Синтез, антиоксидантная и биологическая активность S-[-(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов и -(-гидроксиарил)алкансульфонатов натрия Олейник Алёна Сергеевна

Содержание к диссертации

Введение

1. Литературный обзор 9

1.1. Фенольные антиоксиданты 9

1.1.1. Классификация ингибиторов свободнорадикального окисления 9

1.1.2. Механизм ингибирующего действия фенольных антиоксидантов 12

1.1.3. Взаимосвязь структуры и антиокислительной активности 15

1.1.4. Бифункциональные ингибиторы. Явление синергизма 20

1.2. Водорастворимые антиоксиданты фенольного типа 27

1.2.1. Химически модифицированные производные природных соединений 28

1.2.2. Синтетические водорастворимые антиоксиданты 31

1.3. Соли Бунте 36

1.3.1. Получение органических тиосульфатов 37

1.3.2. Химические свойства органических тиосульфатов 39

1.3.3. Биологическая активность и антиокислительные свойства 42

1.4. Заключение 46

2. Синтез 8-(ю-(гидроксиарил)алкил)тиосульфатов и со-(гидроксиарил)- алкансульфонатов натрия 48

2.1. Исходные вещества и промежуточные продукты 49

2.2. Синтез 8-[со-(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов натрия 53

2.3. Синтез (О-(гидроксиарил)алкансульфонатов натрия 59

2.4. Заключение 61

3. Исследование антиоксидантной активности синтезированных соединений 63

3.1. Изучение антирадикальной активности 8-[со-(4-гидроксиарил)алкил]-тиосульфатов и -сульфонатов 65

3.2. Изучение общей ингибирующей активности 78

3.2.1. Модель Си2+-индуцированного окисления этилолеата в водно-эмульсионной среде 79

3.2.2. Модель автоокисления сливочного масла 81

3.3. Заключение 86

4. Исследование биологической активности синтезированных соединений. 88

4.1. Исследование влияния гидрофильных производных на биолюминесценцию Photobacterium phosphoreum 88

4.2. Исследование биоантиоксидантных свойств in vitro и in vivo 98

4.3. Заключение 104

5. Экспериментальная часть 106

5.1. Материалы и оборудование 106

5.2. Методы анализа и исследования 106

5.3. Синтез функционально-замещённых алкилфенолов 107

5.3.1. Получение исходных веществ и полупродуктов 107

5.3.2. Синтез 8-(ю-(гидроксиарил)алкил)тиосульфатов 115

5.3.3. Синтез (о-(гидроксиарил)алкансульфонатов 118

5.4. Исследование антиоксидантной активности синтезированных соединений 121

5.4.1. Модель инициированного окисления метилолеата в водном растворе додецилсульфата натрия 121

5.4.2. Модель Си2+- индуцированного окисления этилолеата в водно-эмульсионной среде 123

5.4.3. Модель автоокисления сливочного масла 123

5.5. Исследование влияния гидрофильных алкилфенолов на биолюминесценцию Photobacterium phosphoreum 124

Выводы 125

• Водорастворимые антиоксиданты фенольного типа
• Синтез 8-[со-(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов натрия
• Изучение общей ингибирующей активности
• Исследование биоантиоксидантных свойств in vitro и in vivo

Введение к работе

К настоящему времени научно обоснована необходимость включения антиокси-дантов в комплексную профилактику и терапию патологических состояний, сопровождающихся активизацией оксидантных процессов в организме. Большинство фенольных антиоксидантов (ФАО), применяемых в настоящее время в медицинской практике, обладают липофильными свойствами, между тем более привлекательными для использования в фармацевтических целях считаются гидрофильные соединения, выгодно отличающиеся от липофильных аналогов большей биологической доступностью и скоростью транспорта в организме, а так же возможностью направленного инъекционного введения.

Описанные в литературе водорастворимые ФАО, как правило, представляют собой производные природных или синтетических фенолов, модифицированные посредством введения гидрофильных групп, в роли которых выступают остатки Сахаров или диссоциирующие группировки. Противоокислительные свойства таких соединений определяются их антирадикальной активностью. В то же время известно, что в ряду ФАО наиболее эффективными ингибиторами процессов свободнорадикального окисления являются антиок-сиданты полифункционального действия, в частности, серо(азот)содержащие производные алкилированных фенолов, способные инактивировать как свободные радикалы, так и их предшественники - липопероксиды.

Ранее в НИИ химии антиоксидантов НГПУ на основе ю-(4-гидроксиарил)галоген-алканов был осуществлен синтез водорастворимых полифункциональных ФАО, содержащих в качестве гидрофильных группировок алкиламмонийные и изотиурониевые группы. Однако in vivo для данных соединений наряду с выраженной протекторной активностью фиксировали и проявление токсических свойств.

Вместе с тем, осуществлять направленный синтез новых гидрофильных ФАО, по свойствам заданным образом отличающихся от известных аналогов, до последнего времени не представлялось возможным в силу отсутствия достаточного количества сведений о влиянии структуры таких антиоксидантов на их биоантиокислительные свойства.

Таким образом, получение новых классов гидрофильных ФАО и изучение характера изменения их противоокислительных свойств и биологической активности в зависимости от строения сохраняют актуальность.

В качестве полярных фрагментов для введения в молекулу ФАО мы решили использовать тиосульфатную и сульфонатную группы по следующим причинам:

Во-первых, - эти группировки хорошо диссоциируют и должны придавать соединениям достаточную гидрофильность;

Во-вторых, - известно, что тиосульфаты способны восстанавливать гидроперокси-ды, а, следовательно, соединения, сочетающие в своей структуре фенольную и тиосуль-фатную группы могут рассматриваться как полифункциональные антиоксиданты.

