Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 8
1.1 Химия пиридоксина 8
1.2 Синтез и антибактериальная активность производных сульфаниламида 15
1.3 Антихолинэстеразные вещества, строение холинэстеразы и механизм антихолинэстеразного действия 27
2 Обсуждение результатов 43
2.1 Синтез производных пиридоксина 43
2.2 Влияние строения сульфаниламидных и сульфаниловых производных пиридоксина на антибактериальную активность 66
2.3 Влияние строения карбамоилированных производных ацеталей пиридоксина на антихолинэстеразные свойства 77
3 Экспериментальная часть 90
3.1 Исходные вещества 90
3.2 Аппаратура 90
3.3 Методика изучения антибактериальной активности. 91
3.4 Методики получения соединений 92
3.5 Методика определения скорости поглощения соединений \Т(в,г), VIII клеточной культурой Rhodotorula glutinis с нарушенной клеточной стенкой. 101
3.6 Рентгеноструктурное исследование 102
Основные результаты и выводы 103
- Синтез и антибактериальная активность производных сульфаниламида
- Влияние строения сульфаниламидных и сульфаниловых производных пиридоксина на антибактериальную активность
- Аппаратура
- Рентгеноструктурное исследование
Введение к работе
Актуальность темы. Направленный синтез нового поколения биологически активных соединений, сочетающих в себе высокую эффективность и низкую токсичность, является одним из приоритетных направлений современной органической химии.
В области науки и техники общеприняты способы внутриклеточной доставки активных веществ, основанные на преодолении защитных барьеров организма, к числу которых относятся, в частности, кожные покровы, оболочки органов и клеточные мембраны. Многие активные вещества плохо преодолевают эти барьеры вследствие высокой гидрофильности, которая ограничивает их транспорт через липидные барьеры (например, межклеточный жировой слой кожи и липидные мембраны клеток). Накоплению активных веществ в устойчивых к ним клетках, таких как опухолевые клетки и патогенные микроорганизмы, также препятствует высокая активность в этих клетках мембранных транспортных белков, которые осуществляют выброс веществ из цитоплазмы. Для достижения нужной терапевтической концентрации активного вещества в клетке или органе-мишени традиционным подходом является увеличение используемой дозы вещества в организме. В результате увеличиваются побочные эффекты активного вещества, которые часто превосходят по последствиям положительный терапевтический эффект от его применения.
В связи с этим перспективным подходом к увеличению проницаемости биологических барьеров для активных веществ является создание эффективных и безопасных систем их внутриклеточного транспорта. Создание подобных транспортных систем позволит значительно уменьшить терапевтическую дозу активных веществ, и, как следствие, их побочные эффекты, и тем самым совершить качественный прорыв в фармакологии и медицине.
В течение последних лет в Химическом институте им. A.M. Бутлерова
проводится систематическое изучение химических, биологических и физических свойств производных пиридоксина - одного из ключевых витаминов, вовлеченных в метаболизм с более чем 50 ферментами. Установлены факторы, определяющие пространственное строение семичленного гетероцикла в зависимости от природы заместителей у фенольного атома кислорода и ацетального атома углерода, начаты исследования in vitro и in vivo антибактериальных и антихолинэстеразных свойств ацеталей и кеталей пиридоксина.
Основываясь на полученных результатах, представлялось целесообразным направить дальнейшие усилия, во-первых, на синтез широкого круга транспортных систем на основе производных пиридоксина, содержащих фармакофорные группы в третьем и шестом положениях пиридинового цикла. Во-вторых, провести скрининг их антибактериальной и антихолинэстеразной активности и, в-третьих, на основе выявленных фундаментальных закономерностей "структура — биологическая активность" оптимизировать состав и структуру лабораторных образцов для проведения стадии доклинических испытаний.
Целью работы является направленный синтез широкого круга
производных ацеталей и кеталей пиридоксина, различающихся по
гидрофильно-липофильному балансу, и установление основных
закономерностей взаимосвязи структуры соединений с их
антибактериальной и антихолинэстеразной активностью.
Научная новизна работы состоит в том, что впервые:
синтезированы семичленные ацетали пиридоксина с липофильными заместителями у ацетального атома углерода;
получены новые карбамоилированные и азопроизводные пиридоксина - структурные аналоги лекарственных препаратов калимина и сульфасалазина;
обнаружена необычная реакция образования [9,9'-(гексан-1,6-дикарбамоилокси)бис(1,5-дигидро-3,3,8-триметил-7-этил-[1,3]диоксепино[5,6-с]пиридиний)]дибромида из соответствующего биспиридинового основания алкилированием метилбромидом в присутствии бутиллития;
установлены факторы, определяющие бактериостатическую in vitro и антихолинэстеразную in vivo активность. Антихолинэстеразные свойства карбамоилированных ацеталей пиридоксина и антибактериальная активность 6-азасульфаниловых производных определяются липофильными свойствами соединений и устойчивостью ацетального цикла к гидролизу. Варьирование в широких пределах липофильности сульфаниламидных производных ацеталей пиридоксина не оказывает существенного влияния на их антибактериальную активность.
