Введение к работе
Актуальность темы
Быстрое развитие лазерной техники в последние десятилетия повлекло за собой появление множества направлений в химии, биологии и медицине, в которых методы, лазерной физики незаменимы для решения широкого круга исследовательских и тгоикладных задач. Одним из таких направлений является лазерная спектроскопия биологических макромолекул. Исследование быстрой конформационной динамики белков является одной из важнейших задач при изучении биологических молекул, поскольку их функциональная активность, по-видимому, тесно связана с конформационньми изменениями Это обстоятельство является следствием определенной внутримолекулярной организации белков, отличающей их от случайной конфигурации атомов, подчиняющейся только статистическим закономерностям.
Биомолекулы являются сложными колебательными системами, функционально направленные конформациошгые перестройки в которых можно уподобить работе механизма или машины, где взаимное перемещение отдельных частей носит направленный характер. Характерные времена многих важных внутримолекулярных превращений белковых молекул лежат в субнаїгосєкундном диапазоне. Методы лазерной спектроскопии и использование сверхкоротких лазерных импульсов позволяют получить непосредственную информацию о такого рода вігутримолекулярной подвижности биомолекул.
В природшігх системах внутримолекулярные процессы происходят случайным образом. Разфазировка между отдельными молекулами в ансамбле приводит к тому, что при попытке зарегистрировать конформапионную динамику мы будем наблюдать усредненную по всем молекулам ансамбля картшгу. Использование импульсных лазерных источников позволяет индуцировать сихронизированные конформационные изменения всех молекул в исследуемом образце и отслеживать динамику изменений в реальном времени. Кроме того, перевод значительной части молекул исследуемого образца в неравновесное состояние невозможен без использования световых потоков высокой интенсивности. Хорошо известно, что только лазерные системы способны обеспечить высокий уровень интенсивности в сочетании с малой средней мощностью. Последнее критично для исследования биообъектов, поскольку все они отличаются высокой чувствительностью к изменениям температуры.
Лазерная флуоресцентная спектроскопия с временным разрешением является одним из самых информативных методов исследования конформационной динамики белков. Основными преимуществами метода при исследовании биологических систем являются его высокая чувствительность, недеструктивное воздействие (сохранение нативности образца во время измерений), селективность возбуждения, а также возможность применения в сильно рассеивающих средах. Присутствие в составе
большинства белков по' крайней мере одного триптофанового остатка, индольное кольцо которого является чрезвьлайно чувствительным хромофором, делает возможным исследование разлйчиых конформадий белка и регистрацию изменения его структуры при связывании с лигандами. Измерение время-'разрешенньгх спектров флуоресценции (спектрохронография) позволяет получить дополнителыгую более детальную информацию об объекте исследования.
Спектроскопия наведенного поглощения является эффективным методом изучения возбужденных состояний молекул, а именно определения структуры энергетических уровней, каналов передачи и релаксации энергии возбуждения, изменения конформации молекул при переходе в возбужденное состояние и т д
Существуют две природные системы, в которых процессы перераспределения энергии :>н конформационные изменения шцгуцируются квантом света -фотосшггетическая система и система зрения. Это обстоятельство обусловило широкое применение лазерных методов для изучения первичных процессов фотосинтеза и зрения. Биолюминесцентная система светляка, возможно, также является одной из немногих биологических систем, в которых конформационные изменения штудируются при помощи кванта света. Ключевую роль в фуіікциоїшроваїїии биолюминесцентной системы играет переход в электронно-возбужденное состояние одного из ее компонентов' за счет химической реакции окисления. Можно предположить, что такой переход при поглощении кванта света сопровождается теми же конформационными изменениями в системе, что и возбуждение в ходе химической реакции. Это означает, что посредством световых импульсов мы можем индуцировать процессы, происходящие в естественной биолюминесцентной системе случайным образом, обеспечивая тем самым их синхроїшзацию.
Биолюминесцентная система люцифераза-люциферин находит широкое ітрименение в медицине, биохимии, микробиологии для контроля различных биологических процессов. Белок-фермент люцифераза, кроме того, является одним из самых высокоэффективных природных преобразователей энергии химической реакции в свет. В связи с этим изучение люциферазы представляет большой практический интерес. Несмотря на то, что исследование биошоминесцентной системы началось несколько десятилетий назад, многие вопросы, касающиеся ее фушщионирования, все еще остаются открытыми. Использование сверхкоротких лазерных импульсов для фотовозбуждения субстрата и регистрации фотоиїїдуцированньгх конформационных изменений бимолекулярной системы люцифераза-люциферин предоставляет уникальную возможность получения информации о динамике изменения структуры белковой глобулы и функционироваїїии биолюминесцентной системы в реальном времени.
Цели и задачи диссертационной работы
Целью диссертационной работы является разработка методики лазерной флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением, предназначенной для исследования конформанионной динамики белковых молекул, тгдуцируемой короткими лазерными импульсами, а также исследование фотоиндуцированиых конформационных изменений биолюминесцентной системы лкищфераза-люциферин в реальном времени методами флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии.
В диссертационной работе решаются следующие задачи:
-
Разработка методики и создание экспериментальной установки для исследования бимолекулярной системы посредством фотовозбуждения одного из компонентов,и измерения спектрально-временных зависимостей интенсивности флуоресценции другого компонента. ' - -
-
Сравнительное исследование внутримолекулярной динамики' двух видов шоцифераз - Luciola mingrelica, содержащей единственный триптофановый остаток, и Photinus pyralis, содержащей два триптофановых остатка, методом флуоресцентной спектрохронографии. Оценка времени релаксации белковой матрицы'и степени подвижности микроокружения флуорофора.
