Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Антгельминтное действие салициланилидов 8
1.2. Токсикологическая характеристика препаратов, производных салициланилидов 29
2. Собственные исследования 41
2.1. Материалы и методы 41
2.1.1. Схемы проведения опытов по скринингу ряда соединений из различных химических групп на цестодо-цидную и нематодоцидную активность 41
2.1.2. Схемы опытов по оценке токсических свойств тенала 42
2.1.3. Проведение опытов по снятию эмбриотоксического действия тенала при однократном и многократном введении 48
2.1.4. Опыты по определению острой токсичности комбинаций тенала с глицином и сернокислой медью 49
2.1.5. Определение терапевтической эффективности смесей тенала на белых мышах, экспериментально инвазированных Hymenolepis nana 50
2.1.6. Ограниченный опыт по оценке эффективности тенала и его комбинаций с глицином и сернокислой медью при мониезиозе овец 50
2.1.7. Статистическая обработка 51
2.2. Результаты исследований 51
2.2.1. Цестодоцидная и нематодоцидная активность ряда соединений из различных химических групп 51
2.2.1.1. Оценка цестодоцидной активности на мышах, зараженных Hymenolepis nana 52
2.2.1.2. Оценка нематодоцидной активности на мышах, зараженных Trichinella spiralis 55
2.2.2. Токсикологическая характеристика тенала 57
2.2.2.1. Острая токсичность тенала при введении в желудок 57
2.2.2.2. Острое токсическое действие тенала при нанесении на кожу 59
2.2.2.3. Раздражающее действие на кожу и слизистые 59
2.2.2.4. Кумулятивные свойства тенала 60
2.2.2.5. Подострая токсичность тенала 61
2.2.2.6. Оценка тенала на эмбриотоксическое и тератогенное действие 71
2.2.2.7. Цитогенетическое действие тенала 77
2.2.3. Снятие эмбриотоксического действия тенала при комбинированном введении с глицином и сернокислой медью 80
2.2.4. Краткая токсикологическая и терапевтическая характеристика смесей тенала с глицином и сернокислой медью 89
2.2.5. Первичное испытание тенала и его комбинаций с глицином и сернокислой медью при мониезиозе овец 91
Обсуждение 93
Выводы 102
Практические предложения 105
Список литературы 106
Приложение 122
- Токсикологическая характеристика препаратов, производных салициланилидов
- Схемы проведения опытов по скринингу ряда соединений из различных химических групп на цестодо-цидную и нематодоцидную активность
- Снятие эмбриотоксического действия тенала при комбинированном введении с глицином и сернокислой медью
- Первичное испытание тенала и его комбинаций с глицином и сернокислой медью при мониезиозе овец
Введение к работе
Актуальность проблемы. Рынок противопаразитарных средств с выраженным цестодоцидным и нематодоцидным действием на первый взгляд поражает довольно большим изобилием и широтой. Казалось бы, можно найти препараты с любой лечебной и профилактической направленностью, которые в полной мере отвечали конкретным поставленным целям, задачам и ситуациям для обработки животных. Однако при более близком и детальном рассмотрении ассортимента современных ант-гельминтиков можно придти к ряду довольно неутешительных выводов. Во-первых, среди данных препаратов довольно мало качественных средств отечественного производства, которые были бы доступны, отличались высокой эффективностью, безопасностью и приемлемой ценой. Во-вторых, многие антгельминтики являются морально устаревшими и уже не отвечают жестким современным требованиям в отношении сочетания полезной терапевтической эффективности и безопасности в самом широком понимании.
Исходя из вышесказанного, создание и разработка новых противопаразитарных средств всегда является востребованной и весьма актуальной исследовательской задачей.
В наше распоряжение был представлен целый ряд новых, синтезированных в ВИГИСе и МГУ соединений из различных химических классов, которые в силу ряда причин представляли собой вполне реальный и возможный источник получения нового перспективного отечественного препарата. В случае обнаружения при этом эффективного соединения весьма логичной нам представлялась следующая схема дальнейших исследований: оценка его переносимости, детальная токсикологическая характеристика препарата и испытание эффективности.
