Содержание к диссертации
Введение
Глава I Спектроскопия ЯМР 2Н в изотопном анализе органических , веществ
1.1 Формирование изотопного состава органических молекул... 6
1.2 Фрагментное распределение изотопов в молекулах органических веществ 10
1.3 Спектроскопия ЯМР на ядрах дейтерия 13
1.4 Схема спиртового брожения глюкозы 16
1.5 Биоконверсия глюкозы с точки зрения водородного обмена .. 20
1.6 Процесс ферментации в условиях природного обогащения образцов изотопом 2Н 30
1.7 Проблема подлинности алкогольной продукции 33
Глава II Количественные аспекты спектроскопии ЯМР 2Н в анализе изотопного состава органических веществ, водных и водно-органических растворов 40
2.1 Методика количественного определения содержания дейтерия 40
2.2 Содержание изотопа 2Н, как маркер сырьевой природы этанола 52
2.2.1 Закономерности изменения содержания дейтерия в структурных фрагментах этилового спирта 54
2.2.2 Идентификация сырьевой природы индивидуальных спиртов и их смесей 56
Глава III Формирование изотопного состава этанола в биохимических и химических реакциях 66
3.1 Реакция спиртового брожения глюкозы 67
3.1.1 Влияние дейтерозамещенности среды на формирование водородной периферии молекулы этанола в процессе биоконверсии глюкозы 67
3.1.2 Вклад структурных фрагментов глюкозы в распределение дейтерия в этаноле 79
3.1.3 Влияние изотопомерных форм воды на распределение дейтерия в этаноле 92
3.2 Реакция сернокислотной гидратации этилена 104
Главаiv Экспериментальная часть 109
Выводы 111
Список литературы 113
- Фрагментное распределение изотопов в молекулах органических веществ
- Биоконверсия глюкозы с точки зрения водородного обмена
- Содержание изотопа 2Н, как маркер сырьевой природы этанола
- Влияние дейтерозамещенности среды на формирование водородной периферии молекулы этанола в процессе биоконверсии глюкозы
Введение к работе
Важные для реакций органической химии элементы (водород, углерод, азот, кислород) представлены в природе несколькими стабильными изотопными разновидностями. Содержание минорного изотопа, а это, как правило, более тяжелый изотоп элемента, не превышает 1.1%. Установлено, что его распределение во фрагментах молекул органических веществ существенно отклоняется от статистически ожидаемого [1, 2] и несет специфическую изотопную информацию, отражающую происхождение молекулы (сырьевой, географический, технологический, возрастной и другие факторы).
Наибольших успехов в изучении изотопии органических веществ достигли масс-спектрометрия изотопных отношений и спектроскопия ядерного магнитного резонанса - методы измерения суммарного и селективного содержания изотопа в органической молекуле, соответственно. Однако, большей информативностью обладает именно фрагментная изотопная характеристика молекулы, получаемая из количественных спектров ЯМР.
Сочетание таких факторов, как естественная распространенность, магнитная активность минорных изотопов, возможность количественной оценки их фрагментного распределения, информативность изотопного профиля молекулы обеспечило широкое применение спектроскопии ЯМР в решении вопросов подлинности продукции в самых различных отраслях химической промышленности. Сущность подхода заключается в том, что измеряемый изотопный состав образца сопоставляется с соответствующими величинами из банка данных. Однако, в большинстве случаев, механизм формирования характеристичного изотопного состава молекулы, позволяющего различать органические соединения синтетического и природного происхождения, не рассматривается. Между тем, знание количественных закономерностей, управляющих процессом распределения природной метки позволит не только развивать теоретические представления
о химических реакциях, но и совершенствовать методы аутентификации и дифференциации биохимической продукции.
На сегодняшний день состояние этой проблемы рассматривается с двух позиций: с одной стороны в работах с естественным обогащением образцов констатируется факт нестатистического распределения минорного изотопа в молекуле органического вещества; с другой - в работах с изотопной меткой среды или субстрата изучен механизм формирования этой молекулы. В последнем случае проявление изотопных эффектов не позволяет применить знания о механизме реакции к интерпретации природного распределения изотопа. В свою очередь попытки изучить механизм той или иной реакции на природном обогащении реагентов дают неоднозначные результаты вследствие статистически неконтролируемого наложения соизмеримых по величине изотопных составов, принадлежащих разным молекулам.
