Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературных источников 12
1.1. Возможные пути трансформации ФКАС в природных средах и продуктах промышленного производства 12
1.1.1. Неферментативная трансформация 14
1.1.1.1. Гидролиз 14
1.1.1.2. Образование металлорганических комплексов 15
1.1.1.3. Окисление 17
1.1.1.4. Реакции альдегидов с аминогруппами 20
1.1.1.5. Декарбоксилирование 21
1.1.2. Ферментативная трансформация ФКАС 22
1.1.2.1. Реакции, идущие по карбоксильной группе 22
1.1.2.2. Дегалогенирование 25
1.1.2.3. Окисление 26
1.1.2.4. Ферментативный гидролиз 35
1.2. Современные подходы к идентификации и количественной оценке ФКАС 36
1.3. Применение методов квантовой химии для прогнозирования процессов трансформации 43
2. Экспериментальная часть 47
2.1. Оборудование и реактивы 47
2.1.1. Реактивы 47
2.1.2. Методика синтеза и очистки протокатеховой кислоты 49
2.1.3. Используемое оборудование 50
2.2. Общий алгоритм проведения лабораторных экспериментов по исследованию путей трансформации ФКАС 50
2.2.1. Состав модельных полиреагентных сред 51
2.2.1.1. Приготовление модельных сред для изучения процессов трансформации бензойной, 4-гидроксибензойной, 2-гидроксибензойной, ацетилсалициловой, 2-2 хлорбензойной, протокатеховой, галловой кислот, метилового, этилового, пропилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты, фенола, пирокатехина и амида 2-гидроксибензойной кислоты 54
2.2.1.2. Приготовление модельных сред для изучения трансформации левомицетина и левомицетина сукцината натрия 54
2.2.1.3. Приготовление модельных сред для изучения трансформации фенилового эфира 2-гидроксибензойной кислоты 55
2.2.1.4. Приготовление модельных сред для изучения трансформации 2-гидроксинафталина 55
2.2.1.5. Приготовление модельных сред для изучения трансформации фенилбензола 56
2.2.2. Методики количественного определения ФКАС в модельных средах методом ВЭЖХ-УФ 56
2.2.2.1. Получение электронных спектров ФКАС 56
2.2.2.2. Подготовка модельных сред перед ВЭЖХ анализом 56
2.2.2.3. Условия хроматографического разделения 57
2.2.2.4. Определение величин отношений сигналов абсорбции 59
2.2.2.5. Калибровка методик идентификации и количественного анализа ФКАС в модельных средах 59
2.2.2.6. Расчет концентраций ФКАС в модельных водно-органических средах 61
2.2.3. Методики идентификации продуктов трансформации ФКАС 61
2.2.3.1. Анализ методом ВЭЖХ-УФ 61
2.2.3.2. Анализ методом ГХ-МС 62
2.2.3.2.1. Подготовка образцов 62
2.2.3.2.2. Условия ГХ-МС анализа 62
2.3. Проведение квантово-химических расчетов 63
2.3.1. Поиск оптимальной геометрической конфигурации, расчет полной энергии соединения 63
2.3.2. Верификация оптимизированных геометрических конфигураций моделей 65
2.3.3. Изучение процесса сближения субстратов с каталитическим центром до стадии отрыва воды и тирозинового фрагмента (Тир2) и оптимизация геометрической конфигурации модели субстрат-каталитический центр после отделения тирозинового фрагмента и воды от каталитического центра 66
2.3.4. Определение потенциальных реакционных центров микроцистинов 67
2.4. Расчет показателей валидации хроматографических методик 67
3. Результаты и их обсуждение 69
3.1. Объекты исследования 69
3.2. Синтез протокатеховой кислоты из 4-гидрокси-3-метоксибензальдегида 71
3.3. Отработка методов идентификации и количественной оценки ФКАС и продуктов их трансформации 75
3.3.1. Оптимизация методик количественного определения ФКАС в модельных средах методом ВЭЖХ-УФ 75
3.3.1.1. Характеристики электронных спектров 76
3.3.1.2. Определение состава модельных водно-органических сред и процедуры их пробоподготовки для ВЭЖХ 83
3.3.1.3. Подбор условий ВЭЖХ-разделения 84
3.3.2. Выбор условий идентификации продуктов трансформации ФКАС 88
3.4. Направления процессов трансформации ФКАС в модельных системах 91