Практическая значимость. Разработаны подходы к синтезу кинетически контролируемых семичленных и термодинамически выгодных шестичленных ацеталей пиридоксина с длинноцепочечными алифатическими заместителями у ацетального атома углерода. На основе исследования антибактериальных и антихолинэстеразных свойств полученных соединений установлены основные закономерности влияния структуры производных пиридоксина на их биологическую активность. Показано, что использование пиридоксинового "скелета" для доставки фармакофорных групп внутрь живой клетки является перспективным направлением медицинской химии. Некоторые из полученных в работе лабораторных образцов, проявивших в ходе скрининга высокую антибактериальную и антихолинэстеразную активность, находятся на стадии доклинических испытаний.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 128 страницах, содержит 7 таблиц, 21 рисунок. Работа состоит из введения, трех глав,
выводов, списка цитируемой литературы из 149 наименований и приложения на 7 страницах.
В обзоре литературы, приведенном в первой главе, кратко рассмотрены химия группы витамина В6, синтез и антибактериальные свойства производных сульфаниламида и сульфаниловой кислоты. Здесь же представлены сведения об антихолинэстеразных соединениях, их классификация и механизмы ингибирования холинэстераз. Существенное внимание уделено строению активных центров ферментов.
Вторая глава представляет собой обсуждение полученных результатов. В первом разделе приведено описание методик получения семичленных ацеталей, кеталей пиридоксина и их производных. Во втором разделе представлены результаты исследования влияния строения сульфаниламидных и сульфаниловых производных пиридоксина на антибактериальную активность. В третьем разделе обсуждаются антихолинэстеразные свойства in vivo широкого ряда карбамоилированных ацеталей пиридоксина и формулируются основные закономерности "структура - биологическая активность".
Третья глава содержит описание экспериментальной части работы: методики синтеза соединений, исходные вещества, аппаратура.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации
опубликованы 1 статья, 1 работа в сборнике научных трудов и 5 тезисов
докладов на конференциях разного уровня. Основные результаты
диссертации докладывались: на V Республиканской научно-практической
конференции молодых ученых и специалистов (Казань, 2005 г.), XIV
Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных
"Ломоносов-2007" (Москва, 2007 г.), I Международной конференции "Новые
направления в химии гетероциклических соединений" (Кисловодск, 2009),
VIII и IX Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов
научно-образовательного центра Казанского государственного университета
"Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2008 и 2009 гг.), итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 2008).
Диссертационная работа выполнена в Химическом институте им. А.М.Бутлерова под руководством заведующего отделом прикладной химии, к.х.н. Штырлина Ю.Г. и является частью исследований по основному научному направлению Химического института им. A.M. Бутлерова КГУ "Строение, реакционная способность и практически полезные свойства органических, элементоорганических и координационных соединений". Работа имела поддержку программы Минобразования и науки РФ "Развитие научного потенциала высшей школы на 2009-2010 г.г." (РНП 2.2.2.2/5013) и молодежного гранта РТ "Синтез лекарственных препаратов нового поколения на основе элементоорганических и гетероциклических соединений" (N 03-4 /2008).
Автор считает своим долгом выразить искреннюю признательность научному руководителю, к.х.н. Штырлину Ю.Г., д.х.н., проф. Климовицкому Е.Н. и к.х.н. Петухову А.С., а также глубокую благодарность проф. Резнику B.C. и д.б.н. Зобову В.В. (ИОФХ им. А.Е.Арбузова КНЦ РАН) за проведение исследования антихолинэстеразной активности in vivo, доценту Никитиной Е.В. (КГТУ) за определение бактериостатической активности, к.х.н. Сысоевой Л.П., к.х.н. Талану А.С., аспиранту Штырлину Н.В., студенту Гарипову М.Р. и всем сотрудникам отделов прикладной химии и стереохимии за помощь в проведении работы.
Синтез и антибактериальная активность производных сульфаниламида
Открытие сульфаниламидных лекарств - одно из величайших достижений медицины за всю историю. Химиотерапевтическая активность сульфаниламидных препаратов была обнаружена в начале 30-х годов. Первым препаратом этой группы, получившим практическое применение в медицине, был пронтозил или красный стрептоцид. Вскоре было установлено, что пронтозил расщепляется в организме животных с образованием двух продуктов: сульфаниламида и 1,2,4-триаминобензола (схема 8) [54]. Изучение биологических свойств данных соединений показало, что антибактериальная активность пронтозила определяется только одним продуктом метаболизма - сульфаниламидом, в то время как другой (1,2,4-триаминобензол) не обладает антимикробным действием [55]. С этого времени я-аминобензолсульфамид стал широко применяться в качестве антибактериального препарата. Современная медицина использует большое количество сульфаниламидных бактериостатических лекарств для лечения разнообразных инфекционных болезней. Механизм антибактериального действия сульфаниламидов хорошо изучен. При попадании в клетку бактерии сульфаниламидный препарат подавляет синтез фолиевой кислоты. Это происходит по двум причинам. Во-первых, сульфаниламиды ингибируют ферменты, субстратом которых при синтезе фолиевой кислоты служит и-аминобензойная кислота. Во-вторых, эти ферменты вследствие недостаточной субстратной селективности могут использовать в качестве субстрата сульфаниламиды. При этом синтезируется не фолиевая кислота, а ее аналог, содержащий сульфаниламидный компонент вместо остатка и-аминобензойной кислоты (схема 9); такое соединение не способно выполнять коферментные функции. В результате, в бактериальной клетке возникает недостаточность фолиевой кислоты, нарушаются все реакции, в которых она участвует, и размножение бактерий становится невозможным. С другой стороны, в организме человека сульфаниламиды не вызывают таких изменений, поскольку человек получает с пищей готовую фолиевую кислоту, и процессы синтеза, на которые действуют сульфаниламиды, в клетках человека не происходят [56-58].