В соответствии с вышесказанным, целью настоящей работы явились синтез структурно-связанных рядов 8-[о>(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов и со-(гидроксиарил)-алкансульфонатов натрия и сравнительное исследование их антиоксидантной и биологической активности.

Для достижения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. Отработать методики получения тиосульфатов и сульфонатов на основе со-(гидроксиарил)галогеналканов и осуществить синтез 8-[а>-(гидроксиарил)алкил]-тиосульфатов и ю-(гидроксиарил)алкансульфонатов натрия различного строения.

2. Провести сравнительное исследование антиоксидантной активности синтезированных соединений в различных модельных системах.

3. На примере влияния синтезированных соединений на светящиеся бактерии Photobacterium phosphoreum отследить закономерности изменения токсических свойств гидрофильных ФАО в зависимости от строения.

В процессе выполнения настоящей работы были предложены эффективные методики получения 8-[ш-(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов и со-(гидроксиарил)-алкансульфонатов с выходами до 95 и 85 % соответственно, основанные на взаимодействии соответствующих бромалканов с ШгЗгОз и Na2SC>3 в водно-спиртовом растворе.

Апробированы способы синтеза названных тиосульфатов и сульфонатов из ю-(гидроксиарил)хлор(иод)алканов.

Осуществлён синтез новых гидрофильных фенольных антиоксидантов - S-[co-(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов и со-(гидроксиарил)алкансульфонатов, - образующих структурно-взаимосвязанные ряды, в пределах которых соединения различаются числом и строением орто-алкильных заместителей у фенольной ОН-группы, природой ионогенного фрагмента и степенью его удалённости от ароматического ядра, а также положением заместителя с тиосульфатной группой относительно фенольного гидроксила и числом ОН-групп в ароматическом ядре.

Проведено сравнительное исследование антиоксидантной активности (АОА) синтезированных соединений в различных модельных системах.

Для 39 гидрофильных и липофильных алкилфенолов определены константы скорости взаимодействия с пероксидными радикалами ку в модельной реакции инициированного окисления метилолеата в водно-мицеллярном растворе додецилсульфата натрия при 60 С. Показано, что в рядах 8-[3-(4-гидроксиарил)пропил]тиосульфатов и соответствую-

щих пропансульфонатов с различным числом и строением o/wo-заместителей увеличение степени пространственного экранирования фенольного гидроксила неоднозначно отражалось на изменении величин kf. наиболее высокими значениями ку (1.26-1.52*10⁴ М~'с^-1) характеризовались метилциклогексил- и дициклогексилзамещенные производные, наиболее низкими (2.0-4.О10² ІУГ'с^-1) - opmo-незамещенные соединения. Величины ку, измеренные для наиболее экранированных ди-итрет-бутилзамещенных гидрофильных фенолов принимали промежуточные значения: от 3.5»10³ до 1.02»10⁴ ІУГ'сЛ Удлинение алкильной цепи, разделяющей арильный и тиосульфатный фрагменты, в молекулах моно- и т-орто-mpew-бутилзамещенных солей Бунте приводило к увеличению константы скорости ку.

Способность 8-[со-(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов и ю-(гидроксиарил)алкан-сульфонатов натрия ингибировать Си -индуцированное окисление этилолеата в водно-эмульсионной среде и автоокисление сливочного масла возрастала при увеличении степени пространственного экранирования фенольного гидроксила. Наиболее эффективными ингибиторами окисления в этих модельных системах являлись орто-дн-трет-бутилзамещенные производные. Вместе с тем, независимо от характера оршо-замещения 8-[со-(гидроксиарил)алкил]тиосульфаты превосходили по АОА соответствующие сульфо-наты, что свидетельствует о проявлении тиосульфатной группой самостоятельной проти-воокислительной активности. Это позволяет считать 8-[со-(гидроксиарил)алкил]-тиосульфаты полифункциональными антиоксидантами.

Впервые для структурно-связанных рядов гидрофильных алкилфенолов проведено сравнительное исследование токсических свойств. С использованием биохемилюминес-центного метода было изучено влияние 8-[со-(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов и соответствующих им сульфонатов и хлоридов изотиурония на жизнеспособность бактериальных культур Photobacterium phosphorewn. Установлено, что степень токсического влияния гидрофильных алкилфенолов на Ph. phosphorewn зависит как от природы ионогенного фрагмента, так и от степени пространственного экранирования фенольной ОН-группы. Показано, что в рядах 8-[ю-(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов натрия и хлоридов S-[co-(гидроксиарил)алкил]изотиурония степень токсического влияния соединений на Ph. Phos-phoreum и острая токсичность в отношении лабораторных животных коррелируют друг с другом. Установлено, что в отличие от липофильных ФАО, среди которых наименее токсичными являются пространственно-затрудненные 2,6-ди-трет-бутилфенолы, в рядах гидрофильных алкилфенолов острая токсичность снижается при уменьшении степени пространственного экранирования фенольного гидроксила.

Биологическую активность синтезированных соединений изучали также в НИИ терапии, НИИ клинической иммунологии, НИИ молекулярной биологии и биофизики, НЦ

клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, в том числе при финансовой поддержке РФФИ (грант 05-04-48819 «Активация антиоксидант-отвечающего элемента новыми гидрофильными бифункциональными фенольными антиоксидантами»).