3.5. Поведение силильных производных продуктов трансформации ФКАС при электронном ударе 107
3.6. Исследование динамики изменения концентрации ФКАС в модельных водно-органических средах 109
3.7. Оценка пути протекания процессов интрадиольной окислительной дециклизации ароматического кольца пирокатехина и протокатеховой кислоты 117
3.7.2. Выбор рабочей модели каталитического центра ИДДГ 118
3.7.3. Изучение стадии сближения субстратов с каталитическим центром ИДДГ120
3.7.4. Выявление реакционных центров микроцистинов 124
3.8. Разработка практических методик количественного определения ряда ФКАС в сложных аналитических матрицах 129
3.8.1. Методика определения остаточных количеств левомицетина в коровьем молоке методом ВЭЖХ-УФ 129
3.8.2. Методики количественного анализа эфиров 4-гидроксибензойной кислоты (парабенов) в образцах пищевых продуктов, фармацевтических препаратов и косметических изделий методом ВЭЖХ-УФ 137
4. ВЫВОДЫ 144
Список литературы 146
- Образование металлорганических комплексов
- Применение методов квантовой химии для прогнозирования процессов трансформации
- Приготовление модельных сред для изучения трансформации левомицетина и левомицетина сукцината натрия
- Исследование динамики изменения концентрации ФКАС в модельных водно-органических средах
Образование металлорганических комплексов
Природные среды, а также продукция, производимая пищевой, косметической, фармацевтической и другими отраслями промышленности, преимущественно представлена сложными по составу матрицами, включающими обширную органическую и неорганическую составляющие. Это предопределяет возможность протекания широкого круга химических преобразований как абиотического (неферментативного), так и ферментативного характера. Особенно актуальным становится исследование путей и закономерностей трансформации ФКАС в виду широкого их применения в различных отраслях промышленности [1-19] и необходимости разработки в связи с этим адекватных методик их идентификации и количественной оценки.
Саморегуляция – важнейшее свойство открытых систем, обеспечивающее динамическое постоянство определенных ее параметров. Одними из ключевых механизмов саморегуляции природных экосистем являются процессы трансформации ксенобиотиков (схема 1.1 на примере метилового эфира 4-гидроксибензойной кислоты).
К числу основных реакций трансформации ФКАС неферментативной природы можно отнести: гидролиз, комплексообразование, окисление, реакции альдегидов с аминогруппами, декарбоксилирование [1, 3, 16, 20-49]. Зачастую неферментативные реакции являются подготовительным этапом для дальнейших преобразований [21]. Ферментативная трансформация ароматических соединений представлена следующими основными типами реакций: реакции, идущие по карбоксильной группе [21, 23, 46-69], дегалогенирование [21, 46-49, 70-83], дециклизация ароматического кольца [21, 46-49, 84-118], гидролиз [21, 47-49], восстановление [21, 46-49], дезалкилирование [21, 23], дезаминирование [21, 23], десульфирование [21, 23] и рядом других преобразований.
Процессы ферментативной трансформации крайне разнообразны и могут проходить в аэробных и в анаэробных условиях [21, 23, 47-49]. Анаэробные процессы преимущественно локализованы в местах ограниченного доступа кислорода (болота, донные отложения, глубинные слои почв и водоемов) и, как правило, сопровождаются восстановлением органических субстратов [21]. Аэробная трансформация ФКАС протекает намного быстрее анаэробной и вносит основной вклад в естественную очистку природных водоемов от загрязнителей [21]. Обычно в аэробных преобразованиях выделяют два основных этапа: подготовительный и основной. Подготовительный этап направлен на преобразование веществ до ключевых промежуточных продуктов, которые претерпевают дальнейшие превращения в ходе основного этапа.