Все вышеуказанное определяет актуальность темы работы и обосновывает целесообразность проведения наших исследований. Цель и задачи исследований. Отправной целью настоящих исследований было проведение скрининга ряда соединений на цестодоцидную и нематодоцидную активность соответственно на лабораторных моделях на мышах, зараженных гименолеписами и трихинеллами. Поскольку в результате проведенного скрининга было выявлено новое химическое соединение (впоследствии названное теналом), показавшее высокую эффективность против цестод и имеющее явную перспективу для применения в качестве субстанции антгельминтиков, необходимо было решить целый ряд следующих задач:
• определение параметров острой токсичности тенала при введении в желудок и нанесении на кожу;
• оценка кумулятивных свойств тенала;
• исследование подострой токсичности препарата;
• оценка тенала на некоторые специфические эффекты (эмбрио-токсическое, тератогенное и мутагенное действие);
• создание лекарственных композиций на основе тенала с целью «снятия» эмбриотоксических свойств препарата;
• оценка острой токсичности двух композиций тенала с глицином и сернокислой меди при введении в желудок;
• исследование эффективности композиций тенала при гимено-лепидозе мышей;
• первичное испытание эффективности тенала (субстанции) и лекарственных композиций на его основе при мониезиозе овец.
Научная новизна.
• В результате скрининга на мышах, зараженных гименолеписами,
найдено новое соединение, в химическом отношении представляющее собой
3,5-дибромсалициловую кислоту, обладающее 100% эффективностью на
данной модели, и названное теналом. • Проведена детальная токсикологическая оценка тенала с исследованием параметров острой токсичности, кумулятивных свойств, подострой токсичности и некоторых специфических эффектов.
• Изысканы средства (глицин и сернокислая медь) для полного предупреждения эмбриотоксического эффекта тенала.
• Созданы и получили первичную оценку лекарственные композиции на основе тенала, глицина или сернокислой меди.
• Оценена эффективность тенала и его композиций при мониезиозе овец, которая во всех случаях составила 100%.
Практическая значимость. Результаты исследований являются основой для внедрения в широкую ветеринарную практику новой субстанции тенала и его лекарственных композиций для лечения и профилактики цестодозов сельскохозяйственных животных.
Данные, полученные в ходе исследований, представляют собой основу материалов, предназначенных для регистрации препаратов.
«Методические указания по применению композиций тенала с глицином и сернокислой медью при мониезиозе овец» утверждены на секции «Инвазионные болезни животных» РАСХН 1.03.2007 г.
По материалам диссертации получен патент «Антгельминтное средство» № 2242976 от 27 декабря 2004 г.
Апробация работы. Результаты исследований были неоднократно представлены на отчетных научных конференциях ВИГИС и научных конференциях «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями животных» (2003, 2006 гг.).
Основные положения, выносимые на защиту:
• Результаты скрининга ряда соединений из различных химических классов на нематодоцидную и цестодоцидную активность.
• Особенности токсических свойств тенала.
• Лекарственные композиции на основе тенала и их характеристика. • Эффективность тенала (субстанции) и композиций на его основе при мониезиозе овец.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных статей.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Список литературы включает 158 источников, в том числе 85 отечественных и 73 иностранных. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 14 рисунками.
Токсикологическая характеристика препаратов, производных салициланилидов
С учетом тематики наших собственных исследований токсикологическая характеристика препаратов из группы салициланилидов имеет особое значение. Аналитический обзор этой совокупности литературных данных вновь начнем с фенасала (или его аналогов).
Даже первичный анализ литературных данных по изучению токсических свойств фенасала свидетельствует, что фенасал (йомезан) является практически нетоксичным антгельминтиком для человека и животных. По данным F.J.Aquelar et al. (1961); F.J.Aquelar (1962); H.F.Nagaty, H.M.Khalil (1961); H.F.Nagaty, M.A.Rifaat, S.Salem (1962); J.Lapierre (1963); J.Schneider (1963); Х.И.Сейфуллы (1964), Н.В.Гриненко (1964), A.Beier (1966); А.М.Абдуллаева (1966; 1967) и др. больные переносят препарат без побочных явлений. Наблюдаемые иногда при лечении препаратом головные боли, тошнота или рвота и боли в животе связаны с всасыванием токсических веществ, образующихся при разрушении тела гельминта. Имеются наблюдения (J.Lapierre, 1963; Н.В.Гриненко, 1964; Н.Е.Ковалев, 1966), что фенасал хорошо переносится маленькими детьми, беременными женщинами и пожилыми людьми. Побочные явления в виде легких диспепсических расстройств (тошнота, рвота, желудочный дискомфорт) встречаются лишь в единичных случаях. Так, I.Faiguenbaum et al. (1963) наблюдали слабые диспепсические расстройства у одного из 64 леченных больных. Некоторые работы по токсикологии фенасала рассмотрим подробнее.