Показано, что in vitro синтезированные соединения проявляют выраженную инги-бирующую активность в отношении различных видов активированных кислородных метаболитов. При этом во всех модельных системах независимо от степени пространственного экранирования фенольной ОН-группы соединения с тиосульфатной группой превосходили по эффективности соответствующие сульфонаты.

Для 8-[3-(3,5-ди-/я/?еш-бутил-4-гидроксифенил)пропил]тиосульфата натрия и ряда его структурных аналогов показано наличие гепатопротекторной и противовоспалительной активности in vivo, а также кардиопротекторных и иммуномодулирующих свойств. Выявлено, что тиосульфаты и сульфонаты со-(гидроксиарил)алкильного ряда могут влиять на антиоксидантный статус живых организмов и опосредованно через влияние на геном клетки посредством активации антиоксидант-респонсивного элемента.

Установлено, что по степени токсического воздействия на лабораторных животных (мыши) все синтезированные нами тиосульфаты и сульфонаты относятся к IV-V классам токсичности (малотоксично - практически нетоксично).

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что синтезированные соединения характеризуются низкой токсичностью и высокой антиокси-дантной и биологической активностью, а, соответственно, потенциально могут быть использованы при создании биоантиоксидантных препаратов для практического использования в биологии и медицине.

Материалы диссертации докладывались на II и III Всероссийских конференциях молодых ученых и школах им. академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (г. Москва, 2006, 2008), VII Международной конференции «Био-антиоксидант» (г. Москва, 2006), XLIII и XLVII Международных научных студенческих конференциях «Студент и научно-технический прогресс» (г. Новосибирск, 2005, 2009), XI Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ» (г. Новосибирск, 2006), VII Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь и наука XXI века» (Красноярск, 2006), Межвузовской конференции «Химическая наука и образование Красноярья» (г. Красноярск, 2007), Всероссийской конференции «Современные проблемы органической химии» (г. Новосибирск, 2007), X Молодежной конференции по органической химии (г.Уфа, 2007), а так же на XV Международной конференции и

дискуссионном научном клубе «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта-Гурзуф, 2007 г).

Основное содержание диссертационной работы отражено в 18 публикациях: 3 статьи в рецензируемых журналах, 1 статья в сборнике и 14 тезисов докладов.

Диссертация состоит из введения, пяти глав (литературный обзор, три главы обсуждения результатов собственных исследований и экспериментальная часть), выводов, списка цитируемой литературы (240 наименований, включая собственные публикации автора по теме диссертационной работы) и приложений. Объем диссертации без приложений - 144 страницы, она иллюстрирована 21 таблицей и 16 рисунками.

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной университетской темы «Синтез и исследование полифункциональных фенольных антиоксидантов» (номер государственной регистрации 01.200.209186).

Автор выражает искреннюю благодарность за помощь, оказанную при проведении данной работы, своим коллегам Просенко А.Е., Дюбченко О.И., Маркову А.Ф., Гороху Е.А., Степановой Т.С., Трубниковой Ю.Н., Ягунову С.Е., сотрудникам НИОХ СО РАН Шакирову М.М. и Филатовой Л.С, а также Меньщиковой Е.Б. и Зенкову Н.К. (НЦ КЭМ СО РАМН) и Душкину М.И. (НИИ клинической и экспериментальной медицины СО РАМН); Российскому фонду фундаментальных исследований за доступ к базам данных STN International (грант 00-03-32721) через Новосибирский центр STN в НИОХ СО РАН и поддержку исследований биологической активности синтезированных соединений (грант 05-04-48819).

Водорастворимые антиоксиданты фенольного типа

Традиционные области применения ФАО не предполагали наличия у этих соединений водорастворимых свойств, интерес к водорастворимым формам ФАО проявился сравнительно недавно и обусловлен главным образом потребностями медицинской практики. Водорастворимые ФАО, по сравнению со своими липофильными аналогами, характеризуются большей биологической доступностью и скоростью транспорта в организме, что делает их незаменимыми для использования в экстренных случаях свободнорадикаль-ных патологий. Кроме того, поскольку окислительные процессы в живых организмах протекают как в липидной среде (клеточные мембраны), так и в водной, наиболее эффективной является антиоксидантотерапия, основанная на комбинированном использовании ли-пидо- и водорастворимых АО [74, 75]. В живых организмах основными липофильными АО являются токоферолы, в связи с чем их молекулы часто используются как базис для получения новых препаратов с заданными свойствами. Одним из первых таких антиоксидантных препаратов в 1974 г. был синтезирован водорастворимый аналог а-токоферола - Trolox (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота), имеющий вместо боковой изопреноидной цепи карбоксильную группу [76]: В большинстве модельных систем Trolox не уступает а-токоферолу по антирадикальной активности (АРА) [8, 77], а по данным [78] при окислении водного раствора альбумина (ССЦ + УФ-облучение) Trolox эффективнее а-токоферола предохраняет белок от повреждающего действия свободных радикалов. В то же время в некоторых модельных системах in vitro по своей способности ингибировать пероксидацию липидов Trolox уступал ионолу и некоторым другим липофильным производным ПЗФ [79]. Посредством трансгликозилирования с использованием а-гликозидазы был получен аналог а-токоферола - 2-(сс-В-глюкопиранозил)метил-2,5,7,8-тетраметил-хроман-6-ол (TMG) - с высокой растворимостью в воде (более 1 г/мл) [80]: но он TMG проявляет высокую антиоксидантную активность in vitro [81]: в реакции индуцированного окисления метиллинолеата ингибирующая активность TMG не отличалась от таковой для а-токоферола, кроме того TMG подавлял окисление липосом из яичного желтка более эффективно, чем аскорбиновая кислота.