При инфекциях, вызванных чувствительными к ним микроорганизмами, сульфаниламидные препараты достаточно эффективны и относительно хорошо переносятся, а некоторые бактерии поддаются действию только сульфаниламидных препаратов; к ним относятся колитифознодизентерийная группа, Haemophilus influenzae, фридлендеровская палочка, пастереллы и бруцеллы. Сульфаниламидные препараты также оказываются эффективными при гонококковых инфекциях. При заболеваниях, вызванных стрептококками, стафилококками и менингококками, сульфаниламидные препараты применяются только при легких степенях заболевания. Плохо всасываемые сульфаниламиды применяются при кишечных инфекциях [59]. На основе стрептоцида путем замены на различные радикалы водорода в сульфамидной группе (R и R ) и ароматической аминогруппе (R2) было получено множество сульфаниламидных препаратов с различной степенью терапевтической активности. В подавляющем большинстве случаев синтез производных сульфаниламида основан на использовании хлорангидрида сульфаниловой кислоты. По времени выделения из организма сульфаниламиды можно разделить на 4 группы: а) препараты короткого действия (стрептоцид, норсульфазол, этазол, сульфадимезин и др.); б) среднего действия (сульфазин и др); в) длительного действия (сульфапиридазин, сульфамонометоксин и др.); д) сверхдлительного действия (сульфален и др.). Структурные формулы некоторых из этих препаратов приведены ниже. С появлением пенициллина и других антибиотиков, применение сульфаниламидов несколько сократилось. Этому способствовало то обстоятельство, что первые сульфаниламиды в основном действовали непродолжительное время и, хотя хорошо всасывались, быстро выводились из организма. Этот период продолжался до середины 50-х годов, когда недостатки лечения антибиотиками (побочные реакции, необходимость частых введений препаратов парентерально, появление резистентности) привели к «ренессансу» сульфаниламидотерапии [60]. В настоящее время лекарства этих двух групп часто используются комбинированно. Следующим шагом в разработке средств для лечения и профилактики инфекционных заболеваний на основе сульфаниламидных производных стало получение азапроизводных салициловой кислоты. Особенностью этих соединений является их способность накапливаться в соединительной ткани (в том числе в ткани кишечника) и постепенно высвобождать 5-аминосалициловую кислоту и сульфаниламид, обладающих противовоспалительным и антибактериальным действием, соответственно [59]. Относительно недавно были обнаружены новые виды биологической активности: противоопухолевая, диуретическая, гипогликемическая, антивирусная активность и др. [61]. препарат ингибитор протеазы антиретро-вирусный препарат для лечения ВИЧ-инфекций Активные исследования производных стрептоцида продолжаются и в настоящее время [62-66].
В частности, противоопухолевый препарат (Indisulam, Е7070) проходит стадию клинических испытаний. Особый интерес представляют соединения, в которых сульфаниламидный фрагмент комбинируется с другими классами антибактериальных препаратов. В частности, применение производных 15-членных азалидов, содержащих сульфаниламидную группу в 9а положении (схема 10), приводит как к значительному усилению антибактериальной активности, так и способствует снижению резистентности микроорганизмов [67]. Следует отметить работы, в которых исследуется влияние структуры соединений на антибактериальные свойства [68 - 71]. К примеру, в работе [71] показано, что антибактериальная активность определяется природой заместителей в ароматических кольцах. Введение электронодонорной аминогруппы в арильный заместитель при атоме серы (схема 11) значительно снижает антибактериальную активность, в то время как введение электроноакцепторнои нитрогруппы приводит к значительному усилению антибактериальных свойств. Варьирование электронных эффектов в анилидном фрагменте сказывается на биологической активности в значительно меньшей степени. Полученные данные широко используются для построения разнообразных математических моделей, обладающих прогностической способностью при поиске новых антибактериальных препаратов [72,73]. В соответствии с поставленной в настоящей работе задачей отдельно остановимся на проблеме транспорта биологически активных соединений через биологические барьеры. Хорошо известно, что в большинстве случаев трансмембранный перенос антибактериальных веществ осуществляется двумя способами - посредством простой и облегченной диффузии. В случае пассивного транспорта ключевую роль играет липофильно-гидрофильный баланс соединений - с ростом липофильности проницаемость через мембрану клетки значительно повышается. В этом аспекте особого внимания заслуживает работа [74], в которой отчетливо продемонстрирована важная роль липофильных характеристик (Log PC) хорошо известных антибактериальных препаратов в процессах массопереноса молекул через клеточные мембраны (рисунок 1).
