Содержание к диссертации
Введение
1. Введение во флуоресцентную диагностику 8
1.1 Природа флуоресценции 7
1.2 Методы регистрации флуоресценции и принципы соответствующей целевой аппаратуры 13
1.3 Методы диагностики на основе регистрации флуоресценции природных флуорофоров для биологи и медицины 16
1.4 Методы диагностики на основе экзогенной флуоресценции 26
1.5 Методы обработки результатов ЛФД 27
1.6 Диагностика объектов микробной природы, состояние проблемы и возможные пути ее решения на основе ЛФД 32
2. Экспериментально-теоретическое исследование. Материалы и методы. 36
2.1 Проблемная база для выполнения работы. 36
2.2 Аппаратура спектральной лазерной флуоресцентной диагностики 37
2.3 Особенности флуоресценции биологических субстратов с микроорганизмами 39
2.4 Модель распознавания спектральных флуоресцентных данных и метод ее математического решения 44
2.5 Практическое и теоретическое планирование эксперимента по накоплению базы данных эталонных образцов для решения задачи распознавания 50
2.6 Восстановление корректных спектров с учетом характеристик оптической экстинкции вещества 51
3. Наработка базы данных и исследование спектральных характеристик различных микобактерий для дифференциальной флуоресцентной диагностики . 54
3.1 Измерения и обработка спектров флуоресценции 54
3.2 Индивидуальные особенности микробов 62
3.3 Разработка модели с учетом корректировки спектральных данных с помощью спектров экстинкции исследуемых веществ 68
4. Применение детергента для повышения чувствительности дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики микроорганизмов . 71
4.1 Механизм увеличения интенсивности флуоресценции под действием детергента 71
4.2 Измерение флуоресценции микроорганизмов под влиянием различных детергентов и определение динамики 73
4.3 Анализ специфичности флуоресценции микобактерий при их обработке с использованием мирамистина 79
5. Диагностика заболеваний туберкулеза по измерению флуоресценции плазмы крови 89
5.1 Схема распознавания и классификации болезни 89
5.2 Сбор и организация данных лазерно-флуоресцентной диагностики 90
5.3 Экспериментальная установка и процедура тестирования 91
5.4 Результаты исследования 93
Выводы работы 99
- Методы регистрации флуоресценции и принципы соответствующей целевой аппаратуры
- Диагностика объектов микробной природы, состояние проблемы и возможные пути ее решения на основе ЛФД
- Восстановление корректных спектров с учетом характеристик оптической экстинкции вещества
- Анализ специфичности флуоресценции микобактерий при их обработке с использованием мирамистина
Введение к работе
Возникновение флуоресцентного анализа и диагностики с применением лазеров привело к созданию эффективных методов дистанционного и бесконтактного исследования различных субстратов органического происхождения с достижением большой чувствительности метода. Качество диагностики в этом случае во многом обусловлено временной и пространственной когерентностью возбуждающего излучения. Лазерно-индуцированная флуоресценция (ЛИФ) успешно применяется при определении участков загрязнения нефтепродуктами, в том числе аварийного состояния нефтепроводов (технология LDI). В таможенных службах используются приборы ЛИФ для определения наличия наркотиков (NarTest©). В медицине ЛИФ применяется в качестве диагностического средства при фото динамической терапии онкологических заболеваний. Основная задача, решение которой позволит увеличить возможности этих и подобных методов, заключается в разделении компонентных вкладов во флуоресцентный сигнал от многокомпонентной смеси сложных многоатомных молекул.
В связи с прогрессом в лазерных методах лечения заболеваний, связанных с микробной флорой, что привело к существенному сокращению сроков лечения, возникла острая необходимость в экспрессных методах диагностики заболеваний. Это необходимо по двум причинам. Первая — лекарственная терапия сильнодействующими препаратами в избыточных дозах приводит к ухудшению состояния жизненноважных органов. Поэтому необходимо, вовремя определить момент прекращения лекарственной терапии. Вторая - в процессе лечения очень важно отслеживать динамику лечения для его коррекции. Существующие методы диагностики, основанные на микробиологическом анализе, требуют длительного времени для установления диагноза (например, диагностика туберкулеза занимает от 3-х до 6-ти недель.)
Развитие новых методов диагностики на основе исследования характеристик конверсии (рассеяние, флуоресценция, рамановский и нелинейный эффекты и т.п.) лазерного излучения в биологическом веществе имеет проблемный и приоритетный характер в целях диагностики для медицины, и кроме нее также для биологии, промышленности и т.д., поскольку эти методы являются прямой базой новой экспресс - диагностики, которая лишена ряда недостатков остальных способов и имеет неоспоримые преимущества. Из них лазерная флуоресцентная диагностика может сочетать в себе приемлемые для задач диагностики чувствительность и специфичность. Однако сейчас наиболее часто флуоресцентный метод применяется с использованием специфических флуоресцирующих веществ, которые связываются с иммунными телами, специфическими к своему типу микроорганизмов [1,2]. Это связано с тем, что сама по себе эндогенная флуоресценция трудно поддается специфическому анализу. Но все-таки были разработаны методы диагностики для некоторых чистых культур [3]. Несмотря на это методы определения видов микроорганизмов в смесях не разработаны. Такие методы были бы полезны не только в медицинской диагностике, но и, например, в фармакологии для определения чувствительности возбудителя к антимикробным препаратам. Так же это было бы востребовано в пищевой технологии, экологии, промышленности, в космических и биосферных исследованиях.