-
Изучение механизмов тушения собственной триптофановой флуоресценции люциферазы при связывании с люциферином и АТФ с целью получения информации о характере и динамике изменения структуры белковой глобулы при взаимодействии с субстратами.
-
Исследование влияния микроокружения на флуоресцентные свойства люгщферина светляков и моделирования свойств микроокружения излучателя в биолюминесцентной реакции.
-
Исследование конформанионной динамики люциферина в возбужденном состоянии методом спектроскопии наведенного поглощения.
-
Экспериментальная проверка гипотезы о фотоиндуцированной диссоциации комплекса люцифераза-люцифершг Постановка и проведение эксперимента по схеме накачка-зондирование. Проведение теоретической оценки ожидаемой величины эффекта и оптимизация параметров установки.
Научная новизна
-
Разработавшая методика исследования бимолекулярной системы, основанная на фотовозбуждении одного из компонентов и измерении спектрально-временных зависимостей интенсивности флуоресценции другого компонента, впервые применена для оіфеделеїшя.фотоиндуївнроващтьіх конформационных изменений в биолюминесценшой СЯСТЄМЄ: ,
-
Использование метода флуоресцентной спектрохронографии позволило провести сравнительное исследование структурной динамики белковой матрицы различных видов шоцифераз и оценить время релаксации белковой матрицы Выявлены
механизмы уменьшения квантового выхода флуоресценции белка при связывании в комплекс с субстратами.
-
Проведена экспериментальная, проверка гипотезы. о фотоиндуцированной диссоциации комплекса люцифсраза-люциферин. Использованная в эксперименте система люцифераза-люциферин , не полностью идентична нативной биолюминесцентной, системе, |однако есть .основания полагать, что полученные результаты . свидетельствуют,, в ., пользу диссоциативного характера био люминесцентной реакции, ,. ; >.,.-.. <
-
Исследовано влияние микроохружения на флуоресцентные свойства люциферина. Оценена разность между дипольними моментами люциферина в основном и возбужденном состоянии Др, я , 30D. .Проведено исследовагше свойств возбужденного состояния, молекулы .люциферина.. Показано существоваїше в возбужденном состоянии двух форм люциферина с различными спектральными свойствами.
Практическая ценность
Созданная экспериментальная установка позволяет проводить исследования различных хромофоров биологической природы методами флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением и может быть использована для решения широкого круга задач в различных областях химии, биологии и медицины Инициирование конформациошюй динамики при помощи селективного лазерного возбуждения позволяет выявлять имеющие функциональное значение структурные изменения биологических макромолекул
Предложенные экспериментальные методики позволяют осуществлять диагностику биолюминесцентной системы дюциферин-люцифераза, находящей широкое практическое применение в медицине, биохимии, микробиология для определения содержания АТФ.
Защищаемые положения
-
Разработанная методика и экспериментальная установка, создаїшая для исследования бимолекулярной системы люцифераза-люциферин, позволяют осуществлять фотовозбуждение одного из компонентов системы и проводить измерите спектрально-временных зависимостей интенсивности флуоресценции второго компонента, что дает возможность регистрировать конформационные изменения структуры белка в реальном времени в наш- и субнаносекундном /діапазоне с временным разрешением 100 пс
-
Образование комплекса люциферазы с субстратами сопровождается уменьшением интенсивности, а в случае связывания с АТФ и изменением наблюдаемого времени жизни флуоресценции белка, обусловленными его структурной перестройкой.
Возможность таких изменений структуры белка подтверждается данными по спектрохронографии, указывающими на подвижность белковой матрицы.
-
Фотовозбуждение одного из компонентов бимолекулярной системы вызывает изменение оптических свойств другого компонента: импульсное фотовозбуждение субстрата (люциферииа) сопровождается разгоранием . (увеличением интенсивности) триптофановой флуоресценции фермента (люциферазы). Экспериментальные результаты качествеїшо согласуются с теоретической оценкой эффекта, что подтверждает гипотезу о ф'отоиндуцированиой диссоциации комплекса люцифераза-люциферин.
-
Переход в электронно-возбужденное состояние сопровождается конформационной перестройкой и изменением дипольного момента молекулы люциферина. Эти изменения предположительно являются причинами фотоиндуцироваштой диссоциации бимолекулярного комплекса люцифераза-люциферин.
Апробация работы и публикации
Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на следующих конференциях: I. VI Международная конференция "Применение лазеров в науках о жизни" - Laser
Application in Life Science, LALS'96 (Йена, Германия, 1996), 2.. XIII Междисциплинарная конференция по лазерным наукам - Interdisciplinary Laser
Science Conference (Лонг Бич, Калифорния 1997); 3. IV Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным
наукам "Ломоносов-98", Москва, Россия, 8-10 апреля 1998; Л. VII Международная конференция "Применение лазеров в науках о жизни" - Laser
Application in Life Science, LALS'98 (Братислава, Словакия, 1998);
-
XVI Международная конференция по когерентной и нелинейной,-, оптике ICONO'98, (Москва,' 1998);
-
II Съезд биофизиков России, (Москва, Россия, 1999);
-
VIII Европейская конференция по спектроскопии биологических молекул -European Conference on the Spectroscopy of Biological Molecules, ECSBM'99 (Энсхеде, Нидерланды, 1999)
-
Международная конференция молодых ученых и специалистов "Оптика-99", (Санкт-Петербург, 1999);
Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 12 работах, список которых приведен в конце автореферата.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, пяти глав и заключения. Работа изложена на страницах, включающих 51 рисунок, 4 таблицы и список литературы из 131 наименования.
