Введение к работе
Актуальность проблемы
Дыхательный белок гемоглобин осуществляет связывание молекулярного кислорода и легких и его транспорт в ткани организма. Гемоглобин представляет собой тетрамерныи белок, состоящий из двух типов субъсдикнц - 2-х а- и 2-х (5-itcneii. Каждая субьединнна содержит в качестве активного центра Fe-протопорфнрин-ІХ (гем), в кагором связывается молекулярный кослород. Гем находится в гидрофобной полости, которая образована близлежащими боковыми цепями аминокислотных остатков белка и называется гемовым карманом.. Молекула гемоглобина может находиться в двух стабильных состояниях — окснгеннрованном, когда по всех активных центрах связан молекулярный кислород, и дезоксигенированном, в котором ни один из активных центров не связал молекулу кислорода. Оксигеннроваїшая форма белка является фотолабилыюй, при поглощении кванта света происходит фотоднссопиация молекулярного кислорода. С диссоциацией конкурируют процессы безызлучателыюй дезактивации, приводящие к заселению низколежащих короткоживущнх состояний перенос-зарядовой природы, в силу чего квантовый выход фотодиссоциацин принципиально меньше I. Фотоднссоциация молекулы кислорода приводит к тому, что спектр поглощения гемоглобина в видимой области, обусловленный поглощением простетнческой группы — гема, становится существенно "отличным от спектра- поглощения белка в оксигенированном состоянии. Это позволяет применить для исследования гемоглобина методы кинетической абсорбционной спектроскопии. Кинетика изменения оптической плотности фотонндуцпровашюго поглощения отражает связывание гемоглобина с кислородом. Установлено, что взаимодействие молекулярного кислорода с простетнческой группой контролируется белковой частью молекулы гемоглобина (аллостерическля регуляция), однако природа этих процессов до сих пор во многом остается невыясненной. Причина заключается в большой сложности регуляторних процессов в белке, которые контролируют реакцию взаимодействия активного центра белка с молекулярным кислородом и протекают во временном диапазоне от сотен фемтосекунд до сотен микросекунд. Возможность их прямого исследования появилась сравнительно недавно, с развитием методов и техники спектроскопии с высоким временным разрешением.
Ко времени начала наших исследований-в 1992 г. в ліггературе приводились противоречивые сведения о величинах первичного у0 и кажущегося квантового выхода фотодиссоциации у, который пропорционален числу молекул кислорода, вышедших из белковой глобулы после акта фотодиссоциации, и практически не было исследовано их поведение при воздействии на белок различными аллостерическими эффекторами (Н+, СГ, органические фосфаты). Не была определена эффективность выхода а.-у/у0 молекулы кислорода из белковой
глобулы после фотодиссоциации. Наконец, не были исследованы динамика геминалыюй рекомбинации кислорода с гемоглобином и динамика аллостеричсской регуляции. Такая информация крайне необходима для понимания механизмов функционирования гемоглобина in vivo.
Это обусловило необходимость привлечения методов кинетической абсорбционной спектроскопии для систематического исследования динамики геминалыюй и бимолекулярной стадий рекомбинации гемоглобина с кислородом и влияния на них различных аллостерических эффекторов, а также влияния модификации белка и введения сорастворителей.
Связь с крупными научными программами, темами
Результаты, положенные в основу настоящей диссертационной работы были получены в рамках работ по проектам Фонда фундаментальных исследований Республики Беларусь "Механизм и динамика оксигенации гемоглобина" — 1992-1995 гг., N9 госрегистрации 5006, "Магнитные и спиновые эффекты в реакции оксигенации гемоглобина" — 1996-1997 гг., № госрегистрации 5572 и в рамках Республиканской программы фундаментальных исследований "Пикосекундная спектроскопия гембелков: гемоглобина и миоглобина" — 1991-1995 гг.
Цель и задачи исследования
Целив диссертационной работы является систематическое изучение методами абсорбционной спектроскопии с временным разрешением явления фотодиссоциации оксигемоглобина человека и динамики последующего взаимодействия белка с молекулярным кислородом; исследование динамики и установление механизма, процессов аллостерической регуляции сродства гемоглобина к кислороду; выяснение механизма влияния на сродство модификации белка и условий среды.
Для выполнения поставленной цели исследования требовалось решить следующие задоын:
— исследовать кинетики мономолекулярной геминальной и
бимолекулярной стадий связывания гемоглобина с кислородом и определить
величину кажущегося квантового выхода фотодиссоциации у в диапазоне рН от
4,0 до 11,0;
. — измерить первичный квантовый выход фотодиссоциации оксигемоглобина у0 при различных значениях величины рН раствора;
определить эффективность выхода а молекул кислорода из белка после акта фотодиссоциации;
изучить влияние органических фосфатов и ионов О" на кинетику связывания гемоглобина с кислородом;
изучить влияние этилового спирта как сорастворителя на кинетики, геминальной и бимолекулярной стадий связывания гемоглобина с кислородом;
— измерить кинетики связывания кислорода с гемоглобином,
модифицированным ковалеитиым присоединением пирицоксаль-5'-фосфата, а
также при добавлении в раствор 1-аннлинонафтален-8-сульфоната;
— изучить динамику связывания молекулярного кислорода изолированными
а- и (5-цепями гемоглобина, а также а- и р-цепями гемоглобина,
модифицированными пара-хлормеркурибензоатом, и сравнить результаты с
данными, полученными для тетрамерного белка.