Разработка экспресс-методов индикации и идентификации микроорганизмов является приоритетным направлением в медицинской диагностике. По оценкам ВОЗ, болезни микробной природы продолжают оставаться серьезной проблемой здравоохранения многих стран. Острые диареиные заболевания являются причиной более чем 30% смертных случаев среди детей до 5 лет. Острые респираторные заболевания (первичная пневмония) являются причиной смерти 2.2 млн. человек в год [4]. Существующие методы недостаточно быстро позволяют проводить диагноз. Бактериологическое исследование клинического материала от больного, одной из целей которого является выделение и идентификация бактерий, существенно зависит от качества работы на лабораторном и долабораторном этапах. Также здесь необходимо наличие аэробной и анаэробной микробиологической техники исследования материала, которая остается не всегда доступной лабораториям практического здравоохранения. Эти методы трудоемки и требуют слишком много времени. [5]
Выше сказанное обосновывает необходимость разработки новых экспресс-методов диагностики и мониторинга заболеваний микробной природы. Целесообразным для решения указанной проблемы является, например использование метода ЛФД. ЛФД обладает рядом потенциальных преимуществ, благодаря которым возможно эффективное решение данной проблемы. Особенно важны здесь преимущества в скорости диагностики и потенциальной неинвазивности.
Однако при применении ЛФД есть несколько проблем, среди которых особенно важна проблема скрытой специфичности. Спектры флуоресценции биологических объектов, в частности микробосодержащих жидкостей, не имеют характерных деталей, посредством которых можно было бы идентифицировать их. Специфические особенности не проявляются в виде узких спектральных линий, а наоборот, рассредоточены по широким перекрывающимся пикам. Поэтому для их анализа требуются методы, позволяющие находить и учитывать эти особенности в широких спектрах. При этом кроме высокой специфичности необходимо добиться одновременно и большой чувствительности, поскольку порог обнаружения и определения концентраций микроорганизмов может оказаться слишком высоким, чтобы не определить содержание микроорганизмов в слабоконцентрированных суспензиях.
Все приведенные доводы указывают на необходимость поиска новых методов определения и идентификации микроорганизмов на основе экспресс-метода ЛФД. Также это относится к достижению необходимых качеств диагностики, таких как чувствительность, дешевизна и экспрессность. Специфичность флуоресценции микробосодержащих взвесей слабо выражена и была недостаточно исследована к моменту начала работы, и это отражается в неспособности ЛФД без необходимого аналитического инструментария анализировать и диагностировать смеси различных микроорганизмов. Поэтому целью данного исследования является разработка метода и аппаратуры для объективной оценки специфичности флуоресценции нативных биологических субстратов (микробов) и их смесей в микробосодержащих жидкостях. В рамках достижения поставленной цели решаются задачи набора спектров флуоресценции нескольких видов микробов в зависимости от концентраций, составления метода, алгоритма и программного обеспечения дифференциальной диагностики микробов в составных взвесях и поиска способов улучшения диагностических качеств снимаемых данных при помощи использования детергента для увеличения относительной интенсивности флуоресценции и учета влияния некоторых оптических характеристик среды на спектры флуоресценции.
Цель и задачи диссертационной работы
Цель: Исследование и разработка метода дифференциальной диагностики объектов микробной природы на основе спектральных измерений лазерно-индуцированной флуоресценции. Задачи:
1. Экспериментально-теоретическое обоснование и метод обработки диагностических данных с целью дифференциации и видовой идентификации микробосодержащих биологических субстратов.
2. Экспериментальное и исследование флуоресценции биологических субстратов, взятых непосредственно от пациентов.
3. Исследование флуоресценции различных микробов и их дифференциация методами многомерного статистического анализа.
4. Повышение эффективности видовой идентификации микробов на основе учета характеристик рассеивания и поглощения биологического субстрата, содержащего флоурофоры микробов.
5. Осуществление программной реализации дифференциальной диагностики микробосодержащих биологических субстратов.
6. Тестовые испытания разработанной системы дифференциальной диагностики, возможности и перспективы.
Защищаемые положения Применение методов многомерного статистического регрессионного анализа данных лазерной флуоресцентной диагностики биологических веществ позволяет эффективно проводить дифференциальную диагностику ассоциаций микроорганизмов. При восстановлении спектров лазерноиндуцированной флуоресценции с учетом оптических характеристик вещества точность и эффективность дифференциальной диагностики повышается.