Благодаря присутствию в составе сложных многокомпонентных сред огромного количества химических веществ круг возможных превращений ФКАС потенциально расширяется. Частью такой многокомпонентной среды являются микроцистины. Это сильнейшие циклические пептидные токсины, продуцентами которых выступают живущие в естественных и антропогенных водоемах цианобактерии [119-125]. Основной мишенью микроцистинов являются сериновые фосфатазы клеток печени – гепатоцитов. Также они оказывают общее цитотоксическое действие, что выражается в нарушении структуры ДНК [119-123]. Их связи азот-углеродные связи медленно подвергаются гидролитическому расщеплению, в связи, с чем они обладают тенденцией к биоаккумуляции [120]. Микроцистины и продукты их трансформации могут реагировать, в том числе и с исследуемыми ФКАС, при этом образующиеся вещества, возможно, будут заметно превосходить по токсичности исходные соединения.
Гидролитическое расщепление показано для сложных эфиров, тиоэфиров, амидов, нитрилов [21]. Интенсивность протекания реакций гидролиза во многим зависит от величины pH среды [21, 23]. В целом высокий рН морской воды (pH 8,2) обуславливает существенную роль гидролитических реакций в данной среде, делая их необратимыми, в противоположность этому очень мало природных сред характеризуется низкими значениями pH, достаточными для протекания кислотного гидролиза [21]. К средам с низкими значениями pH можно отнести подзолистые (pH 3,5-4,0), дерново-подзолистые почвы хвойных лесов (pH 5,5), болота, свалки, места сброса органических отходов [21]. В случае вышеуказанных природных сред pH снижается за счет ферментации органических соединений, сопровождающейся образованием органических кислот. Следовательно, необходимо проводить различие между щелочным, нейтральным и кислым гидролитическими механизмами. Следует также учитывать, что и гидролитический, и фотолитический механизмы могут работать одновременно, следовательно, продукты этих реакций не обязательно будут идентичными [21]. Скорость протекания гидролиза может ускоряться на поверхности твердой фазы в присутствии катионов железа, меди, марганца, алюминия, кальция, натрия [21, 23]. Данные процессы могут также катализироваться минералами глин и оксидов металлов. Наиболее существенный вклад вносят реакции на поверхности анатаза (TiO2), гематита (Fe2O3), гоэтита (FeOOH), -оксида алюминия (Al2O3) [23].
Применение методов квантовой химии для прогнозирования процессов трансформации
На сегодняшний день эффективным инструментом изучения органических структур и процессов их превращения стала квантовая химия, методы которой сравнимы по точности и возможностям с инструментальными методами исследования. Развитие квантовой химии за последние десятилетия характеризуется как значительным возрастанием количества объектов исследования, так и расширением сферы ее интересов. Прежде всего, развивается направление, связанное с изучением динамики превращений молекулярных систем с более глубоким изучением поверхностей потенциальной энергии [175].
Существуют два принципиальных подхода к оценке структуры и свойств химических соединений. Первый подход заключается в проведении физико-химических испытаний, качественного и количественного анализа, кинетических исследований. Часто такого рода опыты и испытания требуют наличия определенной приборной базы, стабильных поставок расходных материалов, длительных временных затрат. При этом возникают затруднения при анализе неустойчивых соединений, молекул в возбужденных состояниях, интермедиатов [176]. Иной подход представляет собой квантово-химические расчеты (КХР), результатами которых выступают данные об интересуемых свойствах и параметрах молекулы. В современном варианте КХР проводятся при помощи мощной вычислительной техники и специализированных программ [177].
На сегодняшний день все большее распространение получают работы, посвященные моделированию реакций трансформации ФКАС [92-103]. В большинстве работ используются методы теории функционала плотности (DFT). Это объясняется, с одной стороны, меньшей вычислительной нагрузкой, и следовательно, снижением временных затрат на получение необходимых данных, с другой стороны, полученные методами DFT данные в большинстве случаев хорошо соотносятся с экспериментальными значениями, т.е. являются довольно надежными.