В целом йомезан характеризуется как малотоксичный препарат. Q.Hecht, C.Qloxhuber (1960) показали, что кролики хорошо переносят препарат вплоть до дозы 5 г/кг. Кошки и собаки являются относительно более чувствительными к препарату, но он хорошо переносится ими даже в такой высокой дозе как 1 г/кг. Естественно, что при внутривенном введении его токсичность возрастает более чем в 1000 раз, так средняя смертельная доза при внутривенном введении для мышей равна 0,0075 г/кг, а для крыс при внутрибрюшинном введении - 0,75 г/кг. Последнее подтверждается Т.П.Веселовой (1964), установившей ЛД50 фенасала для мышей при внутрибрюшинном введении равную 0,9 г/кг. М.В.Дорошиной (1966) при изучении острой токсичности фенасала на мышах показано, что при внутрибрюшинном введении в г/кг: ЛД0 = 0,54; ЛД16 = 0,79; ЛД50 = 0,9 (0,75-4,08); ЛД84 = 1,02; ЛД100 = 1,45 и при пероральном - ЛДо = 10,5; ЛД,6 = 12,5; ЛДзо = 13,5 (12,85-14,17); ЛДв4 = 14,5 и ЛД100=17,5.
Наименее токсичен йомезан при введении в желудок, так мыши и крысы переносят дозу 10 г/кг (Д.Г.Баяндина и др., 1962). Йомезан при пероральном введении лабораторным животным не обладает кумулятивным действием. В опытах на кроликах (0,1 г/кг в течение 11 дней), собаках (0,1 г/кг в течение 84 и 96 дней) и кошках (0,1 г/кг в течение 12 дней) переносимость йомезана была удовлетворительной, биохимические показатели крови и мочи находились в пределах нормы. Отмечено лишь проходящее после отмены препарата снижение массы тела у кошек (Q.Hecht, C.Qloxhuber, 1960).
По данным Х.И.Сейфуллы (1964) в острых опытах и уже с отечественным препаратом - фенасалом, получен тождественный с йомезаном эффект, т.е. доза 10 г/кг препарата не вызывала гибели мышей и крыс. К аналогичному выводу несколько позднее пришли В.Ф.Гладких и М.Н.Лебедева (1970), установившие, что фенасал хорошо переносится животными даже в дозах 10 т/кг, и его LD50 для мышей определить практически невозможно. Эти данные касаются фенасала, содержащего значительное количество примесей. Интересно, что после очистки и микронизации фенасала его токсические свойства усиливались, так максимально переносимая доза у мышей составила 1,6 г/кг, а значение LD5o снизилось до 4,8 г/кг.
В то же время изменение лекарственной формы фенасала не оказало существенного влияния на проявление токсических свойств препарата. LD50 таблеток на основе фенасала у мышей составляет 4 г/кг. LD5o для мышей при введении им фенасала в форме гранул была равна 6,0±2,4 г/кг. Максимально переносимая доза для мышей при введении гранул фенасала была близка к максимально переносимой дозе фенасала в порошке (1,6 г/кг). Таким образом, переносимость мышами фенасала в порошке, таблетках и гранулах была примерно одинаковой.
Максимально переносимая доза фенасала в порошке, таблетках и гранулах для крыс также была близкой и находилась в пределах 6,3-6,5 г/кг. LD50 для крыс при введении им фенасала в порошке, таблетках и гранулах установить не удалось из-за низкой токсичности препарата. Переносимость фенасала в указанных лекарственных формах была лучше у белых крыс, чем у мышей (С.И.Золотухин, Л.Ф.Виноградова, Л.М.Козлова и др., 1983).
