Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Особенностью современного этапа развития химии и биологии стероидов является широкое изучение соединений этого класса, содержащих боковую цепь с набором функциональных заместителей. При этом как характер, так и стереохимия заместителей могут играть решающее влияние на уровень биологической активности. Учитывая малую доступность такого рода соединений, их систематическое изучение возможно только при наличии достаточно эффективных методов химического синтеза. При этом именно проблема построения полифункционализированной боковой цепи является наиболее труднаразрешимой. Многообразие структурных типов боковых цепей природных стероидов, представляющих практический и научный интерес, почти всегда требует при выполнении этой части синтетической работы индивидуальных подходов и нестандартных решений, в особенности, когда речь идет о новом классе соединений. С другой стороны, разработанные синтетические методы могут быть эффективно использованы для получения уже известных соединений.
К числу наиболее значимых представителей природных стероидов, для которых характерно наличие полифункционализированной боковой цепи, относятся брассиностероиды (БС). Началом широкомасштабного изучения этого класса соединений можно считать выделение в 1979 г из пыльцы рапса нового стероидного полиоксилактона - брассинолида. Доказательство существования гормонов стероидной структуры у растений стало важной вехой в развитии представлений о роли стероидных гормонов в живых организмах. Уникальные свойства БС привлекли внимание многих химиков и биологов, что позволило в достаточно короткий срок вплотную приступить к созданию препаратов на их основе. Принципиальное отличие таких препаратов от традиционных пестицидов состоит в их экологической безопасности, что позволяет рассматривать БС как средства защиты растений нового поколения.
Другим классом стероидов, интенсивно изучаемым в настоящее время и родственным БС в плане строения боковой цепи, являются витамины D. Одной из главных причин этого стало открытие антипролиферативного действия 1<х,25-дигидроксивитамина D3. Было обнаружено также улучшение состояния кожи больных псориазом при лечении препаратами, содержащими соответствующие аналоги. Основной целью химиков и биологов, работающих в этом направлении, является поиск соединений, обладающих необходимым спектром биологической активности, но при этом оказывающих минимальный эффект на обмен кальция. Наиболее плодотворными оказались исследования, связанные с синтезом модифицированных в боковой цепи аналогов, циклическая часть которых бы полностью соответствовала структуре 1сс,25-дигидроксивитамина Бз.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Работа выполнялась в рамках научно-исследовательских программ: "Оргсинтез" по теме "Разработка методов направленного регио- и стереоселективного синтеза стероидов, простаноидов, феромонов (кайромонов) насекомых, других биоактивных веществ и их синтонов на основе производных 1,3-дикетонов, продуктов нитрилоксидного синтеза и элементоорганических соединений" (1991-1995 гг, № ГР 19941416); с 1996 г "Биооргсинтез" по теме "Разработка технологии производства биологически активных препаратов на основе фитогормонов брассиностероидов и исследование роли генетического фактора в характере их воздействия на растения (Кя ГР 19961105), по теме "Структурно-функциональные аспекты регуляции процессов жизнедеятельности стероидными гормонами и их синтетическими аналогами" (№ ГР 19961106), по теме "Синтез и изучение адаптогенного влияния брассиностероидов на растительные организмы в условиях повышенного радиационного фона и установления характера взаимодействия указанных фитогормонов с другими химическими веществами в растениях с целью коррекции качества и снижения экологической нагрузки" и по теме "Разработка методов синтеза и структурной модификации природных стероидов, их аналогов и других биоактивных соединений с комплексом ценных свойств для сельского хозяйства и медицины" (№ ГР 19961094), научных грантов Международного научного фонда (MWC 000 и MWC3000) и Фонда фундаментальных исследований Республики Беларусь (1995-1999 гг, № ГР 996307, проект № Б96-185).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка методов получения полифункционализированных биологически активных стероидов, прежде всего методов построения их боковой цепи и цикла А; разработка препаративных методов синтеза природных БС на основе доступного стероидного сырья; разработка методов синтеза новых аналогов БС; синтез новых аналогов активной формы витамина D3; синтез стероидов, содержащих гетероциклический фрагмент в боковой цепи; изучение некоторых аспектов биологического действия БС; изучение физико-химических характеристик получаемых соединений; исследования в направлении создания препаратов для сельского хозяйства на основе важнейших БС.