В отличие от методов ab initio, которые концептуально начинаются с описания индивидуальных электронов, взаимодействующих с ядрами и всеми другими электронами в системе, теория функционала плотности начинается с рассмотрения полной электронной системы. В основу DFT положена модель Томаса – Ферми, а также теоремы Хоэнберга – Кона.
В DFT полная энергия складывается из трех составляющих: кинетической энергии, кулоновской энергии взаимодействия всех заряженных частиц в системе и, так называемой, обменно-корреляционной энергии, которая учитывает все многочастичные взаимодействия [177]. Подход, основанный на теории функционала электронной плотности позволяет учесть корреляцию электронов, используя только единственный определитель. Основная идея этого подхода в том чтобы включить обменно-корреляционную энергию непосредственно в одноэлектронные уравнения [175, 176]. Узкое место этого метода в том, что точное выражение для обменно-корреляционной энергии неизвестно. Лучшее, что есть на сегодняшний день – это приближенное выражение, полученное из теории однородного электронного газа. Поэтому методы функционала плотности не относятся к неэмпирическим методам.
DFT открывает перед исследователем широкие возможности в проведении расчетов больших систем (в том числе кристаллов). Однако в рамках подхода, основанного на функционале электронной плотности, существует еще одно направление, которое можно назвать «концептуальной теорией функционала плотности». Как выяснилось, аппарат метода DFT позволяет заново рассмотреть основы целого ряда химических концепций и принципов, таких, например, как электроотрицательность, теория мягких и жестких кислот и оснований и др. [176]. Обращение к теории функционала плотности позволяет лучше понять природу этих понятий, дать им формализованные определения и, наконец, рассчитать соответствующие величины.
Одним из наиболее эффективных и популярных на сегодняшний день является метод гибридных функционалов B3LYP (Becke, three-parameter, Lee-Yang-Parr), обменно-корреляционный функционал которого выражается следующей формулой 1.1 [176]: Еь21ур = (Е А + а0 (Ef + Е ш )) + ах (EcfA - Е ш ) + ас (EcfA - Е А ), (1.1) a0 = 0,20, ax = 0,72, ac = 0,81 - три эмпирических параметра; Евши Еаол – обобщенные приближения градиента; EfA- приближение локальной плотности VWN (Vosko-Wilk-Nusair) к корреляционному функционалу. Таким образом, существует огромное количество возможных путей трансформации ФКАС, отличающихся еще более обильным перечнем возможных промежуточных и конечных продуктов. Установление приоритетных путей протекания процессов трансформации ФКАС позволит в дальнейшем более эффективно выработать адекватные способы ремедиации природных систем, создавать химические структуры катализирующие распад и модификацию ФКАС в менее токсичные соединения, разрабатывать методики идентификации и количественной оценки ФКАС и продуктов их преобразования в природных средах, косметике, напитках, продуктах питания, лекарственных средствах и других сложных полиреагентных средах. Идентификация с помощью инструментальных методов позволяет выявлять преобладающие пути протекания химического преобразования в тех или иных условиях, изучить кинетику превращений, идентифицировать и оценить количественно получаемые продукты. При этом для изучения механизмов реакций часто применения одних только инструментальных методов становится недостаточно. В этом случае используют методы квантовой химии и сопоставляют получаемые данные с результатами лабораторного эксперимента, что в целом повышает надежность исследования.
Приготовление модельных сред для изучения трансформации левомицетина и левомицетина сукцината натрия
Сравнительно высокий показатель величины светопоглощения для 2-гидроксинафталина (lg = 5) объясняется влиянием полиядерной ароматической структуры, требующей большей энергии электронного перехода.
Также было выявлено, что в гомологическом ряду эфиров 4-гидроксибензойной кислоты для максимумов поглощения 195 и 254 нм наблюдается гипохромный сдвиг с увеличением алкильного хвоста, при этом величина гипохромного сдвига для обоих максимумов была одинаковой, что также подтверждается сходными величинами сигнальных отношений (табл. 3.4).
