Введение к работе
Актуальность темы.
Быстрое развитие лазерной техники за последние десятилетия повлекло за собой оявление множества смежных направлений в науке, в которых физика лазеров очетается с другими дисцишпшами, такими как химия, физика ядра, физика олупроводников и др. К числу таковых относятся, в частности, лазерная биофизика и азерная медицина. Уже сейчас лазеры активно примегототся в медицине в качестве очных и удобных операционных инструментов, а также в составе диагностических риборов. Так, в настоящих момент активно исследуются вопросы применения птической томографии, которая позволяет получать информацию о внутреннем строении тдельных частей тела человека без применения опасного рентгеновского излучения, 'азвитие метода фотодинамической терапии злокачествеїших опухолей повлекло за обой бурное развитие исследований с помощью методов оптической спектроскопии заимодействия фотосенсибилизаторов с клетками и тканями. В последнее время активно взвиваются методы диагностики различных заболеваний, основанные на )луорссцентной спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяшія, причем дагностика происходит непосредствешю in vivo. В биофизике появилось множество іабот, связанных с определением связи структуры биомолекул с их функционалышми войствами.
Одним из методов исследования биомолекул является спектроскопия омбинационного рассеяния света, предоставляющая информацию о структуре олебательных подуровней электронных состояний молекулы. Известно, что структура олебательных подуровней чувствительна к изменению конформации молекулы, вменению отдельных химических связей, а также к изменению микроокружения юлекулы.
Другим высокочувствительным и информативным методом исследования рганических молекул является флуоресцентная спектроскопия с временным іазрешением, предоставляющая информацию о структуре электронных уровней и іелаксации энергии электронного возбуждения. Благодаря высокой чувствительности ілуоресцентной спектроскопии оказывается возможным изучение структуры рганических молекул в возбужденных электронных состояниях не только в растворах, но [ непосредственно в биологических объектах. Это открывает широкие возможности для )луоресцентной диагностики биологически важных молекул в клетках, тканях и других юдельных системах.
Существенно расширяются возможности применения спектроскопических методов ілагодаря интенсивному развитию в последние годы техники лазерной микроскопии, вторая позволяет фокусировать излучение в предельно малые, дифракционно іграниченіше длиной волны света, размеры. Появление высокочувствительных [етекторов, таких как ПЗС-камеры, позволяет получать изображение объектов не только
"в свете" флуоресценции, но и "в свете" сигнала комбинациошюго рассеяния.
Несмотря на интенсивные исследования, проводимые в последние 10 лет, до сих пор не существует единого понимаїшя процессов, происходящих при фотодинамическом воздействии на опухоли. Так, остаются открытыми вопросы о мишенях, на которые воздействуют фотосепсибилизаторы, проблемы, связанные с изменением микроокружения при проникновении молекулы фотосенсибилизатора в клетку. Ведется также поиск новых, более эффеюивных фотосенсибилизаторов. Применение метода спектроскопии комбинационного рассеяния, в сочетании с флуоресцентной спектроскопией с временным разрешением, позволяет осуществить комплексный подход к изучению процессов взаимодействия молекул- фотосенсибилизаторов с живой клеткой.
Цель и задачи диссертационной работы
Целью диссертационной работы являлось развитие методов лазерной пикосекундной микрофлуоримстрии и лазерной микроспектроскопии комбинационного рассеяния для изучения взаимодействия сложных органических молекул в растворах, клетках и модельных биологических системах и создание адекватной экспериментальной техники.
В диссертационной работе решаются следующие задачи:
-
Создание многофункционального лазерного комплекса для исследования биологически важных молекул методами флуоресцентной спектроскопии с времешгьш разрешением и спектроскопии комбинационного рассеяния.
-
Исследование влияния микроокружения на молекулу фталоцианина в одиночной живой клетке и модельных системах при помощи флуоресцентной спектроскопии с пикосекундным временным разрешением.
-
Исследование распределения нефлуоресцирующих фталоциашшов в живой клетке методом построения изображений "в свете" сигнала комбинационного рассеяния.
-
Исследование влияния микроокружения на молекулу фталоцианина в живой клетке и модельных системах при помощи спектроскопии комбинационного рассеяния.
Научная новизна
Созданный многофункциональный лазерный комплекс позволяет исследовать биомолекулы на уровне одиночной живой клетки методами флуоресцентной спектроскопии с пикосекундным временным разрешением и спектроскопии комбинационного рассеяния. Применение различных методов в исследовании одного и того же объекта делает возможным получение принципиально новых результатов.