Обьект и предмет исследования. Объектом настоящего исследования являются производные стероидов, содержащие полифункционализированную боковую цепь. Основное внимание в работе уделено соединениям ряда БС, витаминов группы D, производным, имеющим фурановый гетероцикл в боковой цепи. Разработка методов синтеза соединений, составляющих объект исследования, а в случае БС также проведение комплекса их биоиспытаний, представляет собой предмет настоящего исследования.
Методология ц методы проведенного исследования. Синтез полифункционализированных биологически активных стероидов изначально
предполагал использование всей совокупности методов из арсенала современной органической химии, доступных химику-синтетику. Вместе с тем, получение некоторых соединений потребовало разработки новых, ранее неизвестных методов. В этом плане в методологическом отношении настоящее исследование является комбинацией известных и разработанных автором методов решения поставленной задачи. Значительное внимание в работе уделено нитрилоксидному подходу. Он лежит в основе получения интермедиатов синтеза БС, витаминов D, производных, содержащих фурановый гетероцикл в боковой цепи. Из числа методов, впервые представленных в настоящей работе, можно выделить новый подход к построению ключевых интермедиатов синтеза брассинолида - А23-22-кетонов и А23-22-гидроксипроизводиых. Интерес представляет также возможность использования опыта функционализации цикла А, полученного в ходе исследований производных декалинового ряда. Научная новизна полученных результатов.
Разработан эффективный метод синтеза эпибрассинолида из эргостерина, обеспечивший практическую доступность целевого соединения, отличительной чертой которого является применение алкалоидов хинидинового ряда для гидроксилирования Д22-связи, что позволило осуществить проведение процесса с преимущественным образованием 22Л,23К-изомера.
Предложен новый метод трансформации боковой цепи эргостерина в Д23-22-кетоны - известные интермедиа синтеза брассинолида, основанный на использовании 22,23-эпоксидов.
Осуществлен новый синтез норбрассинолида и (247?)-гомобрассинолида, отличительной особенностью которого является использование сульфонов для построения боковой цепи.
Предложен новый реагент для построения боковой цепи БС, содержащий триметилсилильную группу в а-положении к анионному центру, что позволило достичь исключительно высокой стереоселективности присоединения литийвинилсиланов к 22С альдегидам.
Предложен новый метод синтеза гомобрассинолида, включающий стадии одновременного построения 2а,3а- и 22Л,23Я-диольных группировок из соответствующего 2а,За,22,23-диэпоксида.
Впервые осуществлен синтез 22С и 23С стероидных нитрилоксидов, изучена их реакционная способность в отношении низкомолекулярных диполярофилов, включая пропаргиловый спирт, диметилацетиленкарбинол, пропаргилбромид, аллилбромид. Показана возможность трансформации получаемых циклоаддуктов в производные, содержащие набор функциональных группировок, характерный для интермедиатов синтеза БС и витаминов группы D, в частности, А23-22-кетоны, 25-гидрокси-23-кетоны, 22-енамино-25-гидрокси-24-кетоны, 22-енамино-24-кетоны.
Изучена реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения стероидных С17- и С22-ацетиленовых спиртов с низкомолекулярными нитрилоксидами. На стероидах с ароматическим циклом А и 19-нор-Д4-3-кетонах продемонстрирована возможность превращения аддуктов - 17-гидроксиизоксазолов в спирофураноны, труднодоступные другими методами. В случае С22-ацстиленовых спиртов изучена стереоселективная трансформация получаемых циклоаддуктов в производные, содержащие тетрагидрофурановый фрагмент в боковой цепи.
Получены новые 21-гидрокси- и 21-изобутирилоксианалоги 1сс,25-дигидроксивитамина D3.
На модельных производных декалинового ряда разработан новый метод введения как 1а-, так и 1(5-гидроксильной группы.
Обнаружена способность БС оказывать благоприятное влияние не только на количественные, но и на некоторые качественные характеристики сельскохозяйственных культур, включая увеличение уровня крахмала, витамина С, снижение уровня нитратов, уменьшение аккумуляции гербицидов, тяжелых металлов и радионуклидов, повышение устойчивости растений к болезням и т.д.