Определенную известность получил также антиоксидант ЕРС-К1, сочетающий в своей структуре фрагменты а-токоферола и аскорбиновой кислоты. Данное соединение обладает водорастворимыми свойствами и одновременно содержит в своей структуре ли- пофильный фрагмент, что обуславливает его высокую АРА как в отношении липидных радикалов, так и в отношении радикалов, генерируемых в водной среде клетки. Так, например, константы скорости взаимодействия ЕРС-К1 с радикалами линолиевой кислоты гидроксильными радикалами составляют 2.8-10 и 7.1 10 М" с" , соответственно [82]. ЕРС-К1 способен также снижать пул НО в системах Си2+/Н202 и Ре2+/Нг02 опосредованно через хелатирование ионов металлов [83]. В системах in vitro EPC-Kl превосходит по АО А как индивидуальный витамин Е, так и его смесь с витамином С [84]. Препарат EPC-Kl считается эффективным кардиопротектором и перспективен для коррекции последствий ишемии-реперфузии [84, 85]. Отличительной особенностью водорастворимых препаратов на основе а-токоферола является наличие у них направленного антиоксидантного действия. Так, например, сочетанием хроманового фрагмента а-токоферола и алкиламмонийной группы получены препараты с направленным кардиопротекторным действием: Связывание таких препаратов с кардиомиоцитами происходит в 20-30 раз эффективнее, чем с другими мышечными клетками, аналогичные препараты без четвертичной аммонийной группы таким сродством с кардиомиоцитам не обладают [86, 87]. По данным [88] эти препараты значительно эффективнее а-токоферола и тролокса ингибировали окислительные процессы in vitro. Присоединение к активному антиоксидантному фрагменту а-токоферола липо-фильной катионной группы позволило получить соединения, которые в клетках направленно транспортируются в митохондрии и защищают их от окислительных повреждений более эффективно, чем обычный витамин Е [89]: В литературе так же описаны производные пластохинона и метилпластохинона, содержащие в своей структуре в качестве катиона трифенилалкилфосфониевые группы, метилкарнитин, трибутиламмоний или родамин [90]. На плоских бислойных фосфоли-пидных мембранах отобраны производные с наибольшей проникающей способностью: пластохинонилдецилтрифенилфосфоний (SkQl), пластохинонилдецилродамин (SkQRl) и метилпластохинонилдецилтрифенилфосфоний (SkQ3): Установлено, что АОА данных соединений изменяется следующим образом: SkQl = SkQRl SkQ3.

На клетках человеческих фибробластов и HeLa установлено, что SkQl и SkQRl в чрезвычайно низких концентрациях блокируют апоптоз, вызванный Н2О2 (Сід для SkQRl = 10"12 М). В исследованиях на мышах показано, что SkQl тормозит развитие трёх разных типов ускоренного старения (прогерии), а также обычное старение (особенно на ранних стадиях). Аналогичное действие выявляется при изучении старения беспозвоночных (дрозофил и дафний). Действие SkQ 1 сопровождается торможением развития таких старческих болезней млекопитающих, как остеопороз, инволюция тимуса, катаракта, ретинопатия и др. Особенно яркий положительный эффект был обнаружен при врожденной дисплазии сетчатки (радикальное улучшение в 67 % случаев) и при ее вторичной дегенерации (54 %). Кроме того, обнаружено, что предварительное введение экспериментальным животным 0,2 нМ SkQl значительно снижает аритмию изолированного сердца, вызванную Н2О2, на 40 % уменьшает зоны инфаркта миокарда и инсульта и спасает животных от гибели при инфаркте почки (снижение уровня смертности с 80 до 20%) [90]. Практически повсеместное распространение в растительном мире имеют оксибен-зойные и оксикоричные кислоты, они играют важную роль в обмене веществ и служат биогенетическими предшественниками подавляющего числа других природных феноль-ных соединений [87]. В результате сравнительного исследования АОА рядов структурно-взаимосвязанных производных Р-(4-гидроксифенил)пропеновой (оксикоричной) и 4-гидроксибензойной кислот было установлено [91], что производные оксикоричной кисло- ты, в которых карбоксильная группа отделена от ароматического кольца винильным мостиком, характеризуются более высокой АОА, чем соответствующие производные бензойной кислоты (табл. 7). Наиболее эффективными АО оказались соединения пирокатехинового типа БК-2 и КК-2, высокую АОА которых авторы связывают с возможностью участия образуемых ими феноксилов Аг(ОН)0" в реакции диспропорционирования, сопровождающейся регенерацией исходного ингибитора Аг(ОН)2: Н.Н. Богдашевым с соавт. показано [92], что натриевые соли коричной кислоты и её производных, не содержащих в ароматическом ядре гидроксильных заместителей, также проявляют выраженную АОА, хотя и уступают в этом плане соответствующим производным оксикоричной кислоты. АОА производных коричной кислоты авторы связывают с наличием в их структуре винильного фрагмента и отмечают перспективность этого класса соединений для исследования в качестве препаратов лечения патологий, связанных с пе-рекисным окислением липидов клеточных мембран. соль [3-(3,5-ди-/И е777-бутил-4-гидроксифенил)пропионовой кислоты (фенозан калия, ФК) [93]: ФК обладает средней АРА, но широким спектром биологического действия в значительном диапазоне концентраций (IQ 4-1Q 20 М) [94].