Влияние строения сульфаниламидных и сульфаниловых производных пиридоксина на антибактериальную активность
Бактериостатические свойства производных пиридоксина были изучены на патогенных штаммах микроорганизмов Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli -грамотрицательные бактерии, a также Staphylococcus aureus — грамположительная бактерия. В качестве реперных соединений были использованы стрептоцид (IX), сульфаниловая кислота (X) и широко применяемый в медицинской практике высокоэффективный антибиотик цефалоспоринового ряда - цефазолин (XI). Исследование антибактериальной активности проводилось в КГТУ в группе доцента Никитиной Е.В. Предварительный скрининг антимикробной активности исследуемых веществ выявил, что процент ингибирования роста P. vulgaris всеми тестируемыми веществами в концентрации от 10"5 до 10"3 мг/мл через 6 и 12 ч составляет не более 10%, P. aeroginosa - не более 20%, а Е. coli - не более 15%, за исключением цефазолина, который ингибирует рост кишечной палочки на 24 % после 12 ч инкубирования. Вещества VI(a, в), VII(a, б) в концентрации 10" мг/мл через 12 ч инкубирования проявляют антимикробную активность в отношении золотистого стафилококка равную около 20%, а XI - 30%, в остальных случаях ингибирование было незначительным (около 10 %). В концентрации 10" мг/мл полученные вещества проявляют уже достаточно высокую антимикробную активность (таблица 5). После 6 ч инкубирования наибольшая активность из синтезированных веществ выявлена у и-(1,5-Дигидро-3,3,8-триметил-9-гидрокси- [1,3]диоксепино[5,6-с]пиридинил-6-азо)фенилсульфокислоты (VIB) (ингибирование роста протей 50%, стафилококка - 93%, псевдомонады - 62% и кишечной палочки - 32%). У остальных веществ выявлена избирательная антибактериальная активность: у образца (Vila) против Р. vulgaris ингибирование роста составило 40%, против Е. coli и S. aureus - 37% и 29%, соответственно, против P. aeroginosa эффективным оказался образец (VIII) (39%). При кратковременном инкубировании образец (VIB) является наиболее сильным антибактериальным агентом, сопоставимым по эффективности с цефазолином (ингибирование роста протей 52%, стафилококка - 54%, псевдомонады - 47% и кишечной палочки - 54%). Остальные вещества уступают по антимикробному действию антибиотику цефазолину, однако в большинстве случаев превосходят или сравнимы по ингибирующему эффекту с исходным антисептиком стрептоцидом.
Сульфаниловая кислота, как и ожидалось, практически не проявляет антибактериальных свойств (ингибирование роста протей 10%, стафилококка - 13%, псевдомонады - 6% и кишечной палочки - 13%). При увеличении времени культивирования бактериальных штаммов совместно с тестируемыми веществами антимикробная активность возрастает на 10-40% в зависимости от природы вещества и вида микроорганизма. Противоположная ситуация наблюдалась только в случае (VIB) и наиболее отчетливо, вне пределов экспериментальной ошибки определения, была замечена на псевдомонаде и протее. При инкубировании в течении 12 ч наибольший ингибирующий эффект у новых соединений в отношении протей выявлен у веществ (Via, У1ц) (54-57%). Производные сульфаниламида также эффективно подавляют рост псевдомонады -ингибирование составляет 74-79%, что выше чем у применяемого в настоящее время цефазолина, но ниже чем у стрептоцида. Наиболее эффективно рост кишечной палочки подавляет соединение (Via) (61 %). Относительно грамположительного стафилококка синтезированные нами соединения оказались малоэффективными. Исключение составило все то же производное сульфаниловой кислоты (VTB) (его токсическое действие - 85%). Антимикробная активность выше 40% была выявлена у производных сульфаниламида (Via, УІд и УПб), что выше антисептического действия стрептоцида, но значительно ниже антибактериальной активности цефазолина. Исследование динамики изменения подавления роста бактерий с увеличением времени культивирования бактериальных штаммов совместно с синтезированными веществами показало, что они не вызывают увеличения резистентности микроорганизмов при продолжительности эксперимента до 24 часов (рисунки 13,14). Важно отметить, что в случае реперного цефазолина на штамме Proteus vulgaris подавление роста бактерий не изменяется с увеличением времени культивирования, тогда как на штамме Staphylococcus aureus уже при двадцатичетырехчасовой продолжительности эксперимента его активность значительно понижается. Таким образом, при длительном воздействии эффективность полученных образцов становится сравнимой с эффективностью цефазолина. В растворах большинства тестируемых соединений, полученных после семичасового роста микроорганизмов, характерная полоса поглощения хромофорной азагруппы в области 430-460 нм полностью исчезает. В тоже время для производного пиридоксина с сульфаниловой кислотой (VIII) оптическая плотность растворов в той же области спектра поглощения меняется не столь драматично и зависит от вида микроорганизма. Так, в случае Proteus vulgaris оптическая плотность уменьшается в три раза, тогда как после инкубирования со штаммом Staphylococcus aureus практически не изменяется. Это обстоятельство позволяет однозначно утверждать, что все соединения проникают внутрь клетки и метаболизируются оксиредуктазами с образованием продуктов восстановления азасвязи (см. раздел 1.2 литературного обзора). Другими словами, пиридоксиновый фрагмент выполняет свою функцию по доставке фармакофорных групп.