Впервые обнаружены адаптогенные свойства эпибрассинолида у животных, в частности, рыб, что позволяет расширить представления о роли БС в природе.
Практическая и экономическая значимость полученных результатов.
Важнейшим практическим результатом представляемой работы является создание на основе природного фитогормона эпибрассинолида нового препарата для сельского хозяйства ЭПИНа - стимулятора роста растений и адаптогена. В процессе ее выполнения осуществлен также синтез норбрассинолида и гомобрассинолида, получен ряд аналогов и интермедиатов БС, углубленное изучение которых может привести к созданию на их основе новых препаратов. Практический интерес представляет использованный подход к синтезу С2|-замещенных аналогов 1а,25-дигидроксивитамина Dj, а также полученные этим методом аналоги. Результаты исследований по разработке новых методов построения полифункционализированных боковых цепей стероидов привели к получению соединений, ранее малодоступных. Особый интерес в этом плане представляют производные 19-норстероидов с прогнозируемой прогестагенной активностью, содержащие гетероциклический фрагмент в бокой цепи.
Большое практическое значение имеет опубликование в соавторстве с В.А.Хрипачом и Ф.А.Лахвичем монографии "Брассиностероиды". Наряду с анализом различных аспектов химии и биологии БС, в книге суммирован опыт их применения в странах СНГ, не имеющий аналогов в мировой практике, что дает возможность привлечь внимание специалистов сельского хозяйства, а
также студентов к этому новому предмету, до настоящего времени известному лишь относительно узкому кругу ученых.
Основные положения диссертации, выносимые ira защиту:
Метод стереоселективного получения аллильных спиртов - ключевых интермедиатов синтеза брассинолида, позволяющий добиться преимущественного формирования необходимого 22<х-изомера на стадии присоединения к 22С альдегиду металлорганического реагента, содержащего триметилсилильную группу в а-положении к анионному центру.
Синтез 22С и 23С стероидных нитрилоксидов и циклоаддуктов их 1,3-диполярного циклоприсоединения к низкомолекулярным ацетиленам и олефинам, использование которых обеспечивает возможность эффективного получения интермедиатов БС и витаминов D, в частности, 22-енамино-24-кстонов, Дм-22-кетонов, 23-енамино-25-кетонов.
Синтез циклоаддуктов 17- и 22-гидроксиацстиленов с низкомолекулярными нитрилоксидами, открывающих возможность получения ранее труднодоступных стероидных производных, содержащих фурановый фрагмент в боковой цепи.
Производные 1а,25-дигидроксивитамина D3, содержащие гидрокси-или алкоксизаместитель при С21, позволяющие исследовать влияние ограниченной конформационной подвижности боковой цепи аналогов витамина D3 на биологическую активность.
Новые данные по биологическому действию БС на растениях (люпин, томаты, картофель, виноград) и животных (рыбы).
Метод синтеза действующего начала препарата ЭПИН - фитогормона эпибрассинолида, позволивший обеспечить его крупномасштабные наработки, а также осуществить комплекс мероприятий по регистрации препарата в РБ и РФ и получению разрешения на его использование для повышения урожайности и улучшения качества сельскохозяйственных культур.
Личный вклад соискателя. Научный фундамент настоящей работы составляют исследования в области природных полиоксистсроидов и их аналогов, проводимые в течение ряда лет школой акад. А.А.Ахрема. Изучение брассиностероидов в ИБОХ НАНБ были инициированы акад. Ф.А.Лахвичем, внесшим большой вклад в организацию и развитие начального этапа исследований. В диссертации изложены результаты, полученные в лаборатории химии стероидов ИБОХ НАНБ соискателем лично и под его руководством к.х.н. Ольховиком В.К., Котяткиной А.И., Ивановой Г.В., Павловским Н.Д., Цавловским Д.Н., Драченовой О.А., Чащиной Н.М., Константиновой О.В. Синтез 21-гидроксианалогов витамина Бз осуществлен в Институте органической химии (Польша, г. Варшава) в группе профессора Е.Вихи. Модельные исследования по разработке методов введения С'-гидроксильной группы проведены в Сельскохозяйственном университете в лаборатории проф.