Добавление в суспензии микроорганизмов препарата на основе детергента увеличивает интенсивность флуоресценции и повышает чувствительность лазерной флуоресцентной диагностики.
Методы регистрации флуоресценции и принципы соответствующей целевой аппаратуры
Применение явления флуоресценции для исследования веществ, определения их свойств, качественного и количественного анализа флуорофоров а также в различных задачах контроля процессов предполагает наличие методов и инструментария для возбуждения, измерения характеристик флуоресценции и процедуры пробоотбора исследуемого материала. Во-первых, флуоресценция — очень чувствительный метод. Почти всегда можно получать наблюдаемые сигналы, увеличив коэффициент усиления приборов. Это определяет задача исследования, соответственно выбор аппаратуры регистрации должен быть согласован с требованиями диапазона параметров эмиссии вещества. Во-вторых, для выбора источника возбуждения флуорофоров необходимо знать параметры возбуждения, которые можно получить, исследуя, например, спектры поглощения вещества, и этот источник должен быть достаточно интенсивным. Подготовка и дозирование исследуемого материала налагает некоторые ограничения на виды веществ и их относительную флуорофорную чистоту. Если производится анализ слабоконцентрированного флуорофора, то флуоресценция примесей должна иметь тоже небольшую величину, сравнимую с флуоресценцией аналита. Флуоресцентный метод дает основные преимущества, делающие его иногда почти единственным методом качественного анализа [6,7, 36]. Сейчас используют несколько способов возбуждения образцов флуоресцирующих веществ. В основном применяют возбуждение оптическим излучением относительно мощного источника, в традиционной схеме в качестве которого выступает тело, испускающее излучение со сплошным спектром. Этими могут быть наиболее универсальные источники ксеноновые (Хе) дуговые лампы высокого давления. Они обеспечивают почти непрерывный спектральный выход в области 270 - 700 нм (рис. 2.3), за исключением нескольких узких линий вблизи 450 нм. Испускание света ксеноновыми дуговыми лампами происходит за счет рекомбинации электронов с ионизованными атомами Хе. Атомы Хе, находящиеся в возбужденном состоянии, дают линии в спектре, а не широкие полосы; этим обусловлены пики вблизи 450 им. Интенсивность испускания резко падает в области 280 нм [8,9 3,4]. Ртутные (Hg) лампы высокого давления. Излучение этих ламп более интенсивно, чем ксеноновых, но они имеют линейчатый спектр.
Обычно необходимо бывает выбрать ту длину волны, которая нужна для данного флуорофора, а не наоборот. Следовательно, такие лампы годятся только в том случае, если ртутные линии имеют подходящую длину волны для возбуждения данного флуорофора [10]. Ртутно-ксеноновые дуговые лампы имеют более высокие интенсивности излучения в ультрафиолетовой области, чем ксеноновые лампы, а присутствие Хе приводит к более широкому спектральному выходу. Однако распределение интенсивности не такое плавное, как у ксеноновых ламп (рис. 1.3). Ртутные лампы низкого давления дают очень узкие линии спектра ртути, которые используются главным образом для целей градуировки [10]. Поскольку источники вышеприведенного вида обладают сплошными спектрами излучения, для выбора излучения необходимой частоты, задаваемого спецификой задачи, вырезают всю остальную часть излучения источников с помощью монохроматора, который называется монохроматором возбуждения [9]. При этом, конечно, относительная интенсивность возбуждающего излучения будет мала по сравнению с мощностью источника. Но существует другой тип источников излучения, обладающих высокой спектральной мощностью и монохроматичностью, называемых лазерами. При возбуждении такими средствами можно достигнуть не только большой чувствительности, но и стабильности измеряемых при этом характеристик флуоресценции, а в исследовании газообразных веществ также высокой селективности. Появление лазеров открыло расширенные возможности флуоресцентных методов в науке, промышленности, медицине и технике [12,13]. Для регистрации флуоресценции и измерения ее характеристик существуют несколько схем, в основе которых лежит оптическая обработка светового отклика вещества и детектирование получаемого обработанного оптического сигнала. Чаще всего необходимо измерить как спектры возбуждения, так и спектры испускания. Спектр испускания представляет собой зависимость интенсивности испускания от длины волны при фиксированной длине волны возбуждающего света. Для измерения анизотропии флуоресценции на пути возбуждающего и испускаемого световых потоков ставят поляризаторы. Для точного измерения анизотропии флуоресценции требуется расположение поляризаторов под определенным углом, поэтому оправы поляризаторов должны быть хорошо закреплены и тщательно проградуированы. Оптический модуль может иметь дополнительный оптический путь в стороне от держателя образца. С его помощью можно проводить измерения анизотропии флуоресценции двухканальным методом, более точным, чем одноканальный метод, в котором этот дополнительный оптический канал не требуется [11]. Появление импульсных лазерных источников расширило методы регистрации такой характеристики флуоресценции, как ее кинетика. Использование пикосекундных и фемтосекундных лазеров, имеющих короткие длительности импульсов, в сочетании быстродействующими оптическими затворами позволяет регистрировать временные зависимости флоуресценции многих органических флуорофоров. Такие измерения проводят для исследования динамики молекулярных процессов и химических реакций, а также для анализа вещества с большей специфичностью[13,14,15]. При использовании сильнофокусированных пучков света для возбуждения флуоресценции становится возможным применение метода флуоресцентной коррелометрии. Он основывается на принципе регистрации самокоррелированности флуоресцентного сигнала вследствие флуктуации плотности оптически задействованных молекул внутри пучка. Такой метод позволяет с большой точностью определять концентрацию вещества в растворе и специфику [16,17,18].