Но как будет ясно из последующего обсуждения, это является, безусловно, необходимым, но далеко не достаточным условием. Рассмотрим влияние природы фармакофорных групп на бактериостатические свойства соединений. Как следует из результатов биологических испытаний существенное варьирование липофильных свойств производных сульфаниламида на основе пиридоксинового "скелета" не оказывает значительного влияния на антибактериальные свойства. Этот факт согласуется с литературными данными (см. раздел 1.2) и подтверждает бесперспективность использования сульфаниламидного фрагмента в качестве фармакофорной группы. Напротив, высокая антибактериальная активность некоторых производных сульфаниловой кислоты свидетельствует о ее высоком потенциале в качестве фармакофорной группы. Так, если исходная кислота практически не обладает антибактериальным действием, ее производное с пиридоксином (VIII) ингибирует рост бактерий на уровне лекарственного препарата стрептоцида. Введение кетальной защиты гидроксиметильных групп приводит к разительному усилению свойств: соединение (VIB) при шестичасовом культивировании с микроорганизмами, как минимум, не уступает, а на некоторых штаммах и превосходит антибиотик цефалоспоринового ряда - цефазолин. В тоже время близкие по липофильности другие производные, содержащие метальный и изопропильный заместители у ацетального атома углерода (VI6,r соответственно), показывают неожиданно низкую активность на уровне сульфаниловой кислоты. Столь интересные результаты подтолкнули нас к проведению дополнительных экспериментов, в ходе которых были изучены транспортные свойства производных сульфаниловой кислоты. Исследование скорости поглощения соединений VI(e,r), VIII клеточной культурой Rhodotorula glutinis с нарушенной клеточной стенкой было проведено на кафедре биохимии биолого-почвенного факультета КГУ в группе доцента Фаттаховой А.Н. Результаты приведены на рисунке 18.
Аппаратура
Использованные в работе растворители абсолютировали по стандартным методикам [147] и хранили над молекулярными ситами 4 А. Себациновая и адипиновые кислоты марки «ч» были использованы без дополнительной очистки. Пропионовый, масляный (марки "ч") и октиловый (фирмы "Acros organics" с чистотой 99%) альдегиды перед использованием сушили над прокаленным сульфатом натрия и очищали перегонкой. Нональ (фирмы "Acros organics" с чистотой более 98%) и 2-метилундеканаль (фирмы "Aldrich" с чистотой более 95%) были использованы без дополнительной очистки. Гексаметилендиизоцианат (фирмы "Acros organics" с чистотой 98%) перед использованием очищали перегонкой в вакууме. Растворы бромистого метила в ацетонитриле или бензоле были получены по стандартной методике взаимодействием бромида калия с диметилсульфатом. Пиридоксингидрохлорид (имп. с чистотой 99.8 %) использовали после дополнительной осушки в вакууме водоструйного насоса в течение 2 часов. Т. пл = 208-208.5 С с разложением (Т. пл. лит.= 209-210 С с разл. [148]). В работе были использованы лекарственные препараты прозерин и пиридостигмина бромид (калимин) в виде водных растворов концентраций 0,05% и 0,5% соответственно, стрептоцид и лекарственная форма цефазолин натрия. Ш.2 Аппаратура Спектры ЯМР Н зарегистрированы на приборе Varian Unity-300 (300 МГц) и Bruker Avance 400 (400 МГц). Данные элементного анализа получены на приборе Perkin Elmer 2400 Series II. Термогравиметрический анализ проводили на приборе NETZSCH STA 449 С в режиме DSCG. Контроль за ходом реакций и чистотой соединений проводили методом ТСХ на пластинах Silufol UV-254. Препаративную хроматографию соединений проводили на силикагеле КСКГ фр. 0.10-0.16 (Экофарм). Ш.З Методика изучения антибактериальной активности. Измерение антимикробной активности проводилось на штаммах микроорганизмов: Proteus vulgaris, Pseudomonas aeroginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, которые были выделены из физиологических жидкостей людей, больных инфекционными заболеваниями, выделение проводили в Казанского институте микробиологии. Культивирование бактерий осуществляли на стандартной питательной среде - мясо-пептонный агар (МПА).