Образование сложного эфира между спиртовой группой левомицетина и карбоксильной группой янтарной кислоты приводило к снижению светопоглощения при длине волны 278 нм, при этом заметного гипохромного сдвига у второго максимума (max=211 нм) не наблюдалось.
Возбуждения n характеризуются значительно меньшей энергией перехода электрона, и поэтому вносят незначительный вклад в светопоглощающие свойства ФКАС. Данный тип переходов наблюдается для ФКАС, содержащих карбоксильные группы (201-206 нм), и их модификации: карбоксамидные (205-210 нм), сложноэфирные (209-213 нм) группировки.
Определение состава модельных водно-органических сред и процедуры их пробоподготовки для ВЭЖХ
Состав модельных водно-органических сред определялся с учетом обеспечения возможности протекания, как абиотических процессов, так и преобразований в присутствии ферментов (таблица 2.1). Следует отметить, что в реальных природных средах последние определяются наличием микроорганизмов в реакционной среде. Поэтому готовились два варианта модельных раствора для каждого из исследуемых ФКАС: с ингибированием и без ингибирования микробного роста. В качестве бактерицидного агента выступал азид натрия. В модельных средах, содержащих ингибитор предполагалось протекание исключительно неферментативных процессов, в то время как в модельных средах без ингибитора ожидалось протекание как неферментативных, так и ферментативных процессов преобразования исходных структур.
Согласно литературным данным [46-49], наиболее вероятным процессом трансформации выступали реакции замещения, идущие по карбоксильной группе. Для обеспечения возможности протекания данных процессов в модельную среду вносилась 2-аминоэтансульфоновая кислота. В качестве субстрата для протекания реакций в среду вносились исследуемые ФКАС, концентрация которых подбиралась для каждого индивидуально (от 1,6 до 100 мг/дм3). В ряде случаев для улучшения растворимости ФКАС в модельную среду добавлялось от 0,5 до 2,5 % этилового спирта или ацетонитрила. Для поддержания стабильного pH модельной среды все компоненты растворялись в фосфатном буферном растворе (pH 6,86).
Критичными параметрами пробоподготовки для методик идентификации и количественного определения ФКАС в модельных водно-органических средах выступали трудоемкость и длительность анализа. Метод ВЭЖХ-УФ позволял применять быстрые приемы подготовки модельных образцов, включающие разведение для попадания в калибровочный диапазон и мембранное фильтрование, необходимое для удаления взвешенных частиц.
Управление селективностью разделения компонентов реакционных смесей производилось путем изменения концентрации ацетонитрила, состава и pH элюента, а также выбором измерительной и контрольной длин волн спектрофотометрического детектора в соответствии с полученными данными электронной спектроскопии. Так увеличение объемной доли ацетонитрила в элюенте снижало селективность и коэффициент емкости при ВЭЖХ-анализе. В качестве водного компонента подвижной фазы применялись HPLC-grade вода, ацетатный буферный раствор, растворы ортофосфорной кислоты с различными величинами pH.