Цель диссертационной работы включала решение следующих задач:
- разработка количественной методики измерений природного
содержания дейтерия в органических веществах, водных и водно-
органических растворах методом спектроскопии ядерного магнитного
резонанса. Установление возможностей и ограничений методики в
дифференциации органических молекул различного происхождения на
примере этанола;
изучение методом меченых атомов (Н, С), механизма формирования природного водородного профиля молекулы этанола в модельных реакциях получения его синтетических и природных аналогов -сернокислотной гидратации этилена и ферментативного сбраживания глюкозы;
- разработка подхода к интерпретации изотопного состава молекул,
учитывающего различную степень обогащения образцов, и установление на
его базе количественных соотношений между дейтеросодержанием
субстратов, реагентов и продуктов реакции.
Фрагментное распределение изотопов в молекулах органических веществ
Изотопный состав молекулы может быть представлен интегральной и дифференциальной величинами, отражающими суммарное содержание изотопа в молекуле и его фрагментное распределение, соответственно. В обоих случаях изотопная характеристика молекулы несет информацию о ее генеалогии [40, 41]. В ряде исследований необходимым и достаточным условием является знание суммарного содержания изотопа в молекуле. В работе [42] на основании суммарной величины 5 С молекулы этанола приводятся заключения относительно сырьевого источника углевода, из которого он был синтезирован. Авторами других работ показано, что судить о синтетическом или природном происхождении, например, глицерина [43] и эфирных масел [44] можно лишь на основании фрагментного распределения изотопа в молекуле.
Аналогичные примеры могут быть представлены относительно дейтронного «отпечатка» молекул. Несмотря на то, что по сравнению с изотопом 13С, диапазон вариации содержания дейтерия в природе значительно шире ( 80 % для ядер 2Н и 5 % для ядер ,3С по шкале 5 [34]), большую информативность имеет фрагментная изотопная характеристика молекулы. В интересах настоящей работы подробно рассмотрен водородный профиль молекулы глюкозы.
Прямое исследование глюкозы методом ЯМР 2Н затруднено, поскольку разрешающей способности прибора (на уровне В0 = 11 Т) недостаточно для того, чтобы разделить сигналы от всех семи неэквивалентных углерод - связанных атомов водорода. Поэтому был проведен поиск производных глюкозы, подходящих для определения природного фракционирования дейтерия [24-27, 45].
В большинстве описанных работ изотопные отношения для каждого из семи изотопомеров углевода рассчитываются только при совместном анализе спектров нескольких производных, синтезированных из одного и того же образца глюкозы [25]. Наиболее успешный синтез был проведен в [26]: спектр ЯМР 2Н молекулы 3,6-ангидро-1,2-0-изопропилиден-сс-О-глюкофуранозы позволяет разрешить сигналы от всех семи углеродсвязанных изотопов водорода. В таблице 1.1 представлен водородный изотопный профиль глюкозы различного сырьевого происхождения.
Из таблицы следует, что суммарное содержание дейтерия в молекуле глюкозы является недостаточным критерием для установления типа фотосинтетического цикла растения, из которого она была выделена. С другой стороны авторами показано, что изотопный профиль молекулы, представленный в виде фрагментных изотопных отношений, проявляет характерные черты, свойственные лишь определенному семейству. Так, для Сз растений отмечается относительное обогащение дейтерием 4- и 5-го углеродного атома глюкозы, в то время как для С4 семейства такое обогащение характерно для 1- и 6-го атомов. Растения САМ типа характеризуются повышенным содержанием дейтерия во фрагментах при Сг Сз углеродных атомах глюкозы. Аналогичные закономерности были установлены авторами других работ [25, 27].
Следует отметить, что в большинстве проанализированных работ, посвященных дифференциации Сахаров, водородный профиль молекулы глюкозы оценивается на основании фрагментного распределения изотопа дейтерия в молекуле спирта, являющегося продуктом биоконверсии углевода (подробнее раздел 1.6) [46-49]. В Таблице 1.2 приведены значения содержания дейтерия в молекулах этанола различного происхождения [1].