Синтез 8-[со-(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов натрия

Взаимодействие галогеналканов различного строения с тиосульфатом натрия с получением S-алкилтиосульфатов (солей Бунте) описано многими авторами (см. п. 1.3.1), однако в большинстве таких работ названные соли Бунте являлись не целевыми соединениями, а лишь синтонами для получения соответствующих тиолов или дисульфидов. При этом последовательное превращение галогенпроизводных в алкилтиосульфаты и далее в тиолы (дисульфиды) осуществляли, как правило, "в одном сосуде", без выделения промежуточного продукта. Перед нами же стояла задача получения, выделения и очистки 8-(ш-(гидроксиарил)алкил)тиосульфатов натрия с целью получения образцов, пригодных для исследования их антиокислительной и биологической активности. За основу нами была взята типовая методика синтеза алкилтиосульфатов, основанная на кипячении эквимолярных количеств алкилгалогенида и тиосульфата натрия в 50%-ном водном этаноле [134]. Апробацию данной методики проводили на примере получения пространственно-экранированного тиосульфата I: Попытки получить тиосульфат I из соответствующего хлорпроизводного XXVI по названной методике не увенчались успехом - выделить целевой продукт из реакционной массы не удавалось, в тоже время исходный хлорид регенерировали практически количественно. Добиться значимой конверсии хлорпропана XXVI в тиосульфат I не удалось даже при длительном (12 ч) кипячении хлорпропана XXVI с избытком ШгЗгОз. Вместе с тем, уже после 5-6 ч кипячения бромида XXVII с тиосульфатом натрия (мольное отношение 1:1.3) наблюдалась полная конверсия исходного бромпропана, а целевая соль Бунте была получена с выходом 64 % (после перекристаллизации из безводного этанола). Мы предположили, что данный результат связан с разницей в реакционной способности галогеналканов XXVI и XXVII, обусловленной различиями в энергиях связей С-С1 и С-Вг, а, соответственно, для превращения хлорпропана XXVI в соль Бунте требуются более жесткие условия. В качестве растворителя, кипящего при более высокой температуре, чем водно-этанольная смесь, решено было использовать этиленгликоль, поскольку в нём хорошо растворялись как хлорпропан XXVI, так и ИагЭгОз.

Данный выбор оказался весьма удачным, уже в первых экспериментах нам удалось получить тиосульфат I с хорошим выходом. Синтезы осуществляли следующим образом: в атмосфере инертного газа в этиленгликоле растворяли хлорид XXVI и тиосульфат натрия (1:1.3, соответственно), раствор нагревали и выдерживали 6 ч при 105-110 С. При охлаждении реакционной массы до комнатной температуры происходила кристаллизация продукта реакции. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали на фильтре горячим гексаном (для удаления остатков исходного хлорида), затем обрабатывали серным эфиром. Экстракт промывали раствором NaCl, сушили над ИагЭСм, отгоняли растворитель и получали целевой тиосульфат с выходом 90 %. Вместе с тем, получать в этиленгликоле другие 8-((0-(гидроксиарил)алкил)-тиосульфаты оказалось малоудобным, поскольку менее экранированные тиосульфаты II-XI не кристаллизовались из реакционной массы, а выделение и очистка продукта реакции (прежде всего, от остатков этиленгликоля) в этих случаях требовали значительных временных затрат и сопровождались потерями целевого вещества. Следует отметить, что в целом в процессе выполнения настоящей работы основные трудности возникали не с превращением (я-(гидроксиарил)галогеналканов в соответствующие алкилтиосульфаты, а именно с выделением и очисткой последних. Это обусловлено следующими причинами: с одной стороны, - все 8-[со-(гидроксиарил)-алкил]тиосульфаты I-XIV практически нерастворимы в неполярных растворителях (бензол, толуол, гексан, петролейный эфир) и чрезвычайно хорошо растворимы в протонных растворителях (спирты, вода) , только некоторые соли растворяются в полярных апротонных растворителях (диэтиловый эфир, ацетон). Это ограничивало возможности извлечения целевого продукта из реакционной массы посредством экстракции, и приводило к его потерям при перекристаллизации. С другой стороны, -названные тиосульфаты гигроскопичны, многие из них довольно быстро расплываются на воздухе, что создает определённые трудности в работе. В конечном счёте мы пришли к выводу, что более удобным является получение 8-[со-(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов по реакциям соответствующих бромпроизводных с тиосульфатом натрия в среде водного этанола. В работе использовали кристаллогидрат МагЭгОз 5 НгО, который вводили в синтез с 25-50 %-ным избытком относительно исходного бромида; в качестве растворителя использовали этанол, к которому прибавляли воду (1 :0.6- 0.25 по объёму), поскольку Na2S203 5 НгО в безводном этаноле практически не растворим. Реакционную смесь кипятили в течение б ч в атмосфере инертного газа, далее проводили выделение и очистку целевых алкилтиосульфатов одним из двух способов: 1. По окончании синтеза реакционную массу охлаждали, прибавляли насыщенный раствор NaCl и обрабатывали диэтиловым эфиром. Экстракт сушили Na2SC 4, растворитель отгоняли.