Использование воды как компонента элюента было оправдано при анализе неионогенных соединений и веществ, диссоциирующих в щелочной среде, для которых не было необходимости в контроле pH: фенилового эфира 2 гидроксибензоной кислоты, фенилбензола, левомицетина, эфиров 4 гидроксибензойной кислоты, фенола, амида 2-гидроксибензойной кислоты, пирокатехина. Поддержание pH подвижной фазы было необходимо для соединений, диссоциирующих в нейтральной среде, что провоцировало появление парных сигналов Хроматограмма раствора бензойной кислоты, подвижная фаза: ацетонитрил - вода (20:80), pH 6,4, = 230 нм. На хроматограмме видны два пика бензойной кислоты: 1 - диссоциированная (tr = 4,46 мин.) и 2 -недиссоциированная(tr = 5,54 мин.) формы
Ацетатный буферный раствор применялся для анализа бензойной, 2-гидроксибензойной и ацетилсалициловой кислот, но в дальнейшем выяснилось, что использование данного буфера негативно сказывалось на чувствительности и точности из-за заметного увеличения шума в диапазоне длин волн от 190 до 254 нм, но при этом данные методики все же отвечали критериям чувствительности и селективности. В отличие от ацетатного буфера растворы ортофосфорной кислоты обладали несомненными преимуществами: УФ-прозрачность, устойчивость к воздействию микроорганизмов, способность сохранять pH в течение длительных промежутков времени (более месяца, рис.3.5), следовательно, они были использованы в последующем при анализе ионогенных соединений, способных к диссоциации в нейтральных и слабокислых растворах: 4-гидроксибензойной кислоты, левомицетина сукцината натрия, 2-хлорбензойной кислоты, галловой кислоты, 2-гидроксинафталина, протокатеховой кислоты. Применение растворов ортофосфорной кислоты вместо фосфатного буфера объяснялось отсутствием в составе неорганических солей, способных выкристаллизовываться на тыльной стороне сальников поршней насоса.
Выбор рабочих длин волн (табл. 3.4) базировался исходя из данных электронной спектроскопии и величин шумов на хроматограммах. Было подобрано четыре рабочих длины волны: 210, 230, 254 и 278 нм. Использование одновременно двух длин волн при анализе ФКАС позволяло вычислить сигнальные отношения аналитов, которые наряду со временами удерживания использовались в качестве критерия идентификации ФКАС и продуктов их трансформации (табл. 3.4).
Исследование динамики изменения концентрации ФКАС в модельных водно-органических средах
Данные поведения продуктов трансформации ФКАС при ионизации молекул электронным ударом представлены в таблице 3.8 и схеме 3.10.
Установлено, что силилированные производные продуктов трансформации ФКАС не имели возможности образовывать типичные ионы M+-17, характерные для карбоновых кислот и M+-28 для гидроксибензолов. Основные процессы фрагментирования проходили с участием силильных группировок.
При электронном ударе силилированных молекул в случаях ионизации силильных производных пирокатехина, 4-гидроксибензойной и 2 гидроксибензойной кислот, левомицетина, 1,2-дигидроксинафталина наибольшей интенсивностью обладал ион Ф1 (73), что соответствовало отрыву силильной группы. Наличие у большинства дериватизованных соединений нескольких силильных групп в структуре молекул также способствовало повышению интенсивности данного иона, наблюдающееся благодаря одновременному отрыву более чем одной силильной группы.
Фрагмент Ф2 (45), представленный рекомбинантным ионом Ф1 выступал в качестве минорного иона и обладал сравнительно низкой интенсивностью.
Фрагмент Ф3 (M+-15) связан с отщеплением одной метильной группы от триметилсилильной. Наибольшая интенсивность данного иона наблюдалась в масс-спектрах Фн, муконовой и 2,5-дигидроксибензойной кислот.
Фрагмент Ф4 (M+-58) представлен рекомбинантным ионом с отщеплением диметилсилильной группы c последующим присоединением свободной силильной группы. Данный ион не обладает высокой интенсивностью и не является основным для большинства силилированных соединений (I = 100 %). Найден в масс-спектрах следующих силилированных соединений: пирокатехина, 2-гидроксибензойной, 4-гидроксибензойной, муконовой кислот, 1,2-дигидроксинафталина.
В ходе анализа масс-спектров левомицетина было показано, что процесс силилирования проходил не только по гидроксильным, но и по содержащейся иминогруппе. Получение в ходе ГХ-МС анализа масс-спектров сильного производного левомицетина свидетельствовало о неполноте силилирования иминогруппы. Наличие мультиплетных сигналов для масс-спектров производного левомицетина указывало на присутствие в составе атомов галогенов, что также подтверждало корректность идентификации.
Для производных муконовой, 2,5-дигидроксибензойной, 4 Схема 3.10 гидроксибензойной, 2-гидроксибензойной кислот и левомицетина относительно низкая интенсивность молекулярного иона, по-видимому, была вызвана применением высокой энергии фрагментации молекул – 70 эВ, что понижало его стабильность.