Для биофизических и медицинских исследований и других областей исследования и диагностики применяют в основном спектрофлуоресцентный метод при возбуждении биологического субстрата лазерным излучением. Сигнал регистрирут при помощи полихроматора, соединенного с многоканальной ПЗС - линейкой, оцифровывают и подают на вход компьютера, который обрабатывает результаты измерений. Для удобства при эндокавитарных исследованиях возбуждающее излучение и флуоресцентный сигнал подводят к исследуемому участку через оптоволокно [19,20]. В большинстве практических задач биомедицинских исследований применение флуоресцентного метода требует наличия специфических флуоресцирующих веществ, вводимых в исследуемый материал в качестве зондов и маркеров. Такой подход сопряжен с дополнительными расходами и не является универсальным вследствие необходимости постоянной разработки флуоресцентных материалов для расширения области применения такой диагностики. Напротив, детектирование и спектральный анализ флуоресценции природных флуорофоров используется сравнительно узкоспециализированно, хотя сами методики на основе этого являются более универсальными и менее затратными и трудоемкими [46]. Получаемый сигнал во всех измерительных системах для осмысления несомой им информации требует наличия специфических методов его обработки и экспертной системы прогнозирования и диагностики на результатах информационного преобразования. При этом получаемый в результате измерений сигнал должен быть тоже хорошего качества. Эти качества задаются такими параметрами измерительных установок, как чувствительность (минимальная концентрация определяемых веществ), воспроизводимость (повторение сигналов в хорошем качестве от измерения к измерению), объективность (насколько производимый на основе получаемого сигнала анализ соответствует действительности). По сравнению с другими методами анализа, такими как бактериологический, флуориметрический, например реализуемый на аппарате «Спектролюкс МБ», уступает в чувствительности (102 против 10б КОЕ (колониеобразующие единицы)/мл), однако намного превосходит по скорости (несколько недель против минут) и объективности (не всегда удается высевать материал бактериологическим методом).
Диагностика объектов микробной природы, состояние проблемы и возможные пути ее решения на основе ЛФД
Многие изменения патологического характера в организме человека происходят под влиянием микробного фактора. В норме организм человека находится под минимальным действием субстратопроцессных механизмов многих микроорганизмов, большинство из которых являются перманентными обитателями человека в непатогенной форме. Часть микробной флоры человека под влиянием некоторых неблагоприятных условий может переходить из непатогенной в патогенную форму и вызывать заболевания. В зависимости от способности к симбиозу и специфичных адаптационных механизмов различные виды микробов подвергнуты определенной классификации, и диагностические критерии по отдельным видам могут изменяться [65]. С современных позиций микрофлору человека рассматривают как совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающим многочисленные экологические ниши на коже и слизистых оболочках полостей макроорганизма [66,67]. Большинство авторов считают, что нормальная микрофлора сформировалась в процессе эволюции в результате взаимодействия между макроорганизмом и окружающими микробами, отбора определенных видов, способных к прикреплению и колонизации кожи и слизистых оболочек. Причем эволюция макро- и микроорганизмов проходила параллельно и в тесной взаимосвязи друг с другом [68,69]. Среди микроорганизмов, занимающих различные экониши в организме человека, исследователи выделяют группы патогенных, условно-патогенных и симбиотных непатогенных микробов. Патогенные микроорганизмы характеризуются выраженной агрессивностью и способностью защищаться от действия неспецифичных защитных механизмов при попадании в макроорганизм. Условно-патогенные микроорганизмы характеризуются менее выраженной агрессивностью, ограниченной возможностью к колонизации макроорганизма, персистенции и распространению и лишь в условиях ослабления системы антиинфекционной резистентности проявляют свои вирулентные свойства. Группа симбиотных непатогенных микробов использует организм хозяина как среду обитания. Среди этой группы имеются комменсалы - микроорганизмы, живущие за счет макроорганизма и неприносящие ему вреда, и синергисты - микроорганизмы, участвующие в формировании эубиоза [70,71,72].