Полученные кристаллы многократно промывали горячим петролейным эфиром (для удаления остаточных количеств исходного бромида), затем высушивали. 2. По окончании синтеза из реакционной массы отгоняли растворитель (остатки воды - в виде азеотропной смеси с толуолом), твердый остаток промывали горячим петролейным эфиром и высушивали. Далее продукт обрабатывали безводным пропанолом-2, нерастворившийся неорганический остаток отфильтровывали, из фильтрата отгоняли растворитель. Полученные кристаллы высушивали. Следует заметить, что мы рассматривали и другие варианты выделения и очистки синтезируемых алкилтиосульфатов, однако наиболее удобными и результативными оказались именно эти способы. В результате, как правило, получали соединения высокой степени чистоты, не требующие дополнительной перекристаллизации. При необходимости дополнительную очистку проводили перекристаллизацией из ацетона или пропанола-2 (растворители предварительно осушали). Так, например, растворимость тиосульфата І в воде при 20 С составляет 15 г на 100 мл Данным способом из соответствующих бромпроизводных нами были получены тиосульфата I-XIII с выходами от 76 до 96 % (табл. 9): Следует отметить, что соль Бунте из хлорида XLIV была получена в более мягких условиях, чем тиосульфат I из хлорпропана XXVI. Это свидетельствует о повышенной реакционной способности связи С-С1 в молекуле XLIV, что, по всей видимости, связано с анхимерным содействием атома серы, примеры которого весьма немногочисленны, но описаны в литературе [157]. Более высокая реакционная способность хлорпроизводного XLIV в сравнении с 3-(4-гидроксиарил)-1-хлорпропанами проявлялась и в реакциях с тиомочевиной [205]. Состав и строение синтезированных тиосульфатов I-XIV подтверждены элементным анализом и спектральными данными (представлены в главе 5). Данные соединения представляют собой бесцветные кристаллические вещества с т.пл. от 130 до 252 С и растворимостью в воде от 7.7 г (для тиосульфата IV) до -50 г (для соединений V-VI, X-XXI) на 100 г воды при 20 С. Интересно, что пространственно-экранированные тиосульфаты I, Ш растворяются в воде лучше (15-25 г/100 г), чем их ор/ио-незамещённый аналог IV. Возможно, это связано с тем, что соединения I, III имеют дифильное строение (в их структуре содержатся гидрофильные тиосульфатпые и гидрофобные алкиларильные группировки) и вследствие этого могут образовывать в водном растворе мицеллоподобные ассоциаты.

Изучение общей ингибирующей активности

Под общей ингибирующей активностью (Total Antioxidant Activity, ТАА), принято понимать способность ингибитора тормозить цепное окисление органических веществ в реальных условиях их производства, эксплуатации, хранения и т.п. ТАА не эквивалентна реакционной способности антиоксиданта по отношению к пероксидным радикалам, пероксидам или каким-либо другим частицам; она зависит как от строения молекулы ингибитора и продуктов его превращения, так и свойств субстрата и условий окисления (температуры, начальной концентрации ингибитора, давления кислорода и пр.). Это создает объективные трудности для кинетического описания процесса и теоретического обоснования соответствующих моделей исследования. В этой связи подходы к оценке ТАА ингибиторов разработаны в меньшей степени, чем способы измерения параметров АРА. При всем многообразии методов и модельных систем, предложенных для изучения эффективности биологически активных АО [57, 212] большинство из них ориентированы на ингибиторы антирадикального действия и основаны на использовании искусственного инициирования, т.е. мало подходят для изучения ТАА полифункциональных АО, обладающих как антирадикальной, так и противопероксидной активностью. В настоящей работе для оценки ТАА синтезированных соединений использовали две модельные системы - Си +-индуцированное окисление этилолеата в водной эмульсии и автоокисление сливочного масла. Используемая в настоящей работе методика Си -индуцированного окисления этилолеата в водно-эмульсионной среде была предложена ранее В.Н. Ушкаловой с соавт. в качестве способа тестирования средств антиоксидантотерапии [213] и апробирована ими при исследовании АО А ряда фенол ьных и серосодержащих соединений [214-216].

Кроме того, нашими коллегами было показано [217, 218], что результаты, полученные с использованием данной методики, хорошо коррелируют с результатами, полученными с использованием тест-системы оценки антиокислительной и антиатерогенной активности препаратов, основанной на контроле за образованием малонового диальдегида при Cu2+(Fe -индуцированном окислении выделенных липопротеинов низкой плотности. Наш интерес к данной методике обусловлен тем, что в условиях Си -индуцированного окисления свободные радикалы генерируются в процессе каталитического разложения гидропероксидов: при этом скорость инициирования, естественно, будет зависеть от концентрации ROOH. Соответственно, соединения, способные разрушать гидропероксиды должны проявлять в данной модельной системе выраженные антиокислительные свойства. Это позволило предположить, что модель Си2+-индуцированного окисления принципиально подходит для исследования полифункциональных ФАО, поскольку позволяет оценивать их совокупную антирадикальную и противопероксидную активность. Окисление этилолеата в водно-эмульсионной среде проводили в присутствии каталитических добавок меди (II) по [213], в качестве поверхностно-активного вещества использовали цетилтриметиламмоний бромид (цетавлон). Рабочие концентрации компонентов пробы составляли: этилолеата - 0.67 М, СиСЬ - 3 мМ, цетавлона - 0.03 М, исследуемых АО — 2 мМ. Температура окисления - 60С, давление 02 в системе - 1 атм. По экспериментально полученным данным строили график зависимости объема поглощенного пробой кислорода от времени. Об АОА исследуемых соединений судили по длительности периода индукции (г), который определяли графически как точку пересече- ния двух касательных к кинетической кривой, тангенсы углов наклона которых составляют 0,5 и 0,75 от тангенса угла наклона прямой неингибированной реакции (рис. 7). Все измерения проводились в 3-кратной повторности, в табл. 15 представлены усредненные результаты, отклонения от которых не превышали 5%. В результате проведенных исследований установлено, что все исследованные соединения, за исключением анизольных производных (IX, XXII) обладали выраженной способностью ингибировать Си -индуцированное окисление этилолеата. При этом, как и в случае АРН-инициированного окисления МО в мицеллах ДСН, в рядах тиосульфатов IV - V - I и сульфонатов XVIII - XIX - XV с увеличением числа mpem-бутильных орто-заместителей наблюдалось усиление противоокислительных свойств. Вместе с тем, независимо от числа заместителей в ароматическом ядре тиосульфа-ты I, IV, V превосходили по АОА соответствующие сульфонаты XV, XVIII, XIX. Это позволяет считать, что в рассматриваемой модельной системе проявлялся полифункциональный характер противоокислительного действия названных тиосульфатов, и их высокая АОА обусловлена совместным действием фенольной и тиосульфатной групп [219].