Схемы проведения опытов по скринингу ряда соединений из различных химических групп на цестодо-цидную и нематодоцидную активность
Испытание замещенных салициловых кислот, производных салициланилидов, бензодиоксанов, N,S-гетероциклических соединений на цестодоцидное действие проводили на белых мышах, экспериментально инвазированных Н. папа. Мышей заражали перорально с помощью шприца, снабженного специальной канюлей, из расчета 100-400 инвазионных яиц на животное. Для этого собранных от предшествующего заражения цестод Н. папа растирали пестиком в ступке или разрушали в небольшом объеме водопроводной воды посредством неоднократного насасывания в шприц с насаженной на него иглой-канюлей для перорального заражения. На 13-й день после заражения в желудок мышей разных групп вводили различные тестируемые препараты однократно в дозе 100 мг/кг в виде водной суспензии с добавлением 1-2 капель ПЭГа. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду с ПЭГом в соответствующих объемах. На 4 сутки после введения препаратов животных убивали. Активность соединений учитывали по результатам гельминтологического вскрытия кишечника. Извлеченных при вскрытии цестод подсчитывали. Учет эффективности препаратов проводили по типу «контрольный тест» с расчетом среднего количества обнаруженных цестод и интенсэффективности.
Изучение нематодо-цидной активности новых соединений проводили на лабораторной модели трихинеллеза на белых мышах, экспериментально инвазированных Т. spiralis, в возрасте 1,5-2 месяцев в дозе 100 личинок на животное. Животных заражали через рот введением суспензии с личинками с помощью шприца с канюлей. На 6-й день после заражения мышам подопытных групп вводили перорально однократно 6 препаратов из класса 1Ч,8-гетероциклических соединений, 9 препаратов из класса бензодиоксанов, 1 соединение производное бензоксазола и 1 соединение из группы бензтиазола в дозе 100 мг/кг. Животные контрольных групп получали дистиллированную воду в соответствующих объемах.
Животных убивали на 3 сутки. Нематодоцидную активность испытуемых препаратов учитывали по результатам гельминтологического вскрытия кишечника и исследования компрессорным методом изолированных отрезков кишечника. Учитывали обнаруженное при этом количество трихинелл. Учет эффективности препаратов проводили по типу «контрольный тест» с расчетом среднего количества обнаруженных нематод и интенсэффективности. учетом «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005). Опыты по изучению острой токсичности тенала проводили на 30 белых крысах-самцах с массой тела 180-220 г и 36 белых мышах с массой тела 18-20 г.
Препарат вводили крысам в виде суспензии на ПЭГе однократно, перорально с помощью желудочного зонда в дозах 300; 500; 800; 1000 и 1500 мг/кг; мышам - в дозах 300; 350; 400; 450 и 800 мг/кг. На каждую дозу было использовано по 6 животных. Наблюдение за животными проводили в течение 1 месяца, при этом учитывали общее состояние, прием корма и воды, состояние шерстного покрова, поведение и активность животных.
Для расчета средней смертельной дозы использовали метод пробит-анализа по Литчфилду и Уилкоксону (Беленький М.Л., 1963). проводили на белых крысах-самцах с массой тела 180-220 г. За 1-2 дня до эксперимента кожу животных освобождали от шерстного покрова. Площадь поверхности участка кожи составляла 5x5 см. Препарат наносили в виде водной суспензии на ПЭГе однократно в дозах 2500 и 5000 мг/кг.
В течение 14 суток вели наблюдение за состоянием и поведением животных в отношении проявления симптомов интоксикации; оценивали физиологические функции, реакцию на раздражители и т.п. нанесении препарата в дозах 2500 и 5000 мг/кг при оценке острого ток сического действия. Исследовали состояние кожи, обращая особое внимание на возможность покраснения кожи, наличия трещин, изъязвлений, кровоизлияний, появления сухой корки и т.д.