Установлено, что нормальная микрофлора включает в себя десятки и сотни разнообразных видов, численность которых у взрослого человека составляет 1014 клеток, что на порядок превышает число клеток всех органов и тканей макроорганизма [73]. Известно, что качественный видовой и количественный состав микрофлоры зависит от ее локализации. Наиболее сложные по составу микробиоценозы - это микрофлора толстой кишки рта и носоглотки [74,75]. Совокупность всех микробиоценозов макроорганизма обозначается как нормобиоценоз или эубиоз, а также микробная экология. Микроэкология характеризует не только качественное и количественное состояние микробной флоры различных частей макроорганизма, но также и их биохимическое, метаболическое и иммунологичесоке состояние. Считается, что количество характеристических видов относительно невелико, но численно они всегда представлены наиболее обильно [69,71,76]. Многочисленными исследованиями установлено, что микроорганизмы, присутствующие в организме хозяина, находятся между собой в разнообразных отношениях (нейтрализм, конкуренция, мутализм, синергизм, комменсализм, паразитизм и т. д.). Благодаря наличию сложной и разветленной системы кооперации между населяющими макроорганизм популяциями, микроэкологическая система человека выступает как единое целое, согласованно работающее в интересах всей системы и организма человека, в которой она локализована [74,76,77,78]. В медицинской клинической диагностике инфекционных заболеваний микробной природы существует проблема быстрой идентификации патогенной микрофлоры с выяснением ведущего патогена и его микробиологических ассоциантов. Для изучения микрофлоры в норме и при патологии в настоящее время разработано большое количество прямых и косвенных методов и приемов: микроскопия, определение состава микробиоценоза путем высева проб на соответствующие среды, изучение микробных метаболитов, присутствующих в биоматериале. На сегодняшний день основным, широко применяемым в практической работе учреждений, лабораторным методом диагностики заболеваний микробной этиологии является классический бактериологический метод. Он заключается в посеве клинического патологического материала на искусственные питательные среды с целью выявления и идентификации чистых культур возбудителя (или возбудителей) и определения их чувствительности к антибактериальным и химикотерапевтическим препаратам. При исследовании клинического материала больных с гнойными заболеваниями, проводится выделение и идентификация всех микроорганизмов, находящихся в патологическом материале с целью определения этиологической значимости каждого микроба, при этом поиск сужается до определенного возбудителя [79,5,80,81]. Эффективность бактериологического метода является невысокой вследствие большой длительности срока транспортировки материала для его посева, что приводит к гибели одних видов микробов и размножению других; из-за большой длительности культивирования высеянных микробных популяций результат диагностики может попросту потерять свою актуальность, поскольку для микрофлоры пациента это достаточно большой срок для вероятной трансформации микробиоценоза пациента в иную по видовому составу форму. Кроме того, значительные трудности для высева и выделения бактериологическим методом вызывает анаэробная флора, частота встречаемости которой при гнойных инфекциях составляет от 25% до 100%. Лабораториям практического здравоохранения последний вид исследования является экономически недоступным.
Существуют и другие, более быстрые, лабораторные методы исследования микрофлоры человека и животных. К ним относятся газожидкостная и ионная хроматография, хромато-масс-спектрометрический анализ, высоковольтный электрофорез. Метод газо-жидкостной хроматографии позволяет косвенно выявлять аэробную и анаэробную микрофлору методом регистрации пиков летучих жирных кислот и других микробных метаболитов. Несмотря на достаточную оперативность, этот метод не получил широкого распространения из-за отсутствия однозначного подхода в оценке результатов исследований, а также из-за необходимости использования специального очень дорогого оборудования. Для проведения этих исследований необходимо приготовление исследуемых образцов специальными химическими методами [82,83,84]. Хромато — масс — спектрометрический анализ — это метод диагностики дисбиоза и воспалительных процессов в организме человека по составу специфических микробных веществ - маркеров класса жирных кислот и стеаринов, а также других липидных компонентов клетки и метаболитов жизнедеятельности микроорганизмов. Преимущества и недостатки хромато — масс — спектрометрического анализа и газо- жидкостной хроматографии одинаковы и по тем же критериям это вызывает трудности в их использовании в практической клинической диагностике. Современное состояние лабораторной и клинической диагностики микробных инфекций может быть улучшено при постоянном поиске и нахождении новых сравнительно простых, дешевых и информативных экспресс методов индикации микроорганизмов, а также мониторинга состояния микрофлоры человека и продуктов ее жизнедеятельности в клинической практике, лишенных вышеперечисленных недостатков микробиологического и других методов исследования, что оправдано и в некоторых случаях необходимо. Поскольку все микробы обладают заметной эндогенной флуоресценцией, существует принципиальная возможность индикации и идентификации субстратов, населенных микробами. В работе [65] показано присутствие изначальной специфичности флуоресцентных показателей отдельных нативных микробов в чистых культурах.