Отличительной особенностью сливочного масла от других жиров, используемых для пищевых и косметических целей, является относительно высокое содержание воды (до 25 % при жирности 71.5 % по ГОСТ 37-91). По существу сливочное масло представляет собой дисперсную систему «вода в жире», и это позволяет на практике использовать для предотвращения его окислительной порчи как липо-, так и гидрофильные антиокси-данты, в то время как для других пищевых жиров и масел подходящими являются только липофильные ингибиторы [220]. В этой связи при исследовании ТАА синтезированных соединений в модельных условиях автоокисления липидного субстрата мы сочли целесообразным использовать в качестве последнего именно сливочное масло. Предварительно проводили оценку окислительной устойчивости сливочных масел разных торговых марок. Образцы масел растапливали при 60С и методом центрифугирования отделяли от плазмы жировую фракцию (5 г), которую затем термостатировали при 60С. Содержание гидропероксидов в жире определяли спектрофотометрически железо-роданидным методом, основанном на способности пероксидов окислять ион Fe2+ в Fe3+, дающий с роданидом аммония окрашенный комплекс: Интенсивность окраски измеряли с помощью спектрофотометра SPECORD UV VIS в видимой области при длине волны 485 нм. Изменение величины оптической плотности во времени свидетельствовало о накоплении пероксидов в окисляемых образцах сливочных масел. Кинетические кривые окисления большинства исследованных образцов имели выраженный и достаточно продолжительный период индукции (рис. 8), что может быть обусловлено как особенностями жирно-кислотного состава масел, так и содержанием в них АО. Следует заметить, что в сливочном масле содержатся природные антиоксиданти (а-токоферол, р-каротин и др.), однако производителям разрешено использовать и эндогенные противоокислители (пропилгаллат, бутокситолуол, бутоксианизол и др.) [220]. Принимая во внимание, что в случае одновременного присутствия в окисляющемся субстрате нескольких антиоксидантов между ними могут возникать синергические или антагонистические отношения, исследование АОА синтезированных соединений проводили на примере масла домашнего изготовления, которое среди имеющихся в нашем распоряжении образцов характеризовалось наибольшей окисляемостью (табл.16).

Исследование биоантиоксидантных свойств in vitro и in vivo

Биоантиоксидантные свойства синтезированных нами структурно-взаимосвязанных рядов 8-[ю-(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов и ш-(гидроксиарил)-алкансульфонатов изучались в НИИ клинической иммунологии, НИИ терапии, НИИ молекулярной биологии и биофизики и НЦ клинической и экспериментальной медицины СО РАМН. Результаты этих исследований отражены в ряде публикаций [208, 231-233], в том числе совместно опубликованной работе [219]. Противоокислительную активность названных тиосульфатов и сульфонатов изучали в различных экспериментальных системах in vitro, оценивая их влияние на: - окисление липопротеинов низкой плотности (ЛНП) при их инкубации с ионами металлов переменной валентности, - генерацию активных кислородных метаболитов (АКМ), стимулированными нейтро-филами крови, - образование пероксонитрит-аниона (ONOO-) при разложении морфолино-сиднонимина (SIN-1). Об эффективности исследуемых соединений во всех системах судили по величине ICso, численно равной концентрации АО, в присутствии которой происходило 50%-ое ингибирование накопления продуктов окисления ЛНП, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), или 50%-ое снижение интенсивности хемилюминесценции, вызываемой Согласно полученным данным (табл. 20) все исследованные препараты, кроме О-метилированного сульфоната XXII, снижали накопление ТБК-реактивных продуктов при окислении ЛНП, индуцированного ионами металлов переменной валентности. Увеличение пространственного экранирования фенольной ОН-группы в рядах тио-сульфатов IV-V-I и сульфонатов XVIII-XIX-XV приводило к усилению ингибирующей эффективности препаратов в отношении Си - и Fe -индуцированного окисления ЛНП крови. Так, концентрация полуингибирования IC50 для неэкранированных фенолов XVIII и IV превышала значение IC50 для соответствующих пространственно-затруднёных фенолов XV и I в 185 и 40 раз в случае медь-индуцированного окисления и в 736 и 254 раза при железо-индуцированном окислении.