Авторами делается вывод, что на основании суммарной величины D/H можно дифференцировать молекулы синтетического и природного происхождения (в первом случае этанол характеризуется более высоким деитеросодержанием по всем трем параметрам). В случае пищевых спиртов для установления типа гликолизного цикла растения, из которого был выделен сахар, необходимо знание фрагментного распределения изотопа. В частности авторами показано, что такую информацию несет только метильная группа этанола.
В рассмотренных выше примерах информативность фрагментного изотопного профиля молекулы обсуждалась с точки зрения его дифференцирующей способности. Не менее важной данная изотопная характеристика является при установлении механизмов реакций. В частности знание водородного окружения молекул этанола [44], глицерина [48], маннитола [49] и жирных кислот [50, 51] позволило авторам обсуждать механизмы их биохимического синтеза, включающего стадии водородного обмена.
Знание фрагментного изотопного распределения является мощным источником информации, позволяющей устанавливать связь между индивидуальными атомами продуктов реакции и атомами, принадлежащими молекулам исходных веществ. Полученные результаты могут быть интерпретированы с точки зрения генеалогии отдельно взятых атомов и их участия в процессах химического и биохимического синтеза [48-54], с позиции кинетических изотопных эффектов, сопровождающих формирование определенного молекулярного фрагмента [55-62].
Биоконверсия глюкозы с точки зрения водородного обмена
В ходе изомеризации происходит 1,2-перенос протона от Сг атома глюкозы к Сі атому фруктозы. В литературе имеются сведения, что такая перегруппировка протекает с высокой степенью стереоспецифичности [72]. Так же известно, что она сопровождается водородным обменом с растворителем - водой, причем степень такого обмена зависит от условий проведения реакций и может изменяться в достаточно широких пределах. В Таблице 1.3 представлены некоторые литературные данные по этой перегруппировке. Результаты свидетельствуют о том, что 1,2-перенос протона может происходить по внутри- и/или межмолекулярному механизму.
В результате проведения «зеркальных» экспериментов -биоконверсии обычной глюкозы в дейтероводе и наоборот дейтерированной глюкозы в легкой воде [73] была предложена модель, согласно которой субстрат-ферментный комплекс, генерируемый в течение первой стадии из глюкозы, может «освобождать» фруктозу через две конкурирующие стадии: 1. внутримолекулярный перенос протона из Сг в Сі положение фруктозы 2. межмолекулярный обмен С2 атома водорода глюкозы и +Н ионами из растворителя до их миграции в положение Сі фруктозы Доминирование той или иной стадии определяется проявлением изотопного эффекта на каждой из этих стадий. Например, в работе [75] показано, что в тяжелой воде скорость изомеризационных превращений между фруктозой и глюкозой в результате внутримолекулярного переноса протона, по крайней мере, на один порядок быстрее, чем их дейтерирование.
По утверждению авторов [50, 52], представленные результаты неприменимы для интерпретации результатов, полученных при ферментации в условиях природного обогащения изотопной меткой, поскольку при использовании специально дейтерированных субстрата или среды влияние изотопного эффекта на той или иной стадии метаболизма может оказаться настолько значимым, что последствия такого влияния могут проявиться в доминировании какого-либо определенного направления.
Для интерпретации результатов, полученных при биоконверсии глюкозы в условиях природного или близкого к нему обогащения, были предложены коэффициенты перераспределения ay, которые связывают положение і продукта реакции с положением j реагента (более подробно в разделе 1.6). Таким образом, введенный коэффициент количественно характеризует чувствительность водородсодержащего фрагмента продукта реакции к изотопному составу реагента, принимающего участие в формировании его водородного окружения [46]. Так сопоставление коэффициентов, связывающих Сі и С2 положения глюкозы с одной стороны и метальную группу образующегося в результате биоконверсии этанола с другой стороны, а(СН3, Сі) и а(СНз, С2) (Таблица 1.4), показало, что перенос атома водорода от С2 положения к Сі на 70 % протекает по внутримолекулярному механизму [52].
