показателей у телят, которым эприномектина пур-он наносили в терапевтической, двукратной и пятикратной терапевтических дозах.
Применение исследуемого препарата не отразилось отрицательно на показателях периферической крови. Например, уровень гемоглобина до нанесения препарата в максимальной терапевтической дозе составлял 111,20±2,48 г/л, а через 1; 5 и 10 суток после последнего введения эприномектина пур-он составлял соответственно 112,60±1,29; 115,00±3,11 и 111,60±2,09 (таблица 2.1.; во всех случаях Р 0,05).
В отношении форменных элементов крови: например, содержание эритроцитов и лейкоцитов в период до применения эприномектина пур-он равнялось соответственно 5,24±0,38 (1012/л) и 10,00±0,86 (10%). Через 1; 5 и 10 суток после последнего нанесения препарата количество эритроцитов и лейкоцитов достоверно не изменилось (соответственно в указанном порядке: 5,82±0,24; 5,68±0,20 и 5,44±0,39 (1012/л) и 9,46±0,78; 9,34±1,02 и 9,40±1,13 (109/л) (таблица 2.1. приложение 1).
Повышение дозы в 2 и 5 раз также не отразилось на гематологических показателях у опытных телят групп 2 и 3 (таблицы 2.2. и 2.3. приложение 1).
Активность аланинамино- и аспартатаминотрансферазы (АЛТ и ACT) традиционно и обоснованно рассматривают в качестве индикатора функционального состояния печени. При нанесении препарата в терапевтической и повышенной в 2 и 5 раз дозах активность в различные периоды опыта (1; 5 и 10 суток) равнялась соответственно 41,00±4,34; 46,00±3,36; 41,40±4,26 против 49,60±1,03 Ед/л до введения препарата (таблица 2.4 приложения 2); 33,60±4,65, 42,20±1,88, 36,80±1,83 против 41,40±2,54 Ед/л (таблица 2.5. приложения 2) и 37,20±3,69, 37,80±3,28, 38,80±2,24 против 45,20±2,96 Ед/л (таблица 2.6. приложения 2). Отсутствовали изменения активности второго «печеночного» фермента, т.е. аспартатаминотрансферазы (таблицы 2.4.-2.6 приложение 1.).
Через 1; 5 и 10 суток после последнего нанесения препарата уровень мочевины составил соответственно по группам 2,06±0,35, 2,22±0,22 и 2,32±0,17 против 2,78±0,18 мкмоль/л в период до введения препарата (таблица 2.4. приложения 2); 2,04±0,14, 1,96±0,22 и 1,82±0,15 против 2,34±0,21 мкмоль/л (таблица 2.5. приложения 2); 2Д0±0,15, 1,86±0,13 и 1,82±0,06 против 2,20±0,19 мкмоль/л (таблица 2.6. приложение 1).
Содержание креатинина у телят группы 1 в указанные интервалы равнялось 94,20±6,44, 94,80±5,46 и 90,60±8,40 против 114,40±6,22 мкмоль/л на 0 сутки; у телят группы 2 — 91,40±5,08, 98,40±6,79 и 86,00±7,44 против 105,20±5,08 мкмоль/л; у телят группы 3 — 93,00±6,21, 91,40±7,01 и 91,40±7,28 против 104,60±2,82 мкмоль/л (таблицы 2.4.-2.6. приложение 1). Содержание мочевой кислоты в сыворотке крови не различалось у телят до и после нанесения эприномектина пур-он во всех трех дозах.
С учетом приведенного анализа полученных данных можно заключить, что эприномектина пур-он при многократном введении в дозах от максимальной терапевтической до пятикратной терапевтической в условиях субхронического эксперимента не оказывает отрицательного влияния на состояние организма телят.
Подготовка проб к определению. Экстракция и очистка экстрактов проб плазмы и молока Молоко или плазму крови в объеме 1 мл помещали в гомогенизатор, добавляли 3 мл смеси этиловый спирт-вода в соотношении 1:1. Обработку проводили при 4500 об/мин в течение 15 минут. Из полученной эмульсии эприномектин экстрагировали этилацетатом 2 раза порциями по 8 мл. Экстракцию вели в сцинтилляционных флаконах при встряхивании с последующим центрифугированием.
Этилацетатный экстракт (верхний слой) отбирали пипеткой и переносили в чистый сцинтилляционный флакон вместимостью 20 мл. Этилацетат упаривали на Vortex при температуре не выше 50С. Сухой остаток растворяли в 4 мл ацетонитрила (растворение проводили на ультразвуковой бане). Ацетонитрильныи раствор 3-5 раз промывали 3-4 мл гексана. Гексановые экстракты (верхний слой) отбирали пипеткой и отбрасывали, а ацетонитрильныи раствор помещали в стеклянную пробирку объемом 10 мл и упаривали в токе азота в системе Vortex досуха при температуре не выше 50С. Сухой остаток использовали для проведения дериватизации.