А. дэ Грута (Голландия, г. Вагенинген). Физико-химические исследования синтезированных соединений выполнены в лаборатории физико-химических методов исследования под руководством к.х.н. Гарбуза Н.И., рентгеноструктурные исследования выполнены к.х.н. Ляховым А.С. (ИБОХ НАНБ). Комплекс мероприятий по разработке технологического регламента препарата ЭПИН и его регистрации осуществлен с участием к.б.н. Малеванной Н.Н. (ООО "Эстер", г. Москва) и к.х.н. Завадской М.И. Постановка задач, решение методологических проблем и интерпретация полученных результатов проводилось совместно с научным консультантом чл.-корр., д.х.н. Хрипачом В.А.
Вклад соискателя в совместных публикациях заключался в выборе направления исследования, разработке конкретного плана выполнения. , и корректировке экспериментальной работы, выборе методов реализации поставленных задач, выполнении отдельных этапов экспериментальных исследований, интерперетации полученных данных, обобщении и формулировке основных итогов работы.
Апробация основных результатов работы. Основные результаты диссертации представлены на 7-й респ. конф. молодых ученых-химиков (Таллинн, 1987), 16-й межд. конф. по химии природных соединений (Киото, 1988), 9-й мол. конф. по синтезу природных и физиологически активных соединений (Ереван, 1988), VI, VII и VIII межд. конф. молодых ученых по органической и биоорганической химии (Бехин, 1989; Варна, 1990; Рига, 1991), XIII, XVI-XVIII конф. по изопреноидам (Познань, 1989; Прага, 1995; Краков, 1997; Прахатица, 1999), 5-й межд. конф. по химии и биотехнологии биологически активных природных соединений (Варна, 1989), межд. конф. по брассиностероидам (Галле, 1990), VII Всес. конф. по химии дикарбонильных соединений (Латвия, 1991), конф. "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1997, 1999), XV Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Минск, 1993), симпозиумах по брассиностероидам (Минск, 1991, 1993, 1995), межд. конф. "Экологически чистые технологические процессы в решении проблем окружающей среды" (Иркутск, 1996), совещании по витаминам D (Стратсбург, 1996), 24-ом ежегодном собрании Американского общества по регуляции роста растении (Атланта, 1997), 12-ой межд. конф. по органическому синтезу (Венеция, 1998), межд. конф. по природным продуктам и физиологически активным соединениям (Новосибирск, 1998), 1-й Респ. конф. "Органическая химия Беларуси на рубеже XXI века" (Минск, 1999), межд. конф. "Регуляция роста и развития растений" (Минск, 1999).
Результаты работ по брассиностероидам обобщены 1993 г в опубликованной в соавторстве с В.А.Хрипачем и Ф.А.Лахвичем в издательстве "Наука и техника" монографии "Брассиностероиды".
Отдельные этапы данного исследования стали составной частью цикла работ "Синтез и некоторые практические аспекты брассиностероидов - новой группы фитогормонов", отмеченной премией Химического общества им. Д.И.Менделеева (1991 г), а также цикла работ "Синтез, исследование и применение брассиностероидов - нового класса гормонов растений", отмеченного Государственной премией РБ за 1996 г в области науки и техники.
Созданный на основе природного фитогормона эпибрассинолида препарат для сельского хозяйства ЭПИН отмечен Золотыми медалями Всероссийского выставочного центра и был представлен на Международной выставке ЕХРО-98 в разделе "Экология" (Лиссабон, Португалия).
Опублнкованность результатов. Изложенные в диссертации результаты составили предмет 70 публикаций в отечественных и международных изданиях, в том числе 1 монографии, 1 главы из книги, 6 обзоров, 15 статей, 1 материала конференции, 39 тезисов докладов, 7 патентов (заявок на патенты), всего 545 с.
Структура и обьем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы (глава 1), обсуждения полученных результатов (глава 2), экспериментальной части (глава 3), выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 214 стр. машинописного текста, содержит 11 таблиц, 126 схем, 10 рисунков и библиографию из 449 наименований.