НАДН Поскольку при дальнейших превращениях НАД не вступает в обменные процессы со средой [79], очевидно, его изотопный состав, сформированный при окислении глицеринового альдегида, окажет влияние на конечное D/H отношение в метиленовой группы этанола. В [78] показано, что при биоконверсии дейтерированной глюкозы в воде восстановленный НАД, образующийся из глицеральдегида (С4-С6 атомы гексозы), на 76% представляет дейтерированную форму (НАДО) вследствие того, что скорость изомеризационных превращений на стадии триоз в 3-4 раза больше, чем скорость окисления ГЗФ. В свою очередь молекулы ДГАФ в дейтеросреде дают только дейтерированные формы НАД благодаря стереоспецифичности альдолазы и триозофосфатизомеразы. При интерпретации результатов авторами [78] исключается влияние изотопных эффектов на стадиях формирования изотопного состава молекулы НАДН(Б) с последующим восстановлением ацетальдегида вследствие отсутствия существенных различий в «зеркальном» распределении изотопомерных форм метиленовой группы спирта, полученного в экспериментах с изотопной меткой субстрата, либо среды. Однако в [80] показано, что восстановление ацетальдегида дейтеромеченным НАДО сопровождается существенным изотопным эффектом {кц/ки = 2.21), который уменьшается с увеличением концентрации альдегида.
Иные выводы относительно данной стадии приводятся авторами работ на естественном обогащении образцов [52]. Принимая, что максимальный теоретический вклад глюкозы (а именно атома водорода при С4 углероде) в метиленовую группу спирта составляет 25%, прямой связи между этими положениями не обнаружено. Следует отметить, что в приведенных работах авторы не имели возможности оценить D/H отношение для С4 положения глюкозы, а следовательно коэффициент перераспределения, связывающий С4 атом водорода глюкозы с метиленовой группой спирта из представленных экспериментов оценить невозможно.
Содержание изотопа 2Н, как маркер сырьевой природы этанола
Крупномасштабное производство этилового спирта осуществляется, в основном, по двум технологическим схемам: спиртовое брожение углеводсодержащих субстратов (пищевой и гидролизный этанол) и химический синтез, в основе которого лежит гидратация этилена (синтетический этанол). При реализации современных методов очистки спирта-сырца, независимо от схемы его производства, получаемый этанол является монопродуктом, практически не содержащим никаких побочных примесей. Однако, применение синтетического и гидролизного этанола из непищевого сырья для приготовления алкогольной продукции (АП) запрещено Федеральным законом «О государственном регулировании производства и оборота этилового спирта, алкогольной и спиртосодержащей продукции». Таким образом, необходимы методы надежной идентификации сырьевой основы спиртов.
Отправными данными для разработки методики, предназначенной для дифференциации этанолов различного генезиса методом спектроскопии ядерного магнитного резонанса на ядрах дейтерия, стали результаты работы [109], обобщающей немногочисленные данные, известные для пищевых (ПЭ) и синтетических (СЭ) этанолов .
Ширина «нейтральной зоны» по каждой из координат составляет 6-8 ррт. В нее, по-видимому, могут попасть точки только для смесей этанолов групп I и II, а их положение позволяет установить соотношение компонентов, если известны данные для каждого. Так, смесь из 50% этанола из сахарного тростника и 50% синтетического марки "О" проявится в области II, а аналогичная смесь этанолов из сахарной свеклы и этилена (конт.), наоборот, в области I. Это ограничивает возможности ЯМР Н в распознавании смесей СЭ и ПЭ из разных видов растительного сырья без идентификационных параметров хотя бы для одного компонента.
Представленные рассуждения поставили вопрос о реальных возможностях метода ЯМР Н в дифференциации этанолов. 2.2.1. Закономерности изменения содержания дейтерия в структурных фрагментах этилового спирта Допустимые ошибки экспериментальных измерений содержания изотопа Н для дифференциации ПЭ и СЭ определяют требования к аппаратуре, методике измерений, особенностям пробоподготовки и т.д. Из рассмотренных результатов (рис.2Л) следует, что достаточно иметь погрешность измерений менее ±5 ррт, чтобы значения D/H областей I и II не перекрывались. Проводя анализ образцов алкогольной продукции, приготовленной даже при ректификации одной партии спирта-сырца, следует иметь в виду, что изотопный состав этанола может изменяться от фракции к фракции. Стандартная методика, принятая в странах Евросоюза (ЕС), предусматривает следующую процедуру подготовки образца: однородную пробу (500 мл вина) с известным содержанием спирта вводят в колбу для дистилляции с коэффициентом возврата около 0.9. Собирают жидкость, кипящую при 78.0С t 78.2С (приблизительно 40-60 мл). Когда температура превысит 78.5С, прекращают отбор дистиллята на 5 мин. Когда температура снизится до 78.0С, снова собирают дистиллят до повышения температуры до 78.5С и повторяют эту операцию до тех пор, пока температура после прекращения отбора дистиллята перестанет понижаться.