Определение остаточных количеств эприномектина в молоке коров после однократного применения эприномектина пур-он
При многократных аппликациях тестируемого препарата кроликам появляется кратковременное слабое покраснение кожи (раздражающее действие). Подобная реакция не имеет практического значения, так как пур-он рекомендован для однократного применения.
Эприномектин пур-он в трехкратной терапевтической дозе (1,5 мг/кг по эприномектину ) при нанесении крысам на кожу в период с 1 по 19 день ге-стации не оказывает эмбриотоксического и тератогенного действия, о чем свидетельствует отсутствие достоверных различий (Р 0,05) между опытными и контрольной группой по показателям количество плодов, мест имплантации и желтых тел, масса тела эмбрионов и их кранио-каудальный размер, масса и размер плаценты, общей эмбриональной смертности и пред- и пост-имплантационной гибели плодов. Результаты наших исследований совпадают с данными Committee for veterinary medicinal products. Eprinomectin. Summary report (1). EMEA/114/96-FINAL June 1996, в которых эприномектин в дозах 12 и 8 мг/кг при пероральном введении соответственно крысам и кроликам в период 6-17 дни беременности не проявил эмбриотоксического и тератогенного действия (162).
Эприномектин пур-он по данным наших исследований не приводит к сенсибилизации, не проявляет аллергизирующего действия немедленного и замедленного типа и не оказывает иммунотоксического влияния на животных.
При оценке безопасности эприномектин пур-она для телят при пятидневном нанесении в максимальной терапевтической дозе и дозах, превышающих терапевтическую в 2 и 5 раз (соответственно 0,5; 1; 2,5 мг/кг массы тела по действующему веществу) гибели животных не отмечали.
Основные физиологические показатели (температура тела, частота сердечных сокращений), гематологические и биохимические показатели сыворотки крови телят оставались в пределах нормы и достоверно (р 0,05) не отличались от контроля (среднее значение показателей у телят всех групп до применения препарата). Таким образом, применение эприномектина пур-он в максимальной терапевтической (1 мл/10 кг массы тела), двукратной терапевтической (2 мл/10 кг массы тела) и пятикратной терапевтической (5 мл/10 кг массы тела) дозах в течение 5 суток не вызывает функциональных изменений в организме телят.
Учитывая, что пур-он в ветеринарной практике будет применяться однократно, даже случайная передозировка лекарственного средства не должна будет привести к развитию побочного действия или к серьезной нежелательной реакции.
Разработан метод количественного определения эприномектина в продуктах животноводства (органы и ткани животных, молоко) и плазме крови с нижним пределом измерения 1 мг/кг, который был включен в проект «Методические указания. Определение массовой концентрации эприномектина в плазме крови, молоке, органах и тканях животных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии» и может быть использован для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции учреждениями госсанэпидслужбы Российской Федерации, а также для предприятий и учреждений, осуществляющих контроль качества пищевых продуктов в соответствии с Санитарными правилами и нормами «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. СанПиН 2.3.2.560-96».
Метод основан на определении эприномектина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием флуоресцентного детектора на колонке с обращенной фазой после его экстракции из образцов плазмы, молока, органов и тканей животных органическими растворителями и очистки методом твердофазной экстракции, либо перераспределением между двумя несмешивающимися фазами. Полнота извлечения эприномектина из образцов крови, молока, печени, почек, мышц и жира составила соответственно 83,1; 84,9; 65,8; 84,5; 74,3 и 92,4%. Измерение массовой концен 103 трации эприномектина основано на получении флуоресцирующих производных путем их дериватизации 1-метилимидазолом и уксусным ангидридом. Чувствительность метода составляет 0,1 нг в пробе, нанесенной на колонку (таблица 26).
Предложенный метод был использован для изучения фармакокинетики эприномектина в организме коров, определения сроков возможного убоя животных и использования молока после применения эприномектина пур-он.
Полученные экспериментальные данные по фармакокинетике эприномектина в плазме крови были подвергнуты математической статистической обработке с помощью программы «Statistica v.5.5».
Для расчетов фармакокинетических параметров был использован мо-дельно-независимый метод с использованием программы «M-IND», которая позволяет проводить первичную обработку данных «концентрация-время» в плазме/сыворотке крови при различных способах введения и рассчитывать системные параметры лекарственного вещества методом статистических моментов. В основе модельно-независимого метода статистических моментов лежит оценка площади под концентрационной кривой лекарственного вещества в плазме/сыворотке крови - AUC (Area Under Curve), площади под кривой «произведение времени на концентрацию-время» - AUMC (Area Under Multiplication Curve).