Восстановление корректных спектров с учетом характеристик оптической экстинкции вещества
Спектры флуоресценции для различных видов микробов имеют много схожих черт и отличия в них проявляются в относительно слабых отклонениях хода спектральных кривых между собой на различных участках спектральных длин волн. Поэтому даже небольшие искажения снимаемых данных, вызванные аппаратными артефактами либо возмущениями люминесцентных свойств самого вещества в силу тех или иных явлений должны заметно влиять на результаты диагностики. Одним из возможных источников систематических погрешностей является рассеяние и поглощение флуоресцентного и лазерного излучений в самом веществе образца. Среда обладает свойством поглощать и рассеивать распространяющееся в ней излучение в силу присутствия хромофоров и оптически крупных частиц. Геометрия возбуждения для простоты представлена поднесенным на расстоянии d торцом оптоволоконного кабеля к плоской границе среды. Интенсивность флуоресцентного сигнала, который собирается с входного окна оптоволокна, равна интегралу по объему образца от произведения объемного спектрального коэффициента преобразования в флуоресценцию на интенсивность возбуждающего излучения и угловую видимость входного окна световода из произвольной точки с учетом пути, пройденного испущенным в этой точке среды пучком фотонов внутри среды, испытывающим ослабление (рис. 2.8). Приближенно формулу для зависимости показаний спектрального датчика от параметров среды и лазерного источника можно написать в таком виде Где Іфлс( ) _ значения спектральных интенсивностей на выходе спектрального датчика в относительных единицах, а ( г, 0, ф, X) - коэффициент, пропорциональный спектральной эффективности преобразования возбуждающего излучения, Q.+( 0, ф) - угловой коэффициент, показывающий долю мощности возбуждающего излучения в единице телесного угла в направлении (0, ф), П.( 0, ф) - угловой коэффициент, равный телесному углу видимости входного окна сигнального световода из точки среды с координатами ( г, 0, ф), (3(А,) - спектральный показатель экстинкции, Хп - длина волны лазерного источника. Интеграл в (12) берется по всему объему кюветы. Для того чтобы учесть поправку на свойства среды нужно найти функцию множителя, учитывающего влияние однородного по объему показателя экстинкции (или пропускания) на спектр. Этот множитель равен обратной дроби от интеграла перед коэффициентом а, возникающего после вывода а из под знака интеграла.
При этом считаем, что а не зависит от координат в пространстве кюветы. В приближении линейной зависимости получаем: где L — длина оптического пути в кювете. Приведенная формула была просчитана для вещества, занимающего бесконечную полуплоскость (справа на рисунке). Для произвольного образца с иной геометрией формула имеет более общий вид Где коэффициенты аі и а2 определяются формой кюветы и расстоянием от оптоволокна. Заключение В предварительных данных показана возможность видовой диагностики для микроорганизмов в чистых культурах методом ЛФД. Но при этом возникают трудности с интерпретацией спектров традиционными методами, особенно если микроорганизмы представлены в смесях разных видов. Экспериментально видна скрытая специфичность спектров флуоресценции различных организмов, что проявляется в различиях между формами соответствующих спектральных кривых. Показано, что для возможности анализа спектральных данных необходимо и достаточно иметь изначальную базу данных, являющуюся объектом сравнения (контроль). А результаты исследования смесей видов микроорганизмов обрабатывают программным обеспечением на основе реализации регрессии на главные компоненты, что приводит к дифференциальной диагностике. Предположена обоснованная гипотеза о возможности улучшения диагностических качеств спектральных данных при корректировке с учетом спектров оптической экстинкции сред. Обоснована и предложена методика применения детергентов для повышения интенсивности флуоресценции и чувствительности ЛФД. Многомерный регрессионный метод построения вычислительной модели концентраций микроорганизмов применен для исследования специфичности и составления действующей модели определения концентраций микроорганизмов из группы микобактерий и двух немикробактериозных видов микроорганизмов по анализу цифровых спектров флуоресценции суспензий содержащих комбинации данных видов. На основе развитой вычислительной модели с учетом коррекции спектров флуоресценции на оптические характеристики среды микроорганизмов повышена эффективность метода дифференциальной флуоресцентной диагностики. Окончательное определение видового состава или классификации микроорганизмов в диагностируемых жидких системах может происходить путем проведения регрессии диагностических входных данных полученных методами лазерной флуоресцентной спектроскопии на определяемые параметры. Как было показано в предыдущей главе, для этого необходимо иметь диагностические данные некоторого достаточно большого эталонного набора образцов. Также необходимы данные, которые полностью отражают их спектральные характеристики флуоресценции и диагностируемые параметры. Для видовой идентификации и дифференциации видов различных микроорганизмов таким набором будут служить суспензии определяемых видов микроорганизмов в различных сочетаниях в смеси с известными концентрационными мерами по видам.