Изучение данных характеристик проводилось путем периодического измерения концентрации исследуемых ФКАС методом ВЭЖХ-УФ на основании ранее отработанных методик.
В соответствии с характером динамики изменения концентрации ФКАС в модельных средах, как содержащих, так и не содержащих азид натрия, выступающий в качестве ингибитора ферментативного катализа, были подразделены на четыре основные группы. При этом следует отметить, что данные измерения не подразумевали постановки строгого кинетического эксперимента в виду разнонаправленности процессов трансформации ФКАС. Прежде всего, такой подход предполагал оценку вклада неферментативного и ферментативного факторов в преобразование ФКАС в модельных водно-органических средах.
1) ФКАС, концентрация которых в модельном растворе без ингибитора ферментативной активности неуклонно снижалась, в то время как концентрация в модельной среде с ингибитором оставалась постоянной: бензойная, 4 гидроксибензойная, 2-гидроксибензойная кислоты, фенол, 2-гидроксинафталин, метиловый и этиловый эфиры 4-гидроксибензойной кислоты (рис. 3.13-3.14). Такой характер трансформации ФКАС был вызван влиянием исключительно ферментативных каталитических процессов.
Наивысшие темпы снижения концентрации наблюдались для 4 гидроксибензойной кислоты, которая уже после 216 часа проведения эксперимента вышла за нижний предел диапазона чувствительности. Высокая скорость ферментативного каталитического преобразования 4-гидроксибензойной кислоты объяснялось наличием гидроксильной группы в пара- положении, что облегчало процесс гидроксилирования субстрата до протокатеховой кислоты, в то время как наличие у 2-гидроксибензойной кислоты гидроксильной группы в орто-положении обуславливало образование внутримолекулярной водородной связи с карбоксильной группой, что, возможно, несколько затрудняло координационное взаимодействие каталитического центра фермента монооксигеназы с данным субстратом. Трансформация бензойной кислоты проходила заметно медленнее, чем 4-гидроксибензойной, при этом концентрация бензойной кислоты оставалась относительно постоянной вплоть до 168 часов. Это было вызвано более длительным циклом каталитической ферментативной трансформации и, следовательно, продолжительным периодом выработки соответствующих ферментов. Так для ферментативных каталитических преобразований бензойной кислоты на начальных этапах трансформации требовалось проведение реакций декарбоксилирования и двойного гидроксилирования до пирокатехина (рис. 3.13), в то время как первичные стадии трансформации 4-гидроксибензойной кислоты требовали протекания только одной реакции гидроксилирования. Все эти факты подтверждали гипотезу о протекании окислительной дециклизации ароматического кольца данных субстратов.
Существенно медленнее снижалось содержание фенола, метилового и этилового эфиров 4-гидроксибензойной кислоты. Относительно продолжительная утилизация фенола, по-видимому, была вызвана денатурирующим влиянием на белковые системы, что требовало более длительной адаптации к данному субстрату. Согласно анализу кривых динамики изменения концентрации эфиров 4-гидроксибензойной кислоты (рис. 3.14), неферментативного гидролиза до 4-гидроксибензойной кислоты не наблюдалось, тем не менее, было выявлено протекание процесса ферментативного гидролиза в точках снижения концентрации эфиров 4-гидроксибензойной кислоты. На это указывало различие в характере кривых изменения концентрации (рис. 3.14) в модельных образцах без ингибирования и с ингибированием ферментативной активности, а также увеличение концентрации 4-гидроксибензойной кислоты в модельной среде, не содержащей ингибитора.
Продолжительная трансформация 2-гидроксинафталина (рис. 3.15) была вызвана затруднениями при гидроксилировании конденсированной ароматической системы и изначально низким его содержанием в модельной среде (5 мг/дм3). Относительно невысокая концентрация 2-гидроксинафталина не инициировала заметное увеличение синтеза индуцибельных энзимов.