Полная дистилляция длится приблизительно 5 часов. Этот способ позволяет рекуперировать от 98 до 98.5 % всего спирта вина в дистиллят, крепость которого 92-93 % масс. (95 % об.).
Таким образом, в случае, если изотопный состав спиртов зависит от способа и режима их ректификации, то приведенная процедура пробоподготовки может стать дополнительным источником погрешностей.
В работах [113, 114] проведено детальное исследование изменения изотопного состава этилового спирта в ходе ректификации. Показано, что содержание дейтерия и в метильной, и метиленовой группах спирта по мере отбора фракций понижается вследствие действия обратного изотопного эффекта. Диапазон вариаций содержания дейтерия достигает величины 12 ррт для СНз и 6 ррт для СН2, что намного превышает погрешности измерений. Таким образом, показано, что изотопный состав в процессе ректификации претерпевает существенные изменения. Результат конкретного анализа может меняться в широком диапазоне, если отгонка этанола из виноматериала проведена не полностью.
Возвращаясь к граничным значениям дейтеросодержания, разделяющим зоны ПЭ и СЭ, с учетом того, что результаты для проанализированных фракций в среднем варьируются на ± 5 ррт, области I и II расширяются навстречу друг другу на 5 ррт (рис. 2.1). Это приводит к их новым граничным значениям: I 117 ррт (СН3) и 139 ррт (СН2) II 115 ррт (СН3) и 135ррт(СН2) Следует отметить, что если значения содержания 2Н окажутся в зоне перекрывания (от 115 до 117 ррт для СН3 и от 135 до 139 ррт для СН2 одновременно), то однозначные выводы о сырьевой природе этанола сделать невозможно. Полученные результаты определяют требования к методике измерений. Она должна обладать точностью выше ±5 ррт. Такому уровню требований к метрологическим характеристикам измерений удовлетворяет методика, представленная в разделе 2.1, которая имеет приемлемые метрологические характеристики для идентификации АП (воспроизводимость измерений содержания дейтерия « 2%). Это делает возможным получить на ее основе дополнительную экспериментальную информацию, необходимую для создания репрезентативного банка данных по этанолам различного генезиса. Анализируя основы методики SNIF - NMR следует отметить, что при проведении межлабораторных сличительных экспериментов ее показатель воспроизводимости варьировался в пределах 2-4 % отн. при измерении высот отдельных сигналов в спектре ЯМР Н [102]. Поскольку эта методика имеет систематическую ошибку до 2% [115], то в качестве максимальной погрешности для известных литературных данных можно принять 5% измеряемой величины. Полученные значения погрешностей совпадают с неопределенностью содержания изотопа Н во фракциях отогнанного этанола [ПО, 111], составляющей ±5 ррт при среднем значении дейтерозамещенности этильного фрагмента 115 ррт, т.е. около 5%.
Таким образом, методика [99] при идентификации сырьевой природы этанола не имеет преимуществ по сравнению с более простой методикой разработанной нами (раздел 2.1); неполная дистилляция этанола из АП вносит дополнительные погрешности в результаты измерений распределения в нем изотопа Н, что делает более предпочтительным применение методик без дистилляции.
Проведение экспериментов на спектрометрах ЯМР с рабочей частотой для ядер дейтерия 76.8 МГц дает положительный ответ на вопрос о возможности осуществления регистрации спектров ЯМР 2Н спиртосодержащих образцов, в которых 30% об. этанола, без дистилляции и без обеспечения стабилизации резонансного условия.
Основной принцип предлагаемой методики совпадает с таковым в известной методике ЕС, однако, мотивированные выше упрощения, касающиеся технических и аппаратурных особенностей обеспечивают повышение точности и воспроизводимости результатов при меньших затратах времени на пробоподготовку, эталонирование и измерения, что понижает в итоге стоимость одного анализа почти на порядок.