Измерено время жизни флуоресценции четырежды сульфированного фталоцианина алюминия в живой клетке и показано, что отличие его от времени жизни в растворе не может быть отнесено на счет изменения кислотности микроокружения.
Измерение спектров комбинационного рассеяния молекул фталоцианинов кобальта в водных растворах, модельных средах и в живой клетке показало влияние микроокружения на структуру молекулы фталоцианина.
Использование метода построения КР-изображений в сочетании с традиционными
іетодами флуоресцентных изображешта позволило определить локализацию и аслределение молекул фталоцианинов кобальта в живой клетке. Измерение КР-зображений при различных положений клетки на оптической оси микроскопа показало, то внутриклеточные структуры, в которых накапливается фталоцианин, распределены по сему объему клетки.
Практическая ценность
Полученные в настоящей диссертации результаты носят в основном прикладной арактер и могут быть использованы в различных областях химии, биологии и медицины, 'азвитый в работе подход, основанный на сочетании методов флуоресцентной пектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния при применении [икроскопической техники открывает новые методические возможности использования азерной спектроскопии для решения широкого круга задач фотохимии и фотобиологии, їзмеряя время жизни флуоресценции и спектры комбинациошюго рассеяния можно олучать информацию о структурных изменениях органических молекул на уровне диночпой живой клетки, а также распределению молекул в клетке.
Практическая ценность выполненной работы состоит в экспериментальной еализации многофункционального лазерного комплекса, основанного на лазере на расителе, работающего в режимах синхронной накачки или в непрерывном режиме, вух системах регистрации: системе время-коррелированного счета фотонов и системе с ысоким спектральным разрешением, а также конфокального микроскопа, позволяющего роводить исследования биомолекул с высоким пространственным разрешением гетодаии флуоресцентной спектроскопии с пикосекундным времешіьім разрешением и пектроскопии комбинационного рассеяния.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Созданный многофункциональный лазерный комплекс позволяет проводить
сследования биомолекул, в частности фотосенсибилизаторов, применяемых в
ютодинамической терапии рака, методами флуоресцентной спектроскопии с
икосекундным временным разрешением и спектроскопии комбинационного рассеяния в
тдельной живой клетке при сохранении жизнеспособности исследуемого объекта.
2. Числишые оценки пространственного разрешения оптической схемы
онфокального микроскопа полученные на основе теоретического расчета, оптимизация
птической схемы. Результаты расчетов совпадают с экспериментальными данными.
3. Время жизни флуоресценции четырежды сульфированного фталоцианина
люминия в водном растворе не зависит от кислотности раствора. Время жизни
ьтуоресцеиции четырежды сульфированного фталоцианина алюминия в живой клетке
тличается от времени жизни флуоресценции в водном растворе и растворе с альбумином,
то объясняется специфическим взаимодействием с микроокружением.
4. По спектрам комбинационного рассеяния установлено, что при проникновении
ггалоцианинов кобальта в клетку происходить изменение структуры молекулы
фталощіанина. Данные изменения интерпретируются нами как изменение микроокружения молекулы фталощіанина кобальта в клетке.
5. Методом построения КР-изображений определена локализация нефлуоресцирующих фталоциашшов в одиночной живой клетке. Нефлуоресщіруїощие фталоцианины кобальта накапливаются в клетке в небольших структурах, распределенных по всему объему клетки, и локализуются в клетке в структурах эидоцитозного пути, таких как лизосомы, эндосомы и т.д.
Апробация работы и публикации
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на следующих конференциях:
-
Международной конференции "Фотодинамическая терапия рака ІГ (Лилль, Франция, 1994)!'
-
Международной конференции "Применение лазеров в науках о жизни" LALS'94 (Минск, Беларусь, 1994).
-
Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике КиНО'95 (Санкт-Петербург, 1995).
-
Международной конференции "Спектроскопия биологических молекул" (Лилль, Франция, 1995).
-
Международной конференции по спектроскопии комбинационного рассеяния ICORS'96 (Питтсбург, США, 1996).
-
Международной конференции "Применение лазеров в науках о жизни" LALS'96 (Йена, Германия, 1996).
Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 10 научных работах, список которых приведен в конце автореферата.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, четырех глав и заключения. Работа изложена на страницах, включающих 44 рисунков, 3 таблиц и список литературы из 180 наименований.