Антимикробную активность исследовали при инкубировании тест-штаммов в мясопептонном бульоне в присутствии тестируемых соединений. За 12-15 ч до проведения эксперимента культуру штаммов стерильно переносили со скошенного МПА в пробирки с 5 мл МПБ для получения «ночной культуры», которую в дальнейшем разбавляли до концентрации клеток в среде 0,01 опт.ед. (А=600 нм). Полученную суспензию разливали по пробиркам с добавлением тестируемых веществ, растворенных в 50% водном растворе ДМСО, в конечной концентрации от 10" до 10" мг/мл, в качестве контроля использовали растворитель. Инкубирование приводили при 37 С в течение 6 и 12 ч. Измерение оптической плотности проводили фотометрически на спектрофотометре СФ-2000 при 600 нм. Рассчитывали процент ингибирования роста относительно контроля. 1,5-Дигидро-3,3»8-триметил-[1,3]диоксепино[5,6-с]пиридин-9-ол (16). Через суспензию 20 г (96 ммоль) осушенного в вакууме водоструйного насоса коммерчески доступного пиридоксингидрохлорида (1) в 300 мл ацетона, при охлаждении до 3-5С и перемешивании пропускали 22 г (603 ммоль) хлористого водорода. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 5 ч, выдерживали 20 ч при комнатной температуре, затем осадок отфильтровали, промыли эфиром и нейтрализовали 25%-ным водным раствором поташа. Продукт отфильтровывали, сушили на воздухе и перекристаллизовали из этилового спирта. Выход 17.9 г (выход 87 %.), т.пл. 184.5-186С (184-185С [44]). Спектр ЯМР !Н (ДМСО-cfe), 5, м.д.: 1.44 с (6Н, 2СН3), 2.38 с (ЗН, СН3), 4.74 с (2Н, СН2), 4.86 с (2Н, СН2), 7.75 с (1Н, СН) 1,5-Дигидро-3,8-диметил-[1,3]диоксепино[5,6-с]пиридин-9-ол (1а). Через суспензию 20 г (0.096 моль) пиридоксингидрохлорида в 300 мл уксусного альдегида, при охлаждении до 3-5С и перемешивании пропустили 22 г (0.603 моль) хлористого водорода. Полученную реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч, затем осадок отфильтровали, промыли эфиром и нейтрализовали 25%-ным водным раствором поташа. Продукт отфильтровывали, сушили на воздухе и перекристаллизовали из этилового спирта. Выход составил 65%. Т. пл. 186-186.5 С, ЯМР 1Н (300 МГц, ацетон-d6 ): 5 1.31 ( д, 3JHH=6 Гц, СН3, 3 Н); 2.36 (с, СН3, 3 Н); 4.73, 5.21 (АВ, 2JHH=-15.4 Гц, СН2 ); 4.74, 4.86 (АВ, 2JHH=-14.4 Гц, СН2 ); 5.05 (к, 3JHH=6 Гц, 1 Н ); 7.74 (с, СН, 1 Н ).Найдено5 %: С 61.53; Н 6.61; N 7.08. C12Hi5N04. Вычислено, %: С 61.52, Н 6.71, N7.17. Методика получения семичленных ацеталей пиридоксина (1в-е) конденсацией в абсолютном диметилсульфоксиде. К раствору хлористого водорода (полученного из 10.5 г (0.095 моль) хлористого кальция и избытка конц. серной кислоты) в 50 мл абсолютного диметилсульфоксида добавили 5 г (0.024 моль) пиридоксингидрохлорида и 0.048 моль карбонильного соединения (пропионовый альдегид, масляный альдегид, изомасляный альдегид, октаналь). Реакционную массу нагревали 2 часа при 50 - 60 С. Затем вылили в 30 мл водного раствора 14.5 г (0,136 моль) карбоната натрия при перемешивании, и нейтрализовали разбавленным раствором хлористого водорода до рН 7. Выпавший осадок отфильтровали, маточный раствор высушили в вакууме и получившуюся маслообразную смесь промыли водой.
Не растворившуюся в воде массу объединили с осадком, полученным после нейтрализации реакционной массы, и перекристаллизовали из этилового спирта. Выходы 30-60%. 1,5-Дигидро-3-этил-8-метил-[1,3]диоксепино[5,6-с]пиридин-9-ол (1в). Т.пл. 153 С, ЯМР Н. (300 МГц, ДМСО-ё6 ): 8 0.86 ( т, 3JHH= 7.5 Гц, СН3., 3 Н); 1.58 (м, СН2., 2 Н ); 2.34 ( с, СН3, 3 Н); 4,65, 5.13 (АВ, 2J= 15.3Гц, СН2, 2 Н); 4,69, 4.77 (АВ, 2J= 15,0, СН2, 2 Н ); 4,81 (т 3J= 5.6 Гц, СН, 1 Н ); 7,75 (с, СН., 1 Н). 1,5-Дигидро-3-пропил-8-метил-[1,3]Диоксепино[5,6-с]пиридин-9-ол (1г). Т.пл. 136 С, ЯМР ]Н. (300 МГц, ДМСО-ё6 ): 8 0.89 ( т, 3JHH= 7.4 Гц, СН3., 3 Н); 1.35 (м, СН2., 2 Н ); 1,56 ( м, СН2., 2 Н); 2,35 (с, СН3., З Н); 4,68 5,13 (АВ, 2J= 15.3Гц, СН2., 2 Н); 4,73 4,79 (АВ, 2J= 14,3, СН2., 2 Н ); 4,92 (т 31=5.5Гц, СН., 1 Н ) 7,80 (с, СН., 1 Н) 8,94 (с, ОН, 1 Н ). 1,5-Дигидро-3-изопропил-8-метил-[1,3]Диоксепино[5,6-с]пиридин-9-ол (Ід). Выход 62 %. Т.пл. 163.5-164С (лит. 164-164.5 С [149]), ЯМР Н (300 МГц, ацетон-с1б ): 8 1.31 ( д, 3JHH = 6 Гц, СН3, 3 Н); 2.36 (с, СН3, З Н); 4.73, 5.21 (AB, 2JHH = -15.4 Гц, CH2 ); 4.74, 4.86 (AB, 2JHH = -14.4 Гц, CH2 ); 5.05 (к, 3JHH= 6 Гц, 1 Н ); 7.74 (с, СН, 1 Н ). Найдено, %: С 61.53; Н 6.61; N 7.08. Ci2H15N04. Вычислено, %: С 61.52, Н 6.71, N 7.17. 