Влияние дейтерозамещенности среды на формирование водородной периферии молекулы этанола в процессе биоконверсии глюкозы
Ферментативное сбраживание глюкозы в этанол представляет достаточно сложную совокупность последовательных, параллельных и в большинстве случаев обратимых реакций, многие из которых связаны с меж-или внутримолекулярным перемещением атомов водорода, что в итоге формирует водородный изотопный профиль молекулы этанола.
Процесс ферментации осуществляется в водной среде, где вода выступает не только в роли растворителя, но и внешнего донора атомов водорода, принимая непосредственное участие в формировании водородной «рубашки» молекулы спирта. Для установления ее роли в процессе ферментации изучено распределение дейтерия в этаноле, полученном сбраживанием глюкозы в воде с различным содержанием дейтерия.
Авторы ряда работ по биоконверсии углеводов [50, 52] говорят о несопоставимости результатов, полученных методом меченых атомов и при естественном обогащении образцов. Полагая, что такое различие может быть обусловлено влиянием концентрации дейтерия, мы исследовали реакцию, варьируя содержание тяжелой воды в водной фазе от 5 до 100 %.
В процессе реакции обмена гидроксильных атомов глюкозы со средой и образования в результате ее превращений двух молекул воды происходит трудноучитываемое изотопное разбавление водной среды.
Как следует из таблицы 3.1, по характеру зависимости распределения дейтерия в этильном фрагменте этанола от концентрации тяжелой воды в растворе результаты могут быть разделены на две группы. К первой относятся спирты, полученные при исходной концентрации дейтероводы в водной фазе 50% (опыты 1-3). В этом случае содержание дейтерия в воде (CD2O) И в этильной группе (det) увеличиваются пропорционально, тогда как отношение интенсивностей сигналов дейтерия метиленовой (1сн2) и метильной (1сн3) групп этанола к интенсивности сигнала OD остается практически постоянным и составляет 1.75 и 0.75, соответственно. Иная картина наблюдается во второй группе при концентрации дейтероводы 50 % (опыты 4-6). В этих условиях величина отношений 1сн2/1он и 1сн3/1он начинает расти, достигая максимального значения при биоконверсии глюкозы в 100 %-ной дейтероводе (2.00 и 1.68, соответственно). Поскольку дейтерозамещенность метильной группы увеличивается быстрее, различие между ней и метиленовой группой постепенно нивелируется, уменьшаясь с 2.33 до 1.19.
По результатам спектроскопии ЯМР Н проведена количественная оценка дейтерозамещенности водородсодержащих фрагментов этилового спирта. Многоимпульсные последовательности, учитывающие значения констант спин - спинового взаимодействия ядер 13С и 2Н в спектрах ЯМР 13С, позволяют установить изотопомерный состав молекулы (таблица 3.2). На рисунке 3.1 представлен общий вид спектра ЯМР С метильной группы этанола, полученный методом спинового эха.
По результатам таблицы 3.2 проведена оценка фрагментного изотопомерного состава этанола. С этой целью для каждого фрагмента (СН2, СН3 или Et) отдельно просуммировано количество молекул с одинаковым числом атомов Н. Так, количество d2 изотопомера метильной группы, включающего молекулы CHD2-CH2-OH, CHD2-CHD-OH и CHD2-CD2-OH, при ферментации в тяжелой воде составило 2.0 +11.1 + 17.7 = 30.8 % (таблица 3.3). Из полученного фрагментного состава рассчитывалась величина
Изотопное распределение в молекуле этанола, рассчитанное из спектров ЯМР 13С, полностью согласуется с таковым, полученным на основании анализа спектров ЯМР 2Н. Так, при низких концентрациях дейтерия в воде ( 50 %), когда преобладают изотопомеры спирта, монодейтерированные по метильнои и метиленовои группам, содержание молекул СНз-CHD-OH « в два раза больше, чем содержание изотопомеров CH2D-CH2-OH. С увеличением концентрации дейтерия в воде это различие нивелируется за счет образования мультиплетных форм обмена спирта с дейтероводои, причем во всем диапазоне концентраций D20 отношения деитеросодержании метильнои и метиленовои групп воспроизводят отношения, рассчитанные из дейтронных спектров .