Состояние кожи оценивали с учетом развития возможной эритемы и интенсивности отека кожи (по измерению изменения толщины кожной складки в мм) («Методические указания к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций избирательно действующих раздражающих веществ в воздухе рабочей зоны», 1980). Исследование действия тенала на слизистую глаза проводили на 3 взрослых здоровых кроликах, которым в левый глаз вносили 1% суспензию тенала, а правый служил контролем. Тенал вносили в конъюнктивальный мешок с помощью пипетки однократно в количестве 1-2 капель.
Снятие эмбриотоксического действия тенала при комбинированном введении с глицином и сернокислой медью
Если кратко проанализировать приведенные в предыдущих разделах данные, то можно придти к следующим предварительным выводам. С точки зрения общетоксических свойств тенал не внушает опасений. При введении в желудок препарат относится к классу соединений с умеренной токсичностью; при нанесении на кожу препарат проявляет низкую токсичность; он не обладает раздражающим действием на кожу и конъюнктиву глаза; для тенала не характерно проявление кумулятивных свойств и т.д. Однако препарат обладает выраженным эмбриотоксическим действием у крыс при введении в три раза повышенной и даже терапевтической дозах. Правда, последнее действие проявляется при очень жесткой схеме введения -многократном применении. Тем не менее, исходя из вышесказанного, довольно неожиданной целью наших исследований стало «снятие» у тенала данного побочного эффекта. В качестве веществ, снимающих эмбриотоксическое действие тенала, мы апробировали глицин и сернокислую медь; выбор подобных добавок подробно обсуждается ниже, в разделе «Обсуждение». Кроме того, предупреждение данного эффекта тестировали при различных дозах и схемах введения. В первом варианте испытаний комбинацию тенала с глицином и сернокислой медью (1:1) вводили однократно, в выборочные критические сроки эмбриогенеза, но в максимальной дозе, т.е. превышающей терапевтическую в три раза (соответственно таблицы 2.2.3.1. и 2.2.3.2.) Как следует из представленных в таблицах данных, общая гибель эмбрионов при введении композиции тенала с глицином на 3; 6 и 9 сутки эмбриогенеза составила соответственно 13,17±5,14%; 11,62±4,45% и 14,38±4,51% против 12,24±4,73% в контроле; аналогичные показатели для композиции тенал + сернокислая медь равнялись 12,50±4,45%; 14,22±3,60% и 16,52±4,92% против того же контроля 12,24±4,73%. При введении тенала одним из «страдающих» показателей была масса эмбрионов.
В данном случае при введении обеих комбинаций масса плодов в опытной группе достоверно не отличалась от контрольных значений (таблицы 2.2.3.1. и 2.2.3.2.). Следующей схемой тестирования комбинаций тенала с глицином и сернокислой медью (1:1) было уже многократное введение в различные периоды эмбриогенеза, но в терапевтической дозе, т.е. 100 мг/кг.
Результаты приведены в таблицах 2.2.3.3 и 2.2.3.4. контрольных значений; масса плодов в опытных группах была сравнима с контрольными значениями. Обратимся к таблице 2.2.3.4. При введении комбинации тенала с сернокислой медью в дозе 100 мг/кг при многократной схеме введения полностью отсутствовало эмбриотоксическое действие: гибель плодов находилась на уровне контрольных значений; их масса и размеры соответствовали данным показателям в контрольной группе и физиологической норме для данного вида животных. многократном введении одного тенала (100 мг/кг) и в сочетании с глицином и сернокислой медью (100 мг/кг в каждом случае). Как следует из приведенных данных, введение одного тенала в дозе 100 мг/кг привело к гибели 29,16±9,47% плодов против 8,16±3,90% в контроле. Напротив, при совместном введении тенала с глицином и сернокислой медью общая эмбриональная смертность составила соответственно 10,63±4,54% и 8,00±3,87% против 12,24±4,73% в контроле. Иными словами, совместное введение тенала с глицином и сернокислой медью не оказывало отрицательного влияния на показатели гибели эмбрионов, что характерно для самого тенала. Аналогичным образом на рис. 2.2.3.2. приведено сравнение массы плодов после введения тенала и его смесей с глицином и сернокислой медью.