Такие вычисления для определения, конечно, всегда подвержены влиянию шумов прибора и систематических ошибок и поэтому определяемые концентрационные меры имеют доверительный интервал, задающий ограничение на минимальную определяемую концентрацию, выше которой можно делать надежные выводы. Для проведения исследований специфичности флуоресценции микроорганизмов из группы микобактерий были определены энергетические и концентрационные параметры лазерно-индуцированной флуоресценции. Определение концентрационных зависимостей выхода флуоресценции является важным этапом в работе по набору эталонных образцов, поскольку различные виды микроорганизмов действительно обладают разными удельными коэффициентами светимости. Для одних видов для достоверной индикации достаточна концентрация, к примеру, 107 КОЕ/мл, в то время как для других видов этот порог выше на порядок и больше. Микобактерий являются микроорганизмами, наиболее часто встречающимися при заболеваниях легкими и тяжелыми формами туберкулеза, а также при заболеваниях, так называемых микобактериозов, которые внешне могут легко быть похожими на туберкулез. После определения концентрационных порогов обнаружения образцы для эталонного набора должны быть составлены в виде суспензий с чистыми культурами каждого диагностируемого вида и в виде смесей, в которые могут входить в качестве компонент микроорганизмы двух, трех или еще нескольких видов. При этом приготовленные суспензии должны быть заключены в одинаковые стандартизованные пробирки, с помощью которых можно измерять флуоресценцию. Всего для создания базы данных и составления программного обеспечения дифференциальной диагностики было взято 19 видов микроорганизмов, в число которых входили 17 микобактерий и 2 распространенные немикобактериозные бактерии: Мус. avium, Myc.vaccae, Myc.tuberculosis, Myc.intracellularia, Myc.kansasii, Myc.fortuitum, Myc.gordone, Myc.szhulgaie, Myc.chelone, Myc.xenopi, Myc.bovis, Myc.scrofulaceum, Myc.smegmatis, Myc.marinum, Myc.flavescence, Myc.malmaence, Myc.simaie, Staf. aureus, E. coli. Суспензии в чистых культурах приготовляли разведением колоний, выращенных на питательной среде, в физрастворе в концентрациях от 10 до 5-10 КОЕ/мл. Измерением флуоресценции образцов с чистыми культурами микроорганизмов были обнаружены следующие особенности. Виды Myc.tuberculosis, Myc.fortuitum, Myc.chelone, Мус xenopi, Myc.bovis, Myc.scrofulaceum, Myc.smegmatis, Staf. aureus, и E. Coli обладают высокой удельной флуоресцентной светимостью. У всех остальных видов этот показатель в 2-3 раза меньше, кроме микроорганимзмов, обладающих малым уровнем флуоресценции на единицу концентрации: Myc.gordone, Myc.szhulgaie. Также приготовлены суспензии содержащие смеси различных видов по 2, 3 и более на одну смесь. Всего собрано 108 образцов суспензий, для которых измерены спектральные флуоресцентные характеристики.
Анализ специфичности флуоресценции микобактерий при их обработке с использованием мирамистина
С целью повышения концентрационного уровня регистрации микобактериальных клеток в искусственных было рассмотрено влияние детергента мирамистина на флуоресцентные показатели, а также изучены информационные ценности получаемой в результате измерений спектров базы данных. При этом спектры флуоресценции снимались с разными промежутками времени после добавления препарата в образцы: через час, через день и через 2 дня. По всем спектральным характеристикам составлялись программные модели для распознавания видов 79 микроорганизмов в суспензиях, как с чистыми культурами, так и с микс-системами и вычисления концентраций соответствующих видов. При измерении флуоресценции в пределах часа после добавления детергента изменение удельной интенсивности под влиянием детергента происходит незначительно, примерно на 20%. Составлением адаптированной к образцам часовой экспозиции детергента программы подсчета видовых концентраций была достигнута общая 80% эффективность распознавания видового состава суспензий. Все данные вычислений по образцам с чистыми культурами и микс-системами представлены на рисунке 4.7. На этом рисунке представлены 3 графика вычисленных концентраций по отдельным видам. Первые графики соответствуют данным, измеренным после часа добавления детергента «мирамистин» в образцы. На них по горизонтали отложены номера образцов, а по вертикали - значения видовой концентрации для этих образцов. Образцы с номерами с 1 по 9 являются суспензиями с чистыми культурами, а с номерами с 10 по 24 - ассоциациями нескольких микроорганизмов. На этих графиках стрелками обозначены образцы, в которых вид микроорганизма присутствовал в качестве компоненты или присутствовал только он один. По этим графикам видна относительно хорошая специфичность флуоресценции суспензий после часа от добавления детергента. Было обнаружено, что детергент приводит к заметному увеличению удельной интенсивности флуоресценции бактериальной массы примерно через сутки после добавления в суспензии. При этом эффективность при спецификационной обработке спектральных данных составляет 82%. Все данные вычислений по образцам с чистыми культурами и микст-системами представлены на рисунке 4.7 на вторых графиках по видам. На них представленые образцы с номерами с 1 по 13 являются суспензиями с чистыми культурами, а с номерами с 14 по 20 - ассоциациями нескольких микроорганизмов.