1,5-Дигидро-3-гептил-8-метил-[1,3]диоксепино[5,6-с]пиридин-9-ол (1е). Т.пл. 145 С, ЯМР 1Я (300 МГц, ДМСО-de): 5 0,86 (т 3J=7 Гц., СН3, З Н); 1,25 (м, СН2, 10 Н); 1,57 (м, СН2, 2 Н); 2,35 (с, СН3, 3 Н); 4,66 5,14 (АВ, 21=15Гц, СН2, 2 Н); 4,71 4,77 (АВ, 2.Г=14Гц, СН2, 2 Н); 4,89 (т 31=5,4Гц, СН, 1 Н); 7,76 (с, СН, 1 Н). Методика получения семичленных ацеталей пиридоксина (1ж,з) конденсацией в бензоле с азеотропной отгонкой воды. В круглодонной колбе, снабженной насадкой Дина-Старка, приготовили суспензию 5 г (0.024 моль) пиридоксингидрохлорида, 1.34 г (0,007 моль) моногидрата я-толуолсульфокислоты и 0.02 моль карбонильного соединения (нональ, 2-метилундеканаль) в 150 мл бензола. Реакционную массу кипятили 2 ч, затем растворитель отгоняли в вакууме. К полученной смеси добавили раствор 0.32 г (0,008 моль) гидроксида натрия в 100 мл воды и нейтрализовали до рН 7 разбавленной соляной кислотой. Выпавший маслянистый осадок отфильтровали, промыли водой и смесью ацетон-гептан в соотношении 1:1 и перекристаллизовали из этилового спирта. Выход 30-35%. 1,5-Дигидро-3-октил-8-метил-[1,3]диоксепино[5,6-с]пиридин-9-ол (Ьк). Выход 35%. ЯМР [Н (300 МГц, ДМСО-ё6): 5 0,86 (т 3J= 6.7 Гц., СН3, 3 Н); 1.24 (уш.с, 6СН2, 12 Н); 1.56 (м, СН2, 2 Н); 2.34 (с, СН3, З Н); 4.65 5.13 (АВ, 2J= -15.3 Гц., СН2, 2 Н); 4.71 4.77 (АВ, 2J= -14.1 Гц., СН2, 2 Н); 4,86 (т 3J=5.4 Гц, СН, 1 Н); 7.74 (с, СН, 1 Н). 1,5-Дигид ро-3-(1-метилдецил)-8-метил- [1,3 J диоксепи но [5,6-с]пиридин-9-ол (Із). Выход 30%. ЯМР !Н (300 МГц, ДМСО-сіб): 5 0,85 (т, 3J=7.0 Гц., СН3, 3 Н); 0.85 (д, 3J= 6.5 Гц., СН3, 3 Н); 1.24 (уш.с, 7СН2, 14 Н); 1.32 (м, СН2, 1Н); 1.46 (м, СН2, Ш); 1.68 (м, СН2, 2 Н); 2.35 (с, СН3, З Н); 4.65 (д, 3J= 5.26Гц., СН, 1 Н); 4.66 5.18 (АВ, 21=-15.2Гц., СН2, 2 Н); 4.75 4.78 (АВ, 21=14.2Гц., СН2, 2 Н); 7.80 (с, СН, 1 Н).
Рентгеноструктурное исследование
Рентгеноструктурное исследование соединений выполнено на автоматическом рентгеновском дифрактометре " Smart Apex II " (?i(Mo-Ka) = 0.71073 А, температура 293 К). Структура расшифрована прямым методом. Позиции и температурные параметры неводородных атомов уточнены в анизотропном приближении полноматричным МНК. Атомы водорода выявлены из разностных рядов электронной плотности и уточнены в изотропном приближении. Все расчеты выполнены с использованием комплекса программ SHELXL-97. 1. Впервые синтезирован широкий ряд семичленных ацеталей пиридоксина, значительно различающихся по гидрофильно-липофильному балансу. 2. Синтезированы новые карбамоилированные и азопроизводные пиридоксина, являющиеся структурными аналогами лекарственных препаратов. 3. Взаимодействие бис(1,5-дигидро-3,3,8-триметил-[1,3]диоксепино[5,6-с]пиридин-9-ил)гексан-1,6-дикарбамата с бромистым метилом в присутствии бутиллития приводит к образованию неожиданного продукта [9,9 -(гексан-1,6-дикарбамоилокси)бис(1,5-дигидро-3,3,8-триметил-7-этил-[1,3]диоксепино [5,6-с]пиридиний)]дибромида. 4. Антибактериальная активность широкого ряда сульфаниламидных производных ацеталей пиридоксина практически не зависит от гидрофильно-липофильного баланса соединений. 5. Антибактериальные свойства производных сульфаниловой кислоты определяются липофильными характеристиками соединений и устойчивостью ацетального цикла к гидролизу. и-(1,5-Дигидро-3,3,8-триметил-9-гидрокси-[153]диоксепино[5,6-с]пиридинил-6- азо)фенилсульфокислота ингибирует рост бактерий на уровне антибиотика цефалоспоринового ряда - цефазолина. 6. В ряду 1,5-Дигидро-3-К-7,8-диметил-9-диметилкарбамоилокси-[1,3]Диоксепино[5,6-с]пиридиний бромидов средняя смертельная доза и эффективная действующая концентрация линейно уменьшаются с ростом липофильности соединений до R = С7Н15. Дальнейшее увеличение длины алкильного заместителя приводит к смене мишени. С ростом скорости неспецифического кислотного гидролиза семичленных формалей, ацеталей и кеталей с планарным фрагментом длительность антихолинэстеразной симптоматики уменьшается. 7. Впервые показано, что использование ацеталей и кеталей пиридоксина для внутриклеточного транспорта гидрофильных фармакофорных групп является перспективным направлением медицинской химии.