Независимо от числа wpem-бутильных оргао-заместителей препараты с тиосуль-фатной группой превосходили по антиокислительной способности сульфонатные аналоги. Метилирование функционально активной ОН-группы снижало ингибирующую активность тиосульфата IX, а сульфонату XXII придавало прооксидантные свойства. Согласно современным представлениям [10] окислительная модификация липопро-теинов является одним из пусковых механизмов развития атеросклероза, поскольку только окисленные липопротеины включаются в атеросклеротические бляшки. В этой связи способность синтезированных нами соединений защищать ЛНП от окисления свидетельствует о потенциальном наличии у них антиатерогенной активности. В системах с продукцией АКМ стимулированными гранулоцитами и при распаде SIN-1 прямой зависимости между ингибирующим действием соединений и экранированием ОН-группы не наблюдалось. Наиболее эффективно дыхательный взрыв гранулоцитов и ион-радикалы ONOO- ингибировал opmo-незамещенный тиосульфат IV, наименьшая активность в модели дыхательного взрыва гранулоцитов регистрировалась для иояо-трет-бутилированного сульфоната XIX, при генерации пероксонитрита - для др-трет-бутилзамещенного сульфоната XV. Вместе с тем, во всех трех модельных системах независимо от числа трет-бутильных ор/яо-заместителей соединения с тиосульфатными группами превосходили по ингибирующей активности свои сульфонатные аналоги. В ряде модельных систем репер-ный АО фенозан калия превосходил свой сульфонатный аналог XV, но во всех случаях уступал по эффективности соответстующему тиосульфату I. По всей видимости, это связано с проявлением противопероксидной активности группировки —SSOsNa, поскольку известно, что пероксид водорода и пероксонитрит инициируют свечение люминола [57]. Современная наука насчитывает более 200 заболеваний и патологических состояний, сопровождающихся развитием окислительного стресса, к их числу относится и воспаление [8, 10]. На модели каррагинан-индуцированного отёка лапы у крыс было показано, что синтезированные соединения, за исключением анизольного сульфоната XXII, проявляют достоверное противовоспалительное действие. Наиболее выраженный эффект оказывал моно-трет-бутилзамещённый тиосульфат V, который превосходил по эффективности как свои аналоги, так и фенозан калия и аспирин (рис. 14). Корреляции между противовоспалительными свойствами исследуемых препаратов и их способностью ингибиро-вать АКМ не наблюдалось.

Это свидетельствует о том, что влияние данных препаратов на организм не ограничивается их воздействием на интенсивность протекания окислительных процессов [219]. В последние годы исследователи отмечают, что биологическая роль фенольных соединений в организме часто определяется их регуляторным действием, а не антиокси-дантными свойствами, это касается даже «классических» АО, таких как витамин Е [234]. В клетках важной мишенью действия экзогенных ФАО являются редоксчувствительные транскрипционные факторы, и, прежде всего антиоксидант-респонсивный элемент (ARE: antioxidant responsive element) [235]. С целью проверки гипотезы о способности синтезированных ФАО реализовывать своё действие посредством активации ARE на культуре клеток гепатомы человека HepG2 была исследована их способность усиливать транскрипцию гена GSTP1, кодирующего глутатион-Б-трансферазу Р1. В концентрации 20 мкМ все исследованные фенольные соединения повышали экспрессию гена GSTP1 (табл. 21). Наиболее эффективным оказался частично экранированный тиосульфат V, который во всем диапазоне исследованных ко-центраций 10-100 мкМ проявлял активность в среднем в 1.5 раза выше, чем «классический» индуктор ARE /я/?е/я-бутилгидрохинон (tBHQ). Принимая во внимание, что тиосульфат V также в наибольшей степени подавлял развитие каррагинан-индуцированного отёка, можно предположить, что в основе противовоспалительного действия рассматриваемых соединений лежит их способность индуцировать экспрессию контролируемых ARE генов, кодирующих белки, участвующие в воспалительном процессе [219]. В НИИ клинической иммунологии СО РАМН на модели ССІ4-индуцированного токсического гепатита мышей было проведено скрининговое исследование гепатопротек-торных свойств ряда гидрофильных соединений [208]. Показано, что пространственно-экранированные тиосульфат I и сульфонат XV в дозах 20 и 40 мг/кг, а также орто-незамещенный тиосульфат IV в дозе 40 мг/кг оказывают выраженное протекторное действие на мембраны гепатоцитов, о чем свидетельствует достоверное снижение активности аланинаминотрансферазы в сыворотке крови экспериментальных животных.

Похожие диссертации на Синтез, антиоксидантная и биологическая активность S-[-(гидроксиарил)алкил]тиосульфатов и -(-гидроксиарил)алкансульфонатов натрия

Синтез и фунгицидная активность 2-замещенных 7-алкил-3-арилгексагидро-2Н-индазолов и 8-алкил-4-арилгексагидро-2(1Н)-хиназолинтионовГар, Михаил Михайлович

Синтез, свойства и исследование антиокислительной активности галогенидов S-[ -(4-гидроксиарил)алкил]изотиуронияКандалинцева Наталья Валерьевна

Система тетрахлорсилан - азид натрия в синтезе тетразолов из амидов карбоновых кислот Есиков Кирилл Александрович

Синтез полиядерных соединений на основе реакции Шмидта и электрофильного аминирования азидом натрия в полифосфорной кислотеКараиванов Никола Цанев

Синтез азациклопента[c,d]феналенов на основе реакции Шмидта и электрофильного аминирования азидом натрия в полифосфорной кислотеАндриенко, Анна Валериевна

Синтез азотсодержащих гетероциклических соединений на основе синтетической последовательности: реакция Шмидта - электрофильное аминирование аренов азидом натрия в полифосфорной кислотеРедько Тамара Сергеевна

Синтез и биологическая активность новых 1,2,4-триоксановых аналогов артемизининаКрасавин Михаил Юрьевич

Синтез и анальгетическая активность новых димерных аналогов бета-казоморфина-3 и бета-казоморфина-5Саидов, Самир Сангинмуродович

Синтез и биологическая активность 6-замещенных производных пиридоксинаШтырлин, Никита Валерьевич

Синтез и антиокислительная активность серосодержащих производных O-циклогексилфеноловМарков Александр Федорович