На этих графиках стрелками обозначены образцы (по соответствующим номерам образцов стрелки поставлены на третьих графиках), в которых вид микроорганизма присутствовал в качестве компоненты или присутствовал только он один. По этим графикам видна относительно хорошая специфичность флуоресценции суспензий после дня от добавления детергента. Измеренные после двухдневной выдержки в детергенте спектрофлуоресцентные характеристики позволили вычислять видовой состав суспензий с точностью 85%. По сравнению с удельной интенсивностью флуоресценции односуточной экспозиции увеличение данной величины на второй день составляет от 150% до 200% приблизительно. Данные вычислений по образцам с чистыми культурами и микс-системами представлены на рисунке 4.7 на вторых графиках по видам. На них представленные образцы с номерами с 1 по 13 являются суспензиями с чистыми культурами, а с номерами с 14 по 27 — ассоциациями нескольких микроорганизмов. На этих графиках стрелками обозначены образцы, в которых вид микроорганизма присутствовал в качестве компоненты или присутствовал только он один. По этим графикам видна хорошая специфичность флуоресценции суспензий после двух дней от добавления детергента. Эффективность определения видового состава неодинакова, если рассматривать ее отдельно по видам микроорганизмов, присутствовавших в выборке видового разнообразия исследуемой биологической системы. К примеру, как будет показано ниже, определение вида Мус. tuberculosis(h37Rv) осуществляется хорошо (80%). Но есть и виды, для которых, процент совпадений ниже (60% для Мус. fortuitum). Данное обстоятельство, возможно, объясняется химическим действием детергента на флуорофоры клеток, вследствие чего некоторые виды становятся плохо различимыми друг от друга по измерениям ЛФД. Для подтверждения этого необходимо произвести большое количество испытаний, которое невозможно реализовать без клинических измерений. Рис. 4.7 Здесь приводятся результаты вычислений концентраций по отдельным видам в трех вариантах реализации модернизированной программы специфического анализа суспензий. Программа реализовывалась в двух вариантах: в первом варианте использовались только данные одночасовой экспозиции детергента на бактерии, во втором варианте — через два дня после добавление детергента. По каждому виду приведены три графика. Все первые графики соответствуют данным измеренным, через час, все вторые — после двух дней. Приведенные графические данные означают концентрации вида (величина по вертикальной оси) в разных образцах (номер по горизонтальной оси). На графиках образцы с номерами с 1 по 9 являются суспензиями с чистыми культурами, а с номерами с 10 по 24 -ассоциациями нескольких микроорганизмов, 25 - контрольный. Образцы, в которых присутствовал данный вид, обозначены стрелками. По всем видам микобактерий приводятся статистические параметры дифференциальной лазерной флуоресцентной диагностики.
Для графиков без стрелок номера образцов соответствуют номерам на третьем графике. Всего исследовано 28 образцов. Применения детергента мирамистин в лазерной флуоресцентной диагностике позволяет проводить идентификацию видов микобактерий в суспензиях с удовлетворительной точностью и высокой, по сравнению с обычной ЛФД, чувствительностью. Для разных времен экспозиции средние эффективности распознавания составляют (на основе проведенных вычислений по 28 образцам): 1 ч - 81%, 2 сут. - 87%. Была выявлена максимально эффективная концентрация мирамистина (2.5%) для использования в диагностике и исследованы временные закономерности действия детергента на суспензии микроорганизмов. Также проведены исследования с другими видами детергентов, что показало предпочтительность детергента «мирамистин». Повышена чувствительность ЛФД микроорганизмов в суспензиях с 10 до 108 в среднем. По результатам дифференциальной диагностики можно утверждать, что эффективность дифференциоации туберкулезных микобактерий от нетуберкулезных может быть достигнута 82% на основании лазерной спектрально-флуоресцентной диагностики. Исследованы спектры лазерно-индуцированной флуоресценции образцов плазмы крови пациентов с заболеваниями различной микробной этиологии, полученные с помощью экспериментального лазерно-волоконного многоканального анализатора "Спектролюкс МБ". Реализована процедура статистической обработки накопленного банка данных лазерно-флуоресцентной спектроскопии методом анализа главных компонент. Представлены результаты измерений для обучающей и контрольно-тестовой групп, показывающие целесообразность использования гибридной диагностики для обнаружения и классификации патологий с приемлемым для практики уровнем статистической значимости. 5.1 Схема распознавания и классификации микробов болезни. Поскольку для клиницистов необходим метод диагностики, позволяющий максимально в короткие сроки и просто поставить диагноз, была исследована возможность обнаружения заболевания туберкулезом путем измерения лазерно-индуцированной флуоресценции плазмы крови, поскольку данный материал часто используется в лабораторной диагностике и может быть легко приготовлен. Подобная методика призвана дополнить ЛФД анализ микробосодержащих проб и тем самым способствовать увеличению объективности диагноза. Для этого применили анализ главных компонент к спектральным данным флуоресценции плазмы крови при возбуждении лазером на длине волны 533 нм. Метод ЛФД в клинической практике экспрессного обнаружения заболеваний патогенными микроорганизмами был предложен в [59].