Первичное испытание тенала и его комбинаций с глицином и сернокислой медью при мониезиозе овец
В программу наших исследований входило испытание тенала (который мы рассматриваем в качестве субстанции) и его смесей на цестодоцидную активность, а именно при мониезиозе овец; исследования проводили в сравнении с известным цестодоцидным средством и аналогом - фенасалом. Несмотря на довольно ограниченный характер данных исследований, особенно в отношении тестируемых доз, их целью была апробация антгельминтной эффективности самого тенала и сравнительная оценка его комбинаций с глицином и сернокислой медью. Результаты данных опытов представлены в таблице 2.2.5. Как следует из представленных данных, сам тенал в дозе 100 мг/кг проявил 100% эффективность против мониезий у ягнят. При испытании комбинаций тенала с глицином и сернокислой медью также было получено высокое цестодоцидное действие на уровне 100%. Иными словами можно констатировать, что лекарственные комбинации на основе тенала с включением добавок для «снятия» эмбриотоксического действия препарата не уступают теналу в проявлении терапевтической эффективности при мониезиозе овец. Кроме того, по визуальным наблюдениям ягнята хорошо переносили введение как одного тенала, так и его комбинаций с глицином и сернокислой медью. Животные были активны и охотно потребляли корм. Таким образом, установлено, что композиции тенала являются высокоэффективными при одном из наиболее распространенных цестодозов овец - мониезиозе овец и в этом отношении не уступают самому теналу. С учетом результатов оценки токсических свойств и цестодоцидной эффективности считаем вполне реальной перспективу применения указанных композиций в качестве лекарственных средств для ветеринарии, а сам тенал — субстанцией для их производства. Проанализируем полученные данные в совокупности. Первоначальной точкой для наших исследований послужил поиск эффективного препарата, обладающего цестодоцидной или нематодоцидной активностью. Сам скрининг ограничивался оригинальными 13 производными замещенных салициловых кислот и салициланилидов, 10 бензодиоксанами, 7 Б-гетероциклическими соединениями, 1 соединением из группы бенз-тиазола и 1 соединением, производного бензоксазола. В целом скринингу на двух моделях подверглось 34 соединения. В качестве моделей для выявления активности тестируемых соединений служили мыши, зараженные соответственно Н. папа и Т. spiralis. Результаты подобного скрининга подробно представлены в разделе 2.2.1. Выбор самих соединений из данных химических классов не является случайным; среди них имеются высокоэффективные препараты, уже широко применяющиеся на практике. На наш взгляд, в целом наиболее удачные результаты были получены с производными замещенных салициловых кислот и салициланилидов. Действительно, большая часть этих соединений проявила либо высокую, либо среднюю эффективность против Н. папа. Что касается поиска активного нематодоцидного препарата, то его результаты не дали какого-либо достойного результата.
Правда, вероятно, при этом стоит учитывать особенности модели, на которой проводились испытания. С учетом результатов испытаний на лабораторных моделях и первичной оценки переносимости препаратов для дальнейших детальных исследований был выбран препарат с выраженным цестодоцидным действием под шифром СА-2 (3,5-дибромсалициловая кислота), которому мы дали оригинальное название тенал, и все наши последующие усилия были направлены на изучение данного соединения, главным образом, его токсических свойств. Первой задачей исследований было изучение острой токсичности тенала при введении в желудок. Как это является общепринятым в таких случаях, опыты проводили на двух видах лабораторных животных, крысах и мышах. По параметрам острого токсического действия на двух видах животных тенал можно отнести, пожалуй, к наиболее многочисленной группе среднетоксичных соединений (3 класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76). Однако в данном случае важно и интересно отметить, что значение LD5o для крыс было практически в 2 раза выше по сравнению с мышами. Иными словами можно заключить, что у мышей к теналу имеется видовая чувствительность. Кроме того, помимо более низкого значения LD5o и других параметров для мышей характерна довольно узкая зона токсического действия. Так, если токсические дозы тенала для крыс находились в пределах от 800 до 1500 мг/кг, то аналогичные пределы для мышей составляли всего 350-500 мг/кг. К этому следует добавить более быстрое развитие картины интоксикации у мышей после введения препарата.
Похожие диссертации на Антгельминтик тенал и его фармакотоксикологические свойства