Научная новизна работы
Впервые систематически исследована рН-зависимость кинетик-геминальной к бимолекулярной стадий связывания гемоглобина с кислородом в широком диапазоне рН для гемоглобина, находящегося в R-состоянии четвертичной структуры. Обнаружено, что рН—зависимости константы скорости бимолекулярной стадии ассоциации трилигокдированного гемоглобина с кислородом и кажущегося квантового выхода фотодиссоциации у в диапазоне рН>6,0 не являются монотонными и обнаруживают экстремум при рН=8,5.
Получено аналитическое выражение, описывающее кинетику геминальной рекомбинации кислорода с гемоглобином и изолированными а- и в-цепями во временном диапазоне до 1,65 не.
Экспериментально определена величина первичного квантового выхода фотодисс'оциации оксигемоглобина y0 и показано, что она не подвержена влиянию аллостерических эффекторов.
Показано, что эффективность выхода кислорода из белка в окружающую среду после акта фотодиссоциации а определяется фазой геминальной рекомбинации и аллостерическая регуляция сродства гемоглобина к кислороду носит динамический характер.
Показано, что влияние этанола на функциональные свойства молекулы гемоглобина обусловлено изменением объемной диэлектрической проницаемости раствора е и выражается в увеличении эффективности выхода молекул кислорода из белка, а наблюдаемое уменьшение константы скорости связывания трнлигяндированного гемоглобина с кислородом вызвано увеличением вязкости раствора, причем имеет место зависимость вида ~l/rfi-s.
Научная и практическая значимость работы
Полученные результаты углубляют существующие представления о динамике взаимодействий низкомолекулярных лигандов с белковыми макромолекулами, процессах аллостернческой регуляции функциональных свойств белковых систем и влиянии условий окружения белка на реакцию его взаимодействия с лигандами.
Результаты представляют интерес для специалистов, работающих в области спектроскопии межмолекуляриых взамодействий, фотохимии и фотофизики суирамолекулярных систем молекулярной электроники, ферментативной
кинетики, биофизики и биохимии. Полученные результаты дают важную информацию о механизме и динамике взаимодействия между нростетической группой белка и лигандом и могут быть использованы в исследованиях других фермент—субстратных реакций, а также при изучении процессов молекулярного узнавания. Результаты работы могут быть полезными при разработке новых лекарственных препаратов и методов диагностики, так как представляют собой систематическое описание динамики связывания гемоглобина с кислородом и влияния на реакцию связывания различных эффекторов и внешних условий.
Разработанные методики определения эффективности выхода молекул кислорода нз белка и константы скорости связывания применены в работах, выполненных совместно с Институтом охраны материнства и детства МЗ РБ и Международным институтом по радиоэкологии им. А.Д.Сахарова, которые были посвящены изучению свойств гемоглобина у людей, проживающих на территориях, загрязненных в результате аварии на ЧАЭС.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
— рН—зависимости константы, скорости бимолекулярной стадии
связывания трнлипшдированного гемоглобина с кислородом к'4 и кажущегося
квантового выхода фотодиссоциации у в диапазоне рН>6,0 не являются
монотонными и обнаруживают экстремум при рН=8,5, что свидетельствует о
различном влиянии концентрации протонов на взаимодействие гемоглобина с
кислородом на отдельных стадиях оксигенации белка.
— Кинетика изменения оптической плотности фотоиидуцированного
поглощения, соответствующая геминальнон рекомбинации молекулы кислорода с
гемоглобином и изолированными а- н р-цепямн во временном диапазоне до 1,65
не описывается суммой двух экспоненциальных функций Ajexp(-t/Tj) с
характеристическими временами 190 пс и 1,6 не и постоянной составляющей,
причем предэкспонеициальиые множители А„ А2 и постоянная составляющая Aj
различны для изолированнных цепей и тетрамерного белка и для последнего
подвержены влиянию аллостсрических эффекторов.
Величина первичного квантового выхода фотодиссоцнации у0 равна 0,23± 0,03 и не зависит от концентрации в растворе протонов Н+, ионов С1-, АТФ и АМФ, в то время как эффективность выхода молекулы кислорода нз белковой глобулы определяется концентрацией указанных аллостернческих эффекторов. Влияние эффекторов выражается в изменении доли молекул кислорода, связывающихся непосредственно из гемового кармана белка в ходе сверхбыстрой стадии геминальной рекомбинации (т=190 пс).
Увеличение величины кажущегося квантового выхода фотодиссоциации у в водно-спиртовых смесях вызывается уменьшением объемной диэлектрической проницаемости раствора є. В то же время первичный квантовый выход фотодиссоциации 70 от концентрации этанола не зависит.
Личный вклад соискателя