Актуальность темы. Направленный синтез нового поколения биологически активных соединений, сочетающих в себе высокую эффективность и низкую токсичность, является одним из приоритетных направлений современной органической химии. В области науки и техники общеприняты способы внутриклеточной доставки активных веществ, основанные на преодолении защитных барьеров организма, к числу которых относятся, в частности, кожные покровы, оболочки органов и клеточные мембраны. Многие активные вещества плохо преодолевают эти барьеры вследствие высокой гидрофильности, которая ограничивает их транспорт через липидные барьеры (например, межклеточный жировой слой кожи и липидные мембраны клеток). Накоплению активных веществ в устойчивых к ним клетках, таких как опухолевые клетки и патогенные микроорганизмы, также препятствует высокая активность в этих клетках мембранных транспортных белков, которые осуществляют выброс веществ из цитоплазмы. Для достижения нужной терапевтической концентрации активного вещества в клетке или органе-мишени традиционным подходом является увеличение используемой дозы вещества в организме. В результате увеличиваются побочные эффекты активного вещества, которые часто превосходят по последствиям положительный терапевтический эффект от его применения. В связи с этим перспективным подходом к увеличению проницаемости биологических барьеров для активных веществ является создание эффективных и безопасных систем их внутриклеточного транспорта. Создание подобных транспортных систем позволит значительно уменьшить терапевтическую дозу активных веществ, и, как следствие, их побочные эффекты, и тем самым совершить качественный прорыв в фармакологии и медицине. В течение последних лет в Химическом институте им. A.M. Бутлерова проводится систематическое изучение химических, биологических и физических свойств производных пиридоксина - одного из ключевых витаминов, вовлеченных в метаболизм с более чем 50 ферментами. Установлены факторы, определяющие пространственное строение семичленного гетероцикла в зависимости от природы заместителей у фенольного атома кислорода и ацетального атома углерода, начаты исследования in vitro и in vivo антибактериальных и антихолинэстеразных свойств ацеталей и кеталей пиридоксина. Основываясь на полученных результатах, представлялось целесообразным направить дальнейшие усилия, во-первых, на синтез широкого круга транспортных систем на основе производных пиридоксина, содержащих фармакофорные группы в третьем и шестом положениях пиридинового цикла. Во-вторых, провести скрининг их антибактериальной и антихолинэстеразной активности и, в-третьих, на основе выявленных фундаментальных закономерностей "структура — биологическая активность" оптимизировать состав и структуру лабораторных образцов для проведения стадии доклинических испытаний. Целью работы является направленный синтез широкого круга производных ацеталей и кеталей пиридоксина, различающихся по гидрофильно-липофильному балансу, и установление основных закономерностей взаимосвязи структуры соединений с их антибактериальной и антихолинэстеразной активностью.
Научная новизна работы состоит в том, что впервые: синтезированы семичленные ацетали пиридоксина с липофильными заместителями у ацетального атома углерода; получены новые карбамоилированные и азопроизводные пиридоксина - структурные аналоги лекарственных препаратов калимина и сульфасалазина; обнаружена необычная реакция образования [9,9 -(гексан-1,6-дикарбамоилокси)бис(1,5-дигидро-3,3,8-триметил-7-этил-[1,3]диоксепино[5,6-с]пиридиний)]дибромида из соответствующего биспиридинового основания алкилированием метилбромидом в присутствии бутиллития; установлены факторы, определяющие бактериостатическую in vitro и антихолинэстеразную in vivo активность. Антихолинэстеразные свойства карбамоилированных ацеталей пиридоксина и антибактериальная активность 6-азасульфаниловых производных определяются липофильными свойствами соединений и устойчивостью ацетального цикла к гидролизу. Варьирование в широких пределах липофильности сульфаниламидных производных ацеталей пиридоксина не оказывает существенного влияния на их антибактериальную активность. Практическая значимость. Разработаны подходы к синтезу кинетически контролируемых семичленных и термодинамически выгодных шестичленных ацеталей пиридоксина с длинноцепочечными алифатическими заместителями у ацетального атома углерода. На основе исследования антибактериальных и антихолинэстеразных свойств полученных соединений установлены основные закономерности влияния структуры производных пиридоксина на их биологическую активность. Показано, что использование пиридоксинового "скелета" для доставки фармакофорных групп внутрь живой клетки является перспективным направлением медицинской химии. Некоторые из полученных в работе лабораторных образцов, проявивших в ходе скрининга высокую антибактериальную и антихолинэстеразную активность, находятся на стадии доклинических испытаний